專利名稱：：人絨毛膜促性腺激素異構(gòu)體的質(zhì)譜抗體試劑盒及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及基于質(zhì)譜技術(shù)的用于對異位妊娠生物樣品中人絨毛膜促性腺激素異構(gòu)體分析的試劑盒制備方法。
背景技術(shù)：
：不論是細(xì)胞的正常功能還是病理特性都在一定程度上取決于細(xì)胞所表達(dá)的蛋白質(zhì)功能。因此，鑒定人體內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)的區(qū)別，可用于體外疾病樣本診斷及篩査，并最終用于藥物開發(fā)和疾病治療。而要進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)和功能的差異化分析，要求能夠達(dá)到分辨細(xì)胞內(nèi)分子的復(fù)雜混合物的程度。但細(xì)胞內(nèi)許多物質(zhì)往往以微量存在，目前用于分析蛋白的有法在上述各方面都有局限，用這些常規(guī)手段難以進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)序列鑒定分析。用質(zhì)譜聯(lián)合可克服這一技術(shù)缺點。異位妊娠是導(dǎo)致育齡期婦女發(fā)病和死亡的主要原因，占所有妊娠三個月合并死亡病例的9%，并且在所有妊娠者中占220%。上世紀(jì)60年代后期，腹腔鏡檢查的，引進(jìn)，對異位妊娠的早期診斷限定其更靈敏和精確的檢測做出了相當(dāng)大的貢獻(xiàn)，因為〉80%的異位妊娠要在輸卵管破裂后才被診斷。已有幾項生化和影像學(xué)標(biāo)志物，被單個或組合(按照一定模式)研究，來檢測隱匿性異位妊娠。這當(dāng)中最常見的，包括陰道超聲和人促絨毛膜性腺激素(hCG)的連續(xù)監(jiān)測。血清中hCG的增長率顯示是否存在子宮妊娠最后一次行經(jīng)至其后5周，hCG每1.5天增長一倍，而后從第7周開始，每3.5天增長一倍。雖然在大多數(shù)的異位妊娠病例中，hCG濃度并不以此速率增長，但是此情況存在于大約l/3的病例中，而且hCG增長動力學(xué)方面的不規(guī)則性也與自發(fā)流產(chǎn)有關(guān)系。除了這些問題，對于異位妊娠的診斷，hCG的監(jiān)測仍舊是不可或缺的。hCG是醣蛋白的異二聚體。完整hCG由hCG-"和hCG-"亞單位組成。只有完整的hCG才有生物活性，例如a,^異二聚體。hCG異構(gòu)體和亞單位通常被發(fā)現(xiàn)是完整激素的代謝降解產(chǎn)物，但是偶爾游離的亞單位可以被表達(dá)且直接釋放入血液循環(huán)。通常被用于傳統(tǒng)檢測異位妊娠的hCG試驗是檢測所謂的總hCG，而不是hCG-盧和hCG-"亞單位濃度。傳統(tǒng)hCG試驗無法同時檢測差別性的hCG》cf、hCG-c及hCG-v^異構(gòu)體。因為傳統(tǒng)hCG檢測常常是針對門診病人，異位妊娠的診斷程序在診斷上就需經(jīng)過幾天必須的延遲后連續(xù)檢測hCG,這樣就增加了輸卵管破裂的風(fēng)險性。傳統(tǒng)用于hCG檢測試劑盒及制備方法為ELISA等傳統(tǒng)免疫分析技術(shù)，ELISA等傳統(tǒng)免疫分析技術(shù)主要依靠間接的化學(xué)或放射測定法，因而無法直接鑒定抗原的變異。舉例講，hCG的檢測試劑盒制備方法為先將抗hCG抗體(第一個抗體)結(jié)合至固相表面(如玻璃)，然后將含hCG的樣品(如血清)，加至這個已標(biāo)有抗hCG抗體的容器中；這樣，hCG就會結(jié)合至抗體上，然后洗脫未結(jié)合的物質(zhì)。再加上已標(biāo)有酶、放射性或化學(xué)發(fā)光性的抗hCG抗體(第二個抗體)，這樣就可以檢測出hCG的總含量。這種方法學(xué)的缺點是無法測出hCG的變異(如hCG的N或C端丟失了一個或數(shù)個氨基酸，hCG被甲基，?；刃揎?，hCG的異構(gòu)體)。即通常被用于傳統(tǒng)檢測異位妊娠的hCG試驗是檢測所謂的總hCG，而不是hCG-》和hCG-a等亞單位濃度。傳統(tǒng)hCG檢測試劑盒無法同時檢測差別性的hCG》cf、hCG-"及hCG-"等異構(gòu)體。上述hCG檢測試劑盒在異位妊娠預(yù)后評估中有重要價值，但臨床工作中也發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)比例的異位妊娠患者中因無法檢測hCG異構(gòu)體、片斷及終末降解產(chǎn)物，這對于異位妊娠患者的預(yù)后評估則缺乏有效的早期監(jiān)測手段。目前在進(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析時還沒有發(fā)現(xiàn)一個用于臨床hCG異構(gòu)體、片斷及終末降解產(chǎn)物檢測的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)譜抗體試劑盒。