專利名稱：人絨毛膜促性腺激素的純化方法及由這種方法純化的重組人絨毛膜促性腺激素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種絨毛膜促性腺激素(CG)的純化方法，具體地說，涉及從原始重組人絨毛膜促性腺激素樣本純化重組人絨毛膜促性腺激素的方法。該方法包括使用離子交換色譜法和反相高效液相色譜法。
這種激素是一種由以非共價鍵結(jié)合的α和β亞基組成的異二聚物。
它主要影響促性腺激素中的黃體生成激素。
在治療由于沒有促性腺激素或促性腺激素濃度過低而導(dǎo)致無排卵性不孕癥時，可給婦女施用絨毛膜促性腺激素誘導(dǎo)以促卵泡激素或人體絕經(jīng)期促性腺激素刺激卵泡的發(fā)育后排卵。通過肌肉注射施以5000至10000單位一次劑量以仿真正常刺激排卵的黃體生成激素的半峰值。對于體外受精作業(yè)以及其它包括超排卵和卵母細(xì)胞收集的助孕技術(shù)，也會將絨毛膜促性腺激素和月經(jīng)激素一起施用，有時還加上輔助劑枸櫞酸氯芪酚胺。絨毛膜促性腺激素業(yè)已用于治療男性青春前期的隱睪病。服用的方法有多種，但通常每周進(jìn)行三次肌肉注射，每次的劑量從500至4000單位。
絨毛膜促性腺激素也用于治療男性因促性腺激素不足性腺機(jī)能減退而導(dǎo)致不育的疾病。另外，服用的劑量也很不同，每周二次或三次，每次的劑量從500至4000單位。而且往往會加入一種具有促卵泡活性的藥劑，如月經(jīng)激素以產(chǎn)生正常精子。對于精子減少，每周可施以高達(dá)3000單位劑量的絨毛膜促性腺激素，配以月經(jīng)激素或另一種促卵泡制劑。在治療男性與性腺機(jī)能減退相關(guān)的滯后青春期時，每周施用二次500至1500單位的劑量；將劑量對血漿睪血激素濃度進(jìn)行滴定。
目前，從原尿液樣本分離和純化人絨毛膜促性腺激素可采用各種不同的方法[Birken等人，”Endocrinology”，133(3)1390-7頁，(1993)；Sakakibara等人，”Chem.Pharm.Bull.”，35(5)1414-6頁，(1990)；Donini等人，”Acta Endocrinol.”，73(1)133-45頁，(1973)；]。最近，有人業(yè)已研究出一種親合色譜法，也稱膜過濾親合色譜法，用于從尿液純化人絨毛膜促性腺激素[Xu等人，”Protein expression andpurification”，16221-3頁，(1999)]。這種方法不用溴化氰激活親合色譜柱中的瓊脂糖固相，這代表以親合色譜法從尿液樣本純化人絨毛膜促性腺激素的常規(guī)方法的一種改進(jìn)。根據(jù)該方法純化的人絨毛膜促性腺激素的免疫活性為8554IU/mg。
重組人絨毛膜促性腺激素的優(yōu)點(diǎn)是不含有其它促性腺激素和來源于人體的污染物，特別是人體尿液中的污染物。但是，重組人絨毛膜促性腺激素的原制劑含有其重組生產(chǎn)中所用的細(xì)胞中的所有其它蛋白質(zhì)及污染物，因此迫切需要一種能使重組絨毛膜促性腺激素完全純化的方法。
純化過程是以離子交換色譜法和反相高效液相色譜法為基礎(chǔ)進(jìn)行的。可進(jìn)一步使用粒度排斥色譜柱使殘留污染物完全除去。用離子交換色譜法至少洗脫兩次所得的結(jié)果為最好。
本發(fā)明的方法可以用于純化從重組后得到的培養(yǎng)基原制劑的重組人絨毛膜促性腺激素。所得的重組人絨毛膜促性腺激素的純度和比生物活度(比生物活度在23.000和28.000IU/mg之間)非常高，基本上不含在培養(yǎng)基中常有的胎牛血清蛋白質(zhì)、供重組過程用的宿主細(xì)胞所含有的核酸或其它污染物。