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服已有技術(shù)的不足之處，提出一種用于檢測人絨毛膜促性腺激素異構(gòu)體的質(zhì)譜抗體試劑盒及制備方法，該試劑盒為異位妊娠的早期檢測提供了新的途徑，并為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的異位妊娠生物標(biāo)志提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明提出的用于檢測人絨毛膜促性腺激素異構(gòu)體的質(zhì)譜抗體試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括一小管含U9緩沖溶液的質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)，1030ri;一小管含等量l^g的抗hCG、抗hCG》cf、抗hCG-"及抗hCG-"的磁珠3050W;一小管緩沖液300500W，該緩沖液為50100mMPBS，pH值為7.07.4;一小管洗脫液1050W，該洗脫液為15%三氟乙酸的水溶液；一小管能量吸收分子飽和溶液510W，該溶液由能量吸收分子溶解在含3060%乙腈和0.51%三氟乙酸的水溶液中構(gòu)成，該能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羥基苯甲酸之中的任一種；上述各小管置于4'C冷藏盒中。.本發(fā)明提出的上述質(zhì)譜抗體試劑盒制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟'1)含U9緩沖溶液的質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)的制備將男性、女性等量的O型血清(漿)稀釋在U9緩沖溶液中制成質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(衆(zhòng))，并將該稀釋的血清(漿)分裝成1030W小管中；其中，血清(漿)U9緩沖溶液=1:2，所述U9緩沖液為9MUrea,2%CHAPS，50mMTris-HCL，pH9.0;2)制備含抗hCG、抗hCG"cf、抗hCG-c及抗hCG-》的磁珠將合成的變異的hCG免疫小鼠，待免疫反應(yīng)出現(xiàn)后，從外周血中分離B細(xì)胞，按標(biāo)準(zhǔn)的單克隆抗體的制備方法制備；將購買的蛋白A-磁珠(ProteinA-磁珠)3050W標(biāo)記上的等量mg的抗hCG、hCGj8cf、hCG-ff及hCG-vS抗體；3)將購買的50100mMPBS(Phosphate-BufferedSaline),pH值為7.07.4緩沖液、15%三氟乙酸的洗脫液分別分裝成300500W小管和1050W小管；4)將能量吸收分子溶解3060%乙腈和0.51%三氟乙酸的水溶液中制成能量吸收分子飽和溶液，并分裝成510W小管，該能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羥基苯甲酸之中的任一種；5)將上述分裝好的各小管置于4。C冷藏箱中。本發(fā)明還提出所述的試劑盒對異位妊娠體的預(yù)后判斷的應(yīng)用。所述的檢測試劑盒對異位妊娠體預(yù)后判斷為判斷的23570Da蛋白質(zhì)是變異的hfcG-3、37580Da蛋白質(zhì)是變異的hCG、10577Da蛋白質(zhì)是變異的hCG》cf、14509Da蛋白質(zhì)是變異的hCG-a;所述試劑盒依據(jù)幾個特征蛋白峰為10577、14509、23570、37580Da，雙盲測試異位妊娠體外樣品的敏感性100%，特異性90.1%。質(zhì)譜抗體試劑盒檢測人絨毛膜促性腺激素異構(gòu)體的應(yīng)用實驗步驟包括1.將生物樣品先用緩沖液稀釋3050倍，將樣品充分混勻；2.將上述標(biāo)本100(ii加至已裝好磁珠-ProteinA-抗體(抗hCG、抗hCG》cf、抗hCG-c及抗hCG-》)的PCR管中，置磁性處理器上，1525'C孵育2040分鐘，除去液體；3.力B10(V1緩沖液至已裝好磁珠的PCR管，置磁性處理器上孵育15分鐘，除去液體，重復(fù)上述操作兩次；.,4.力口IOW洗脫液15分鐘，洗脫標(biāo)本至上清液；5.取5W上清液移至另一個PCR管中，加入5W能量吸收分子飽和溶液充分混勻；6.取lW混合溶液加樣至質(zhì)譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然干燥金屬片；7.將上述金屬片加入質(zhì)譜儀中，就會生成質(zhì)譜；8.外部使用多肽分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)來校正質(zhì)量精確性，所有樣本均進(jìn)行雙份檢測以減少實驗誤差。上述的生物標(biāo)志是利用一臺質(zhì)譜儀來檢測的。該設(shè)備的質(zhì)量精確度約為+/-1%?；|(zhì)是任何能與抗體選擇性或特異性結(jié)合的物質(zhì)。舉例說明，ProteinA、ProteinG可選擇性或特異性結(jié)合抗體的Fc位點。洗去基質(zhì)未吸附的物質(zhì)。任何適宜的洗液均可使用。人絨毛膜促性腺激素異構(gòu)體首先能夠被具有能與人絨毛膜促性腺激素異構(gòu)體結(jié)合的抗體吸附表面捕獲，非吸附物能從基質(zhì)上洗脫，吸附到底基的人絨毛膜促性腺激素異構(gòu)體在質(zhì)譜儀中被檢測。