本發(fā)明的方法也可用于純化孕婦尿液原濃縮液中的尿液人絨毛膜促性腺激素，以及純化其它哺乳動物的絨毛膜促性腺激素，例如，牛、馬、豬、羊、和猴。
本發(fā)明的目的在于提供一種將樣本的人絨毛膜促性腺激素的純化方法，其包括使用離子交換色譜法和反相高效液相色譜法。該方法包括以下步驟用離子交換色譜法使樣本洗脫，再用反相高效液相色譜法使洗脫液洗脫。以及一進(jìn)一步的步驟是使洗脫液通過粒度排斥色譜柱。
為了得到最好的純化結(jié)果，在不同條件下優(yōu)選用離子交換色譜法洗脫兩次。本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施例包括如下步驟(a)樣本用硅膠色譜柱洗脫；(b)用二乙氨基乙烷(DEAE)瓊脂糖離子交換色譜柱洗脫；(c)用羧甲基(CM)瓊脂糖離子交換色譜柱洗脫；(d)用硅膠C18反相高效液相色譜柱洗脫；以及(e)用Sepharcyl粒度排斥色譜柱洗脫。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，用二乙氨基乙烷(DEAE)瓊脂糖離子交換色譜柱洗脫時采用pH值約等于7.5的磷酸鈉緩沖液。
用CM瓊脂糖離子交換色譜柱洗脫時優(yōu)選采用pH值約等于6的磷酸鈉緩沖液。
反相高效液相色譜柱步驟(d)優(yōu)選以異丙醇/三磷酸鹽緩沖液作為流動相。
本發(fā)明的絨毛膜促性腺激素優(yōu)選是人絨毛膜促性腺激素，最好是重組人絨毛膜促性腺激素，其由重組過程用的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞的培養(yǎng)基衍生。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種藥物組合物，它包括一由上述重組過程制備的有效治療量的純重組人絨毛膜促性腺激素，以及適當(dāng)賦形劑。其中一種適當(dāng)賦形劑是有助凍干產(chǎn)品穩(wěn)定的蔗糖。重組人絨毛膜促性腺激素的藥物組合物特別適合在皮下施用。
本發(fā)明使用生物原料，特別是含有人絨毛膜促性腺激素和其它污染蛋白質(zhì)的混合物，本文稱之原料樣本。下面詳細(xì)敘述的實(shí)施例均采用含有重組人絨毛膜促性腺激素(r-hCG)的原料樣本，其由一生物反應(yīng)器的細(xì)胞上清液培養(yǎng)基制成。另一個樣本是孕婦的原濃縮尿液。
樣本是新鮮采集并在生物反應(yīng)器灌流超過二天的細(xì)胞上清液培養(yǎng)基。最好將上清液過濾澄清。若需要，濃縮原溶液，并用C4硅膠色譜法洗脫以去除來自細(xì)胞培養(yǎng)基中的污染物。
然后，用離子交換色譜法洗脫過濾后的半純化收集液，優(yōu)選在不同條件下洗脫兩次，再用反相高效液相色譜柱洗脫。第一次離子交換步驟優(yōu)選采用二乙氨基乙烷(DEAE)瓊脂糖，這是人絨毛膜促性腺激素”直通”必需步驟，該步驟可除去大部分非人絨毛膜促性腺激素蛋白質(zhì)和脫氧核糖核酸(DNA)。第二次離子交換步驟優(yōu)選采用CM瓊脂糖柱，這是人絨毛膜促性腺激素的”結(jié)合”步驟，用于除去殘留的DNA和宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基蛋白質(zhì)污染物。在一優(yōu)選實(shí)施例中，該步驟是以pH值為6的磷酸鈉緩沖液在5℃下進(jìn)行洗脫。