人絨毛膜促性腺激素異構(gòu)體通過離子發(fā)生源，如激光，被離子化，產(chǎn)生的離子被一個離子感受集合器收集，然后質(zhì)量分析器分析那些通過的離子。之后，檢測器將檢測的離子信息轉(zhuǎn)換為質(zhì)荷比。定量性控制及質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰6634.0Da強(qiáng)度調(diào)至50呢質(zhì)譜信號強(qiáng)度的最大值。人絨毛膜促性腺激素異構(gòu)體的檢測明顯地將與信號強(qiáng)度的檢測有關(guān)。這樣，人絨毛膜促性腺激素異構(gòu)體的數(shù)量與質(zhì)量都可以被檢測出來。''質(zhì)譜對待分析物的分析生成飛行時間譜。該飛行時間譜的最終分析并不表示離子化能量攻擊一個樣本產(chǎn)生的單獨的脈沖信號，而是一系列脈沖的信號之和。這樣降低了干擾，并增加了動態(tài)范圍。該飛行時間數(shù)據(jù)受數(shù)據(jù)處理軟件的影響。軟件中數(shù)據(jù)處理主要包括轉(zhuǎn)換飛行時間與質(zhì)荷比而產(chǎn)生質(zhì)譜，降低基線而減少儀器的偏移量，和過濾高頻噪音而減輕高頻噪音。通過對人絨毛膜促性腺激素異構(gòu)體檢測而產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可利用計算機(jī)的數(shù)據(jù)分析程序進(jìn)行分析。該計算機(jī)程序分析這些數(shù)據(jù)以顯示檢測出的人絨毛膜促性腺激素異構(gòu)體的數(shù)量，并顯示信號的強(qiáng)度和確定被檢測的每個人絨毛膜促性腺激素異構(gòu)體的分子量。數(shù)據(jù)分析還能包括一系列的確定人絨毛膜促性腺激素異構(gòu)體的信號強(qiáng)度和矯正數(shù)據(jù)對預(yù)定統(tǒng)計分布狀態(tài)的偏離。例如，通過計算與某些參數(shù)相關(guān)的每個峰值的高度，可規(guī)范觀測到的峰。哮參數(shù)可能是由儀器和類似能量吸收分子等化學(xué)成分產(chǎn)生的不重要的干擾，這可以設(shè)置調(diào)。計算^l可以將計算結(jié)果數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成各種形式來表現(xiàn)。其標(biāo)準(zhǔn)譜可以表示，但在一種形式中只有峰高和質(zhì)量信息可以在譜帶中保留，產(chǎn)生一個較清晰的圖，并使具有幾乎相同分子量的人絨毛膜促性腺激素異構(gòu)體更易顯現(xiàn)。在另一種形式中，兩個或更多的譜比較，便于突顯獨特的人絨毛膜促性腺激素異構(gòu)體和那些高于或低于校準(zhǔn)樣本的人絨毛膜促性腺激素異構(gòu)體。分析一般包括展示從待分析物得到的信號的圖譜中峰的鑒定。峰可以通過視圖進(jìn)行選擇，軟件是可用的，它可自動檢測峰。一般情況下，該軟件通過鑒定信號具有信噪比高于一個選擇閾值并標(biāo)記出在峰信號的質(zhì)心處的峰的質(zhì)量這樣的方式操作。在一個有效的程序中，比較許多譜線以認(rèn)定出現(xiàn)在質(zhì)譜中某一選定范圍內(nèi)同樣的一些峰。該軟件的一個版本^集所有出現(xiàn)在確定的質(zhì)量范圍內(nèi)的各條光譜的峰，對所有在質(zhì)量(質(zhì)荷比)中值附近的峰指定一個質(zhì)量(質(zhì)荷比)簇。發(fā)明中使用的人絨毛膜促性腺激素異構(gòu)體是抗體所捕獲。這些人絨毛膜促性腺激素異構(gòu)體是進(jìn)一步通過質(zhì)譜(massspectrometry)測定其不同分子量來知道它們特定的身份。異位妊娠檢測多肽蛋白篩選。通過Mann-Whitney〃檢驗分析幾百種WCX陰離子基質(zhì)磁珠捕獲的血清蛋白指紋峰，發(fā)現(xiàn)下述蛋白指紋或質(zhì)譜圖譜可以用于區(qū)分正常與異位妊娠的血清。峰值CV〉30M或者p<0.01為有顯著性差異表一正常與異位妊娠蛋白指紋或質(zhì)譜圖譜的顯著性差異(Dai1%)124250018752145091771535990102357024215518911237580259756789217375258419987415761781077246306355105774819727213507從中篩選出幾個特征蛋白峰，10577、14509、23570、37580Da4個差異峰組成的檢驗?zāi)Ｐ蛯Ξ愇蝗焉锘颊吆徒】等巳好ずY檢驗，用此分類法分析71份異位妊娠樣本的質(zhì)譜鈾果，其中64份區(qū)分正確，0份區(qū)分錯誤，敏感性為100%;71份對照樣品中64份區(qū)分正確，7份區(qū)分錯誤，特異性為90.1%(見表二)表二生物樣品中檢驗?zāi)Ｐ偷呐袆e情況<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注敏感性100%(71/71);特異性90.1%(64/71)利用C8及C18疏水基質(zhì)磁珠或芯片的實驗結(jié)果與上述WCX陰離子基質(zhì)磁珠或芯片的率驗結(jié)果一致。'將10577、14509、23570、37580Da生物標(biāo)志用多級質(zhì)譜(MS/MS)、源后裂解(PSD)及蛋白質(zhì)梯狀排序法(proteinladdersequencing)進(jìn)行排序。通過將分子碎成碎片，可生成蛋白質(zhì)梯度(proteinladders)。然后，用質(zhì)譜對此梯度進(jìn)行分析。鑒別出14509Da蛋白為變異的hCG-a。其化學(xué)結(jié)構(gòu)為(從N端至C端排列的氨基酸)1APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQ51KNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKS鑒別出23570Da蛋白為變異的hCG-"。其化學(xué)結(jié)構(gòu)為(從N端至C端排列的氨基酸)1SKEPLRPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPTMTRVLQGVLP51ALPQVVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCALCRRSTTDC.、101GGPKDHPLTCDDPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ鑒別出10577Da蛋白為變異的hCG^cf;鑒別出37580Da蛋白為hCG。檢測280例異位妊娠病人和正常妊娠的血清、尿液發(fā)現(xiàn)異位妊娠的婦女產(chǎn)生的hCG和亞單位(hCG-》)的濃度比那些正常妊娠的婦女要低得多(表三)。表三、區(qū)分正常人、異位妊娠生物標(biāo)志群<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>代表性的抗體-質(zhì)譜峰見圖l和圖2;圖中橫坐標(biāo)代表分子量(Da)、縱坐標(biāo)代表質(zhì)譜峰強(qiáng)度抗hCG-》磁珠可捕獲變異的hCG-;S(圖l中上圖為抗hCG-"捕獲的質(zhì)譜峰，即hCG-";下圖為IgG對照組；圖l中箭頭指向為分子量23570Da，與hCG-》分子量一致)；抗hCG磁珠可捕獲hCG(圖2中上圖為抗hCG捕獲的質(zhì)譜峰，即hCG;下圖為IgG對照組；圖2中箭頭指向為分子量37580Da，與hCG分子量一致)。.,本發(fā)明可用于體外細(xì)胞和非侵入性的體外異位妊娠質(zhì)譜檢測方法的定量控制，如離體體液的異位妊娠試劑盒用于臨床質(zhì)譜的異位妊娠檢測方法。可以檢測多個異位妊娠蛋白質(zhì)生物標(biāo)志群及質(zhì)譜多肽圖譜。本發(fā)明中的試劑盒及方法與其他非侵入性的體外檢測方法比較，具有以下的特點(1)準(zhǔn)確質(zhì)譜直接分析有很強(qiáng)的精確性。因為蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的，而氨基酸的平均質(zhì)量是已知的，如果知道了抗原或生物標(biāo)志的總分子量，那么抗原的變異(指氨基酸變化)就很容易被推測出來。(2)方便支持基質(zhì)的方法所用吸附劑的支持物是磁珠或芯片。用磁性分離器分離磁珠及樣品，無需離心樣品。''(3)快捷用本發(fā)明提供的蛋白指紋法進(jìn)行檢測時，無需對蛋白質(zhì)進(jìn)行測序。本發(fā)明采用了抗體-質(zhì)譜分析一次性、同時檢測差別性的hCG、hCG"cf、hCG-"及hCG-圖1為利用本發(fā)明得到的變異的hCG-P的一個特征峰的抗體鑒定曲線。圖2為利用本發(fā)明得到的hCG的一個特征峰的抗體鑒定曲線。具體實施方式本發(fā)明將結(jié)合具體實施例作進(jìn)一步說明，這些實例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。''實施例1本發(fā)明提出的人絨毛膜促性腺激素異構(gòu)體的質(zhì)譜抗體試劑盒實施例1，包括一小管含U9緩沖溶液的質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)，一小管含等量lPg的抗hCG、抗hCG^cf、抗hCG-"及抗hCG-"的磁珠30W;^小管緩沖液30(H4，該緩沖液為50mMPBS,pH值為7.0;一小管洗脫液10W,該洗脫液為1%三氟乙酸的水溶液；一小管能量吸收分子飽和溶液5W，該溶液由能量吸收分子溶解在含30%乙腈和1%三氟乙酸的水溶液中構(gòu)成，該能量吸收分子采用肉桂酸衍生物；上述各小管置于4'C冷藏箱中。上述試劑盒的制備方法實施例包括以下步驟1)含U9緩沖溶液的質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)的制備將男性、女性等量的O型血清(漿)稀釋在U9緩沖溶液中制成質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)，并將該稀釋的血清(漿)分裝成10W小管中；其中，血清(漿)U9緩沖溶液4:2,所述U9緩沖液為9MUrea，2%CHAPS，50mMTris-HCL，pH9.0;2)制備含抗hCG、抗hCCcf、抗hCG-a及抗hCG-"的磁珠將合成的變異的hCG免疫小鼠，待免疫反應(yīng)出現(xiàn)后，從外周血中分離B細(xì)胞，按標(biāo)準(zhǔn)的單克隆抗體的制備方法制備；將購買的蛋白A-磁珠(ProteinA-磁珠)30W標(biāo)記上的等量l^g抗體抗hCG、hCGv9cf、hCG—"及hCG-^。