硅膠C18反相高效液相色譜法可有效除去殘留的核酸和由細(xì)胞培養(yǎng)基衍生的污染物。色譜柱優(yōu)選以異丙醇/三磷酸鹽緩沖液作為流動相。存留液優(yōu)選在截留分子量為10KD的濾膜上進(jìn)行超濾，然后濃縮，并用pH值等于8的碳酸氫銨回收。濃縮的產(chǎn)品再用Sephacryl S200 HR粒度排斥色譜柱洗脫。在該步驟中，用pH值等于8的碳酸氫銨洗脫，按分子大小進(jìn)行分離以除去仍可能存在的微量由細(xì)胞培養(yǎng)基衍生的污染物、潛在的原子團(tuán)和游離的人絨毛膜促性腺激素亞基。然后，洗脫液要經(jīng)透析，最好在pH值等于7的磷酸鈉緩沖液中用截留分子量為10KD的濾膜進(jìn)行超濾。過濾后的純?nèi)私q毛膜促性腺激素本體溶液最好低溫冷藏于消毒瓶中。
下面的流程簡圖(表1)是重組人絨毛膜促性腺激素(r-hCG)純化過程的一優(yōu)選實(shí)施例，簡要列出色譜柱樹脂和中間各步驟操作的要點(diǎn)。
表1重組人絨毛膜促性腺激素(r-hCG)純化過程的流程簡圖

下面詳細(xì)敘述流程圖和純化過程。收集步驟(步驟1)的條件就是當(dāng)原料是重組來源時正常所采用的條件。第一步收集步驟在這一步(步驟1)中，先要進(jìn)行初步濃縮，并把緩沖液變成可控制組分。該步驟要先在室溫下進(jìn)行(硅膠C4色譜法)，然后降至約5℃。優(yōu)選溫度范圍是5±3℃。在生物反應(yīng)器生產(chǎn)周期的過程中各收集液重復(fù)步驟1。
(i)收集液的澄清先將從生物反應(yīng)器新鮮收集的培養(yǎng)基過濾澄清。
(ii)硅膠C4色譜法把澄清的收集液裝入預(yù)先用0.025M pH7的磷酸鈉溶液平衡過的硅膠C4色譜柱。優(yōu)選pH值范圍是在6.6和7.7之間。用0.025M的磷酸鈉溶液清洗色譜柱，直至紫外線顯示器的信號回到基線。然后用含有34.2％(重量)異丙醇的0.025M的磷酸鈉溶液對產(chǎn)品進(jìn)行洗脫。
(iii)氨處理把氨加入溶液中直至最后濃度達(dá)到1M。該混合物培養(yǎng)6小時。然后用2倍水稀釋，并用85％的磷酸將pH值調(diào)至7.5。優(yōu)選pH值范圍是7.5±0.2。
(iv)濃縮和透析在0.05M氫氧化鈉溶液中儲存的一些截留分子量為10KD的濾膜，在兩批料之間要用注射水沖洗直至pH值下降到約等于8。
將產(chǎn)品濃縮和透析(通過在截留分子量為10KD的濾膜上進(jìn)行超濾)以除去分子量小于10KD的物質(zhì)和殘余的異丙醇以及把氨溶液換成0.04MpH7.5的磷酸鈉溶液。優(yōu)選pH值范圍是7.5±0.2。
為了使目標(biāo)蛋白質(zhì)濃度達(dá)到3-15mg/ml，用0.04M的磷酸鈉溶液從濾膜上回收最后的存留液。
將溶液過濾，所得的濃縮液于-15℃凍存。第二步過濾及二乙氨基乙烷(DEAE)瓊脂糖快速流動的離子交換色譜法本色譜步驟是重組人絨毛膜促性腺激素(r-hCG)的”直通”步驟，其中大部分非重組人絨毛膜促性腺激素蛋白質(zhì)和核酸被除去。過濾是在室溫下進(jìn)行，而產(chǎn)品流經(jīng)色譜柱的色譜法步驟則在冷凍環(huán)境下進(jìn)行。
(i)重組人絨毛膜促性腺激素(r-hCG)原收集液的解凍和合并把冷凍濃縮液解凍和合并。處理一批純本體r-hCG，這批料由同一工作細(xì)胞庫提供的變量r-hCG原濃縮液合并起來。合并r-hCG原濃縮液的數(shù)目的準(zhǔn)則基于純化過程中下一色譜步驟的最大蛋白質(zhì)結(jié)合量(4毫克總蛋白質(zhì)/毫克樹脂)。
(ii)過濾澄清r-hCG溶液優(yōu)選通過過濾裝置進(jìn)行過濾，用0.04M pH7.5的磷酸鈉溶液清洗過濾器。
將濾液和清洗液合并。
(iii)二乙氨基乙烷(DEAE)瓊脂糖快速流動的離子交換色譜法用0.04M pH7.5的磷酸鈉溶液平衡以弱電性陰離子交換樹脂二乙氨基乙烷(DEAE)瓊脂糖FF填充的色譜柱。
將r-hCG溶液裝入色譜柱。
向色譜柱通入0.04M pH7.5的磷酸鈉溶液。層析的過程由280nm分光光度計監(jiān)控。
排出主要廢液，直至峰值開始洗脫。收集含有r-hCG的游離餾分。第三步羧甲基(CM)瓊脂糖快速流動(FF)的離子交換色譜法本色譜步驟可去除大部分宿主細(xì)胞污染物。該步驟在5℃下進(jìn)行。優(yōu)選溫度范圍是5±3℃。
(i)二乙氨基乙烷(DEAE)瓊脂糖FF洗脫液的稀釋將注射水加入到DEAE瓊脂糖FF洗脫液中，用85％的磷酸將pH值調(diào)至6。優(yōu)選pH值范圍是6±0.1。
(ii)羧甲基(CM)瓊脂糖快速流動的離子交換色譜法用0.02M pH6的磷酸鈉緩沖液平衡以弱電性陽離子交換樹脂羧甲基(CM)瓊脂糖FF填充的色譜柱。優(yōu)選pH值范圍是6±0.1。
將r-hCG溶液裝入色譜柱。
用0.02M pH6的磷酸鈉緩沖液沖洗色譜柱。層析的過程由280nm分光光度計監(jiān)控。
用0.13M pH6的磷酸鈉緩沖液對產(chǎn)品進(jìn)行洗脫。排出主要廢液，直至峰值開始洗脫。
收集含有r-hCG的全部峰值餾分。在本步驟可選擇將所得的產(chǎn)品過濾以去除病毒性污染物。第四步硅膠C18反相高效液相色譜法本反相高效液相色譜法步驟有效除去殘留的細(xì)胞培養(yǎng)基污染物、核酸殘余和內(nèi)毒素。然后進(jìn)行截留分子量為10KD的超濾及選擇性過濾。
(i)等分試樣的制備將等分試樣的pH值調(diào)至5，并加入異丙醇至終濃度為15％(體積)。
(ii)硅膠C18反相高效液相色譜法先用含有15％(體積)異丙醇的0.5M的三磷酸鹽緩沖液平衡以硅膠C18填充的色譜柱。
將第一等分試樣裝入色譜柱，層析的過程由紫外線分光光度計監(jiān)控。
用等量緩沖液清洗色譜柱。
然后，以0.5M異丙醇/三磷酸鹽緩沖液為流動相，其異丙醇的濃度呈線性梯度由15％至25％(體積)，對r-hCG溶液進(jìn)行洗脫。
當(dāng)分光光度計(A280)檢測到相應(yīng)波峰，重組人絨毛膜促性腺激素(r-hCG)就開始分離。將吸收率大于上升部分最大峰值高度65％的餾分和吸收率大于下降部分最大峰值高度20％的餾分合并。
再將4種含有合并餾分的r-hCG合并，并用等體積注射水(WFI)稀釋。
將產(chǎn)品濃縮和對注射水透析(通過在截留分子量為10KD的濾膜上進(jìn)行超濾)以濾去分子量小于10KD的物質(zhì)和異丙醇。
通過超濾將產(chǎn)品對0.1M pH8的碳酸氫銨緩沖液透析。
所得的溶液約于+5℃儲存，或者需要時也可冷凍儲存。優(yōu)選的儲存溫度分別是5±3℃和等于或低于-15℃。第五步Sepharcyl S-200 HR粒度排斥色譜法本粒度排斥色譜法步驟有效除去殘留的由細(xì)胞培養(yǎng)基衍生的污染物、潛在的原子團(tuán)和/或游離亞基。然后在截留分子量為10KD的濾膜上進(jìn)行超濾。上述兩步驟均需在約+5℃下進(jìn)行。優(yōu)選溫度范圍是5±3℃。
(i)粒度排斥色譜法用0.5M pH8的碳酸氫銨溶液平衡以Sepharcyl S-200 HR樹脂填充的色譜柱。優(yōu)選pH值范圍是8±0.2。
將r-hCG溶液裝入色譜柱，開始用0.5M pH8的碳酸氫銨溶液洗脫。優(yōu)選pH值范圍是8±0.2。
在峰值起點(diǎn)開始收集r-hCG餾分，直到到達(dá)峰值下降部分的最大峰值高度50％的刻度。
(ii)在截留分子量為10KD的濾膜上超濾在0.05M氫氧化鈉溶液中儲存的一些截留分子量為10KD的濾膜，在兩批料之間要用注射水沖洗直至pH值下降到約等于8。
將產(chǎn)品濃縮和對注射水透析(通過超濾)。
再將產(chǎn)品對0.01M pH7的磷酸鈉緩沖液透析(通過超濾)，并使蛋白質(zhì)的最終濃度調(diào)至目標(biāo)值3.5mg/ml。
所得的r-hCG本體溶液優(yōu)選大約于-15℃凍存。