，-3)將購買的50mMPBS(Phosphate-BufferedSaline),pH值為7.0緩沖液、1%三氟乙酸的洗脫液分別分裝成300W小管和IOW小管；4)將能量吸收分子飽和溶液溶解30%乙腈和1%三氟乙酸的水溶液中，分裝成5ri小管，該能量吸收分子采用肉桂酸衍生物；5)將上述分裝好的各小管置于4'C冷藏箱中。實施例2本發(fā)明提出的人絨毛膜促性腺激素異構(gòu)體的質(zhì)譜抗體試劑盒實施例2，包括一小管含U9緩沖溶液的質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)，一小管含等量Wg的抗hCG、抗hCG》cf、抗hCG-"及抗hCG-"的磁珠5(mi;一小管緩沖液500W,該緩沖液為IOOmMPBS,pH值為7.4;一小管洗脫液5014，該洗脫液為5%三氟乙酸的水溶液；一小管能量吸收分子飽和溶液IOW，該溶液由能量吸收分子溶解在含60%乙腈和0.5%三氟乙酸的水溶液中構(gòu)成，該能量吸收分子采用芥子酸或二羥基苯甲酸之中的任一種；上述各小管置于4'C冷藏箱中。上述試劑盒的制備方法實施例包括以下步驟1)含U9緩沖溶液的質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)的制備將男性、女性等量的O型血清(漿)稀釋在U9緩沖溶液中制成質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)，并將該稀釋的血清(漿)分裝成30W小管中；其中，血清(漿)119緩沖溶液=1:2，所述U9緩沖液為9MUrea，2%CHAPS，50mMTris-HCL，pH9.0;2)制備含抗hCG、抗hCG》cf、抗hCG-o及抗hCG-》的磁珠將合成的變異的hCG免疫小鼠，待免疫反應(yīng)出現(xiàn)后，從外周血中分離B細(xì)胞，按標(biāo)準(zhǔn)的單克隆抗體的制備方法制備；將購買的蛋白A-磁珠(ProteinA-磁珠)50W標(biāo)記上的等量l[xg抗體抗hCG、hCG"cf、hCG-c7及hCG-》。3)將購買的50100mMPBS(Phosphate-BufferedSaline),pH值為7.07.4緩沖液、15%三氟乙酸的洗脫液分別分裝成500ri小管和50W小管；4)將能量吸收分子飽和溶液溶解60%乙腈和0.5%三氟乙酸的水溶液中，分裝成10rt小管，該能量吸收分子采用芥子酸或二羥基苯甲酸之中的任一種；5)將上述分裝好的各小管置于4'C冷藏箱中。采用本發(fā)明方法制備的試劑盒的應(yīng)用及效果說明如下-一、材料1.標(biāo)本來源A.280例正常妊娠人對照組的血清及尿液；B.280例異位妊娠病人的血清及尿液。2.質(zhì)量控制A.人標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清B.質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測試前，用上述標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清-。3.磁珠基質(zhì)含已標(biāo)記的等量l^g抗體抗hCG、hCGj9cf、hCG-"及hCG-"。將蛋白A''(ProteinA)用Carbodiimide方法標(biāo)記在磁珠上(見GunnDL，etal.JImmunolMethods.1:381-389，1972);蛋白A(ProteinA)可以結(jié)合多個標(biāo)有的抗體。具有吸附劑功能的ProteinA與抗體置磁性處理器上，22。C孵育30分鐘，除去液體。力tUOO(al緩沖液(50mMPBS,pH7.07.4)至已裝好磁珠的PCR管，置磁性處理器上孵育2分鐘，除去液體，重復(fù)上述操作兩次。二、方法1.樣品的收集全血采集后吸取血清及尿液，置于一80。C保存；-8(TC冰箱中取出血清及尿液樣品，置冰盒上融解；以10,000轉(zhuǎn)/分，4'C離心2分鐘；取上清液。2.樣品的準(zhǔn)備每個吸附劑支持物點需要血清及尿液lW，將血清及尿液用緩沖液稀釋，將樣品充分混勻。3.樣品檢測上樣，將上述標(biāo)本100^J加至已裝好磁珠-ProteinA-抗體的PCR管中，i磁性處理器上，22。C孵育30分鐘，除去液體。力tU00nl緩沖液(50mMPBS,pH7.07.4)至己裝好磁珠的PCR管，置磁性處理器上孵育2分鐘，除去液體，重復(fù)上述操作兩次。加10W洗脫液2分鐘，洗脫標(biāo)本至上清液。取5W上清液移至另一個PCR管中，加入5W能量吸收分子飽和溶充分混勻，取lW混合溶液加樣至質(zhì)譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然干燥金屬片。所有樣本均進(jìn)行雙份檢測以減少實驗誤差。4.將上述樣品加入質(zhì)譜中，就會生成飛行時間質(zhì)譜。外部使用多肽分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)來校正質(zhì)量精確性。實驗結(jié)果、用統(tǒng)計學(xué)方法，通過分析血清蛋白指紋峰，發(fā)現(xiàn)下述生物標(biāo)志可以用于區(qū)分正常人、異^妊娠生物標(biāo)志群變異表達(dá)(表三)。表三、區(qū)分正常人、異位妊娠生物標(biāo)志群篩選試驗抗hCG抗hCG》cf抗hCG-a抗hCG-"異位妊娠++++正常妊娠++++++++++檢測280例異位妊娠病人和正常妊娠的血清、尿液發(fā)現(xiàn)異位妊娠的婦女產(chǎn)生的hCG和亞單位(hCG-")的濃度比那些正常妊娠的婦女要低得多。發(fā)現(xiàn)尿液和血清分子量為10577、14509、23570、37580Da生物標(biāo)志的變化區(qū)分正常人、異位妊娠標(biāo)志群變異表達(dá)具有重要意義。代表性的抗體-質(zhì)譜峰見圖l和圖2;圖中橫坐標(biāo)代表分子量(Da)、縱坐標(biāo)代表質(zhì)譜峰強(qiáng)度抗hCG-"磁珠可捕獲變異的hCG-》(圖l中上圖為抗hCG-,捕獲的質(zhì)譜峰，即hCG-";下圖為IgG對照組；圖l中箭頭指向為分子量23570Da，與hCG-"分子量一致)；抗hCG磁珠可捕獲hCG(圖2中上圖為抗hCG捕獲的質(zhì)譜峰，即hCG;下圖為IgG對照組；圖2中箭頭指向為分子量37580Da，與hCG分子量一致)。本發(fā)明用于異位妊娠檢測多肽蛋白篩選實驗(1)實驗方法異位妊娠患者的血清及尿液280例，平均年齡25歲。健康妊娠者280例，平均年齡27歲，來源于肝功能、腎功能等檢查均正常的體檢人群。受檢者空腹采集靜脈血1mL，采集后立即于4'C冰箱靜置2小時，4'C4000r/min離心10分鐘分離血清，將血清于4'C12000r/min再次離心5分鐘，去除所有殘留細(xì)胞碎片和不溶物，在冰上將血清分裝為100W7管，共5管，保存于-80'C冰箱。避免反復(fù)凍融。血清樣品處理從_80。C冰箱中取出血清，于4。C，10OOOrpm離心5min。取IO叱血清樣品，加20MLU9處理液(9mo1/L尿素，2%CHAPS,1%DTT,50隱ol/LTris-CL,pH9.0),充分混勻，冰浴振蕩30min后取出，加入360^L結(jié)合緩沖液(10Ommol/LNaAc,pH4.0),立即混勻。'芯片上樣及洗脫將WCX2芯片(弱陰型離子表面，羧基基團(tuán)，捕獲正電荷基團(tuán)蛋白)裝入Coprocessor中，每孔加入200HL結(jié)合緩沖液，室溫振蕩洗滌2次，每次5min,甩干。每孔分別加入IOO叱處理好的樣品，振蕩孵育lh,甩去樣品，用200"1芯片洗脫緩沖液(100mmol/LNaAc，pH4.0)室溫振蕩洗滌2次，每次5min，甩干；再用HPLCH20洗滌一次，立即甩干。取出芯片，每點加2次0.5叱SPA飽和溶液，晾干后上機(jī)測量。磁珠上樣及洗脫將處理好的樣品100^加至已裝好WCX磁珠(弱陰離子表面，羧酸基團(tuán)，捕獲正電荷基團(tuán)蛋白)的PCR管中，置磁性處理器上孵育30min，除去液體。加磁珠結(jié)合緩沖液(50mmol/LNaAc,pH4.04.3)至已裝好WCX磁珠的PCR管，置磁性處理器上孵育2分鐘，除去液體，重復(fù)上述操作2次。加10^ElutionBuffer2min,洗脫標(biāo)本至上清液。取5叱上清液移至另一個PCR管中，加入5PLSPA飽和溶液充分混勻，取l叱混合溶液加樣到Au片上，晾干后上機(jī)測量(劉建棟等，血液蛋白質(zhì)組與質(zhì)譜儀檢測流程標(biāo)準(zhǔn)化初探?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2007,27:193-197)。數(shù)據(jù)收集將處理好的Au片置入MALDI-TOF-MS進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析。在讀取數(shù)據(jù)前，用加有all-in-one標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的芯片校正質(zhì)譜儀，使分子量誤差<0.1%。本研究中閱讀儀的主要參數(shù)設(shè)定為，最高檢測分子量為50kDa，優(yōu)化分子量范圍100015000Da,最佳聚集中心8000Da，數(shù)據(jù)采集參數(shù)范圍2080,收集總數(shù)為130次。軟件中設(shè)定讀片程序，以讀取數(shù)據(jù)。用血清中的內(nèi)標(biāo)峰4091.1Da或6634.0Da校正原始數(shù)據(jù)中的蛋白指紋圖譜，使分子量誤差<0.01%，從而獲得的精確的蛋白指紋圖譜。統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用軟件分析處理所有峰譜，形成蛋白指紋圖譜。所有的圖譜都進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化，統(tǒng)一到它們自己全部的離子總數(shù)(峰面積的總和)。將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰4091.1或6634.0Da強(qiáng)度調(diào)至4050%信號強(qiáng)度的最大值，并且用最顯著的峰進(jìn)行了校正，而后又進(jìn)行了"減少基線"，定義蛋白峰(s/n〉5，最小的峰強(qiáng)度〉1.6)。分析所有l(wèi)50kDa之間的蛋白峰，并且仔細(xì)檢查了每個相應(yīng)的峰，計算出峰的平均數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)誤差(SD)和變異系數(shù)(CV%)。