色譜樹脂純化過程選用下列色譜樹脂及平衡樹脂。
步驟1硅膠C4，250ngstrom-50μm(Matres，Millipore，美國)步驟2二乙氨基乙烷(DEAE)瓊脂糖FF(Pharmacia，瑞典)步驟3CM瓊脂糖快速流動(Pharmacia，瑞典)步驟4硅膠C18，300angstrm-15-50μm(Vydac，美國)步驟5Sephacryl S-200 HR(Pharmacia，瑞典)供貨商Amersham Pharmacia Biotech，Millipore CorporationBirkgatan 30 17 Cherry Hill DriveS-751 84，Uppsala Danvers，MA 01923Sweden USAVydac，The Separations Group，17434 Mojave St.
Hesperia，CA 92345USA結(jié)果分子量和分子大小SDS-PAGE由SDS-PAGE相對已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)測定根據(jù)本發(fā)明的純化方法制備的重組人絨毛膜促性腺激素(r-hCG)的相對分子量。
在非減數(shù)SDS-PAGE出現(xiàn)了一條分子量大約為70KD(在65-75KD之間)的r-hCG異二聚物的單寬帶后，染上考馬斯鮮藍(lán)。用蛋白質(zhì)印跡法識別譜帶。
生物活性表2列出采用本發(fā)明的方法純化之后，重組人絨毛膜促性腺激素(r-hCG)的不同批料的生物活性。由276.5nm，a＝0.812的分光光度計測量蛋白質(zhì)濃度。
重組人絨毛膜促性腺激素(r-hCG)制劑的平均比活度特別高，約等于25.000IU/mg。
表2

制劑業(yè)已研制成兩種具有本發(fā)明的高純度重組人絨毛膜促性腺激素(r-hCG)的液體和凍干制劑。
液體制劑在DIN 2R瓶內(nèi)以甘露糖醇或蔗糖為賦形劑制成了兩種1000 IU/ml的液體制劑，并將這些制劑分別在50℃、40℃、25℃和4℃進(jìn)行穩(wěn)定性測試。
兩種液體制劑的成分列于表3和表4中。
表3

填充體積0.5ml
表4

填充體積0.5ml穩(wěn)定性測試是通過生物分析、粒度排斥/高效液相色譜法和反相高效液相色譜法進(jìn)行的，所得結(jié)果顯示甘露糖醇制劑比蔗糖制劑更穩(wěn)定。所需要的凍存條件最好使蛋白質(zhì)氧化和游離亞基的形成減至最低。凍干制劑在DIN 2R瓶內(nèi)以蔗糖為賦形劑制成了強(qiáng)度為5000 IU的凍干制劑，分別于50℃、40℃、25℃和4℃對其穩(wěn)定性進(jìn)行測試。
制劑的成分列于表5中。
表5

穩(wěn)定性測試是通過生物分析、粒度排斥/高效液相色譜法和反相高效液相色譜法進(jìn)行的，所得結(jié)果顯示這種凍干制劑的穩(wěn)定性好，于40℃和50℃至少可儲存19個星期。
在25℃和4℃進(jìn)行了長達(dá)6個月的穩(wěn)定性測試，結(jié)果顯示有效成分沒有出現(xiàn)降解的現(xiàn)象。
權(quán)利要求
1.一種從樣本純化人絨毛膜促性腺激素(hCG)的方法，其特征在于所述方法包括使用離子交換色譜法和反相高效液相色譜法。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法包括如下步驟(a)用離子交換色譜法使樣本洗脫以得到一第一洗脫液；(b)用反相高效液相色譜法使第一洗脫液洗脫以得到一第二洗脫液；以及(c)用粒度排斥色譜法使第二洗脫液洗脫。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步驟(a)包括兩條分離的離子交換色譜信道。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述離子交換色譜信道在不同條件下進(jìn)行。