用Mann-Whitney〃檢驗比較配對樣本的蛋白峰，計算p值。異位妊娠檢測多肽蛋白篩選。通過Mann-WhitrieyV檢驗分析幾百種血清蛋白指紋峰，發(fā)現(xiàn)下述蛋白指紋或質(zhì)譜圖譜可以用于區(qū)分正常與異位妊娠的血清。峰值CV〉3(P/。或者p〈0.01為有顯著性差異',表一正常與異位妊娠蛋白指紋或質(zhì)譜圖譜的顯著性差異(Dai1%)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>采用本發(fā)明對特征蛋白峰的雙盲測試從中篩選出幾個特征蛋白峰，10577、14509、23570、37580Da4個差異峰組成的檢驗?zāi)Ｐ蛯Ξ愇蝗焉锘颊吆徒】等焉锩ずY檢驗，用此分類法分析71份異位妊娠樣本的質(zhì)譜結(jié)果，其中64份區(qū)分正確，0份區(qū)分錯誤，敏感性為100%;71份對照樣品中64份區(qū)分正確，7份區(qū)分錯誤，特異性為90.1%(見表二)表二生物樣品中檢驗?zāi)Ｐ偷呐袆e情況分組異位妊娠健康妊娠人合計異位妊娠71778健康妊娠人06464合計7171142注敏感性100%(71/71);特異性90,1%(64/71)發(fā)現(xiàn)異位妊娠的婦女產(chǎn)生的hCG亞單位的濃度比那些正常妊娠的婦女要低得多。利用C8及C18疏水基質(zhì)磁珠或芯片的實驗結(jié)果與上述WCX陰離子基質(zhì)磁珠或芯片的實驗結(jié)果一致。采用本發(fā)明對特征蛋白峰蛋白的排序鑒定，-將10577、14509、23570、37580Da生物標(biāo)志用多級質(zhì)譜(MS/MS)、源后裂解(PSD)及蛋白質(zhì)梯狀排序法(proteinladdersequencing)進(jìn)行排序。通過將分子碎成碎片，可生成蛋白質(zhì)梯度(proteinladders)。然后，用質(zhì)譜對此梯度進(jìn)行分析。鑒別出14509Da蛋白為變異的hCG-"。其化學(xué)結(jié)構(gòu)為(從N端至C端排列的氨基酸)1APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQ51KNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKS鑒別出23570Da蛋白為變異的hCG-》。其化學(xué)結(jié)構(gòu)為(從N端至C端排列的氨基酸):1SKEPLRPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPTMTRVLQGVLP51ALPQVVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCALCRRSTTDC101GGPKDHPLTCDDPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ鑒別出10577Da蛋白為變異的hCG萬cf;鑒別出37580Da蛋白為hCG。本發(fā)明中變異的或修飾的hCG抗體的制備實施例變異的或修飾的hCG的合成合成hCG-"及hCG-P。hCG-"及hCG-A序列N端1APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQ51KNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKSC端N端1SKEPLRPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPTMTRVLQGVLP51ALPQVVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCALCRRSTTDC101GGPKDHPLTCDDPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQC端將合成的變異的生物標(biāo)記免疫小鼠，待免疫反應(yīng)出現(xiàn)后，從外周血中分離B細(xì)胞。用溶血噬菌斑分析法選擇并分離出能分泌所需抗體的單個淋巴細(xì)胞。將單個細(xì)胞擴(kuò)增至1X107個以上，用QuickmRNAPurificationKit提取mRNA。以提取的mRNA為模板，合成cDNA鏈。以此cDNA為模板，加入鼠抗體重鏈可變區(qū)(VH)通用引物，輕鏈可變區(qū)(V,)通用引物，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，獲得擴(kuò)增的Vh基因片段和W基因片段。將擴(kuò)增產(chǎn)物在15g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定和分離。用glassmilk回收擴(kuò)增的Vh基因片段和Vl基因片段。與等摩爾嘗試的LimkerPrimerMix混合，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，連接Vh和V,。擴(kuò)增產(chǎn)物分離純化后，獲得特異性單鏈抗體(ScFV)。此ScFV可用于制備檢測所需DNA片。將此擴(kuò)增產(chǎn)物兩端加限制性酶切位點，純化定量后，連接到P"'9載體上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感染大腸桿菌T0P10。經(jīng)藍(lán)白斑篩選及酶切鑒定，篩選出重組質(zhì)粒。在96孔板形成單克隆抗體。用EL'ISA法篩選出效""價最高的單克隆抗體株，大量制備，并從培養(yǎng)上清中提取所需抗體。此抗體可用于制備檢測所需試劑盒。在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式應(yīng)當(dāng)同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。權(quán)利要求1.一種檢測人絨毛膜促性腺激素異構(gòu)體的質(zhì)譜抗體試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括一小管含U9緩沖溶液的質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清，10～30μl；一小管含等量1μg的抗hCG、抗hCGβcf、抗hCG-α及抗hCG-β的磁珠30～50μl；一小管緩沖液300～500μl，該緩沖液為50～100mMPBS，pH值為7.0～7.4；一小管洗脫液10～50μl，該洗脫液為1～5％三氟乙酸的水溶液；一小管能量吸收分子飽和溶液5～10μl，該溶液由能量吸收分子溶解在含30～60％乙腈和0.5～1％三氟乙酸的水溶液中構(gòu)成，上述各小管置于4℃冷藏盒中。2、如權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所述能量吸收分子采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羥基苯甲酸之中的任一種。3、一種制備如權(quán)利要求1所述的質(zhì)譜試劑盒的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟1)含U9緩沖溶液的質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清的制備將男性、女性等量的O型血清稀釋在U9緩沖溶液中制成質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清，并將該稀釋的血清分裝成1030W小管中；其中，血清U9緩沖溶液4:2，所述U9緩沖液為9MUrea，2%CHAPS，50mMTris-HCL,pH9.0;2)制備含抗hCG、抗hCG^cf、抗hCG-"及抗hCG-;9的磁珠將合成的變異的hCG免疫小鼠，待免疫反應(yīng)出現(xiàn)后，從外周血中分離B細(xì)胞，按標(biāo)準(zhǔn)的單克隆抗體的制備方法制備；將購買的蛋白A-磁珠3050W標(biāo)記上等量lPg的抗hCG、hCG^cf、hCG-"及hCG-"抗體；3)將購買的50100mMPBS,pH值為7.07.4緩沖液、15%三氟乙酸的洗脫液分別分裝成300500W小管和10~50W小管；4)將能量吸收分子溶解在3060%乙腈和0.51%三氟乙酸的水溶液中制成能量吸收分子飽和溶液，并分裝成510W小管，該能量吸收分子采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羥基苯甲酸之中的任一種；5)將上述分裝好的各小管置于4'C冷藏盒中。4、如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述能量吸收分子采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二經(jīng)基苯甲酸之中的任一種。5、一種如權(quán)利要l所述試劑盒對異位妊娠體的預(yù)后判斷的應(yīng)用。''6、如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，所述試劑盒對異位妊娠體預(yù)后判斷為；判斷的23570Da蛋白質(zhì)是變異的hCG-"、37580Da蛋白質(zhì)是變異的hCG、10577Da蛋白質(zhì)是變異的hCG^cf、14509Da蛋白質(zhì)是變異的hCG-";該試劑盒依據(jù)幾個特征蛋白峰為10577、14509、23570、37580Da。全文摘要本發(fā)明涉及人絨毛膜促性腺激素異構(gòu)體的質(zhì)譜抗體試劑盒及制備方法，屬于蛋白質(zhì)檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，該試劑盒包括一小管含U9緩沖溶液的質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清；一小管含等量1μg的抗hCG、抗hCGβcf、抗hCG-α及抗hCG-β的磁珠；一小管緩沖液；一小管洗脫液；一小管能量吸收分子飽和溶液，上述各小管置于4℃冷藏盒中。本發(fā)明可用于體外樣品檢測和預(yù)后判斷的質(zhì)譜抗體試劑盒。本方法準(zhǔn)確、方便且快捷。文檔編號G01N33/76GK101303360SQ20081010493公開日2008年11月12日申請日期2008年4月25日優(yōu)先權(quán)日2008年4月25日發(fā)明者洋許申請人:洋許