5.如權(quán)利要求1至4中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述方法包括如下步驟(a)用硅膠色譜柱使樣本洗脫；(b)用二乙氨基乙烷(DEAE)瓊脂糖離子交換色譜柱洗脫；(c)用羧甲基(CM)瓊脂糖離子交換色譜柱洗脫；(d)用硅膠C18反相高效液相色譜柱洗脫；以及(e)用粒度排斥色譜法使洗脫液洗脫。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述通過二乙氨基乙烷(DEAE)瓊脂糖離子交換樹脂的洗脫是在pH值等于7.5的磷酸鈉緩沖液中進(jìn)行的。
7.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于所述通過CM瓊脂糖離子交換色譜樹脂的洗脫是在pH值等于6的磷酸鈉緩沖液中進(jìn)行的。
8.如權(quán)利要求5、6或7所述的方法，其特征在于所述步驟(c)是以異丙醇/三磷酸鹽緩沖液作為流動相。
9.如權(quán)利要求5至8中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述步驟(d)是以碳酸氫銨緩沖液作為流動相。
10.如權(quán)利要求1至9中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述人絨毛膜促性腺激素(hCG)是重組人絨毛膜促性腺激素。
11.如權(quán)利要求1至10中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述樣本來源于中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞培養(yǎng)基。
12.一種藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物包括一由權(quán)利要求10或11所述方法制備的有效治療量的重組人絨毛膜促性腺激素(hCG)及其適當(dāng)賦形劑。
13.如權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其特征在于所述賦形劑是蔗糖。
14.如權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其特征在于所述賦形劑是甘露糖醇。
15.如權(quán)利要求12、13或14所述的藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物適合在皮下施用。
全文摘要
一種從中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞上清液的原重組人絨毛膜促性腺激素(hCG)樣本純化重組人絨毛膜促性腺激素的方法，其包括聯(lián)合使用離子交換色譜法和反相高效液相色譜法。用離子交換色譜法洗脫兩次，最后用粒度排斥色譜法使人絨毛膜促性腺激素純化至完全不含任何污染物。由這種方法可制成高純?nèi)私q毛膜促性腺激素，其比生物活度非常高，約為25.000IU/mg。
文檔編號G01N30/26GK1404485SQ01805363
公開日2003年3月19日 申請日期2001年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月22日
發(fā)明者G·帕拉迪斯, M·羅西, L·斯卡利亞 申請人:應(yīng)用研究系統(tǒng)Ars股份公司