專(zhuān)利名稱(chēng)：游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位的納米磁微粒化學(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒及其制備和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位的檢測(cè)方法，檢測(cè)用試劑盒以及該試劑盒的制備方法。
背景技術(shù)：
人絨毛膜促性腺激素(HCG)是由胎盤(pán)絨毛膜的合體滋養(yǎng)層產(chǎn)生的一種糖蛋白，由α和β 二個(gè)單位通過(guò)離子鍵和疏水鍵結(jié)合在一起。α亞單位是垂體前葉激素所共有,它與FSH、LH、TSH的α亞單位結(jié)構(gòu)相似。β亞單位的結(jié)構(gòu)與LH等的β亞單位不同，在免疫活性上可予區(qū)別。血中β亞單位大部分以全分子形式存在，游離態(tài)的β亞單位(F-13_HCG)占HCG的I 5%左右。血中游離態(tài)的β亞單位是在受孕后6 8天產(chǎn)生，50 80天達(dá)到高峰，以后平穩(wěn)下降，直至孕18周左右穩(wěn)定于一定濃度。唐氏綜合征又稱(chēng)先天愚型，21-三體綜合征，是最常見(jiàn)的染色體疾病和弱智的病因，新生兒中發(fā)病率約為1/700左右。根據(jù)染色體核型的不同，唐氏綜合征分為單純21三體型、嵌合型和易位型三種類(lèi)型。唐氏綜合征的發(fā)生起源于卵子或精子發(fā)生的減數(shù)分裂過(guò)程中染色體的不分離現(xiàn)象，通常是隨機(jī)發(fā)生的，約95%的不分離現(xiàn)象來(lái)源于母親，僅5%左右發(fā)生在精子發(fā)生期。其結(jié)果是21號(hào)染色體多了一條，多出的一條染色體因劑量效應(yīng)破壞了正常基因組遺傳物質(zhì)間的平衡，導(dǎo)致患兒智力低下，顱面部畸形及特殊面容，肌張力低下，多并發(fā)先天性心臟病，患者白血病的發(fā)病率為普通人群的10-20倍。生活難以自理，患者預(yù)后一般較差，50%左右于5歲前死亡。目前對(duì)唐氏綜合征缺乏有效的治療方法。通過(guò)孕早、中期檢測(cè)孕婦血中ΡΑΡΡ-Α，游離β-HCG，AFP等，結(jié)合B超檢查，可將約90%的唐氏綜合征檢測(cè)出來(lái)。對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)胎兒，通過(guò)絨毛活檢或羊水穿刺或臍血穿刺等技術(shù)作染色體核型分析可以確診，然后流產(chǎn)處理。懷有唐氏綜合征(DS)胎兒的孕婦，一部分人其血清F-P-HCG水平呈強(qiáng)直性升高，平均MOM值為2. 3 2. 4Μ0Μ。F-β-HCG在孕早期和孕中期都處于高水平。妊娠中期DS孕婦血清F- β -HCG濃度比正常至少高2倍。F- β -HCG用于DS風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估，敏感期可從孕早期到孕中期(7 20周)。目前用于檢測(cè)游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位(F-P-HCG)的免疫分析方法主要有酶聯(lián)免疫分析法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法等。酶聯(lián)免疫分析法存在靈敏度低，線性范圍窄、不易實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化等方法學(xué)限制因素。化學(xué)發(fā)光免疫分析法是在酶聯(lián)免疫分析法基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種免疫檢測(cè)技術(shù)，具有靈敏度高、檢測(cè)線性范圍寬、操作簡(jiǎn)便，自動(dòng)化程度高等優(yōu)勢(shì)。目前化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)因其有上述諸多有點(diǎn)得到了廣泛的應(yīng)用。然而，在實(shí)際的免疫檢測(cè)中，由于 待測(cè)樣品中所含的雜質(zhì)成分較多，一定程度上影響了檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性，所以從復(fù)雜的樣品基質(zhì)中快速分離、純化出目的待測(cè)物，是臨床檢驗(yàn)工作者面臨的難題之一。磁微粒免疫檢測(cè)技術(shù)是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作載體，以物理吸附、化學(xué)偶聯(lián)等方法包被上具有特異性親和力的抗體或抗原等各種免疫活性物質(zhì)，具有分離速度快、效率高、可重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單、不影響被分離細(xì)胞或其他生物材料的生物學(xué)性狀和功能等特點(diǎn)，在外加磁場(chǎng)作用下可定向運(yùn)動(dòng)，是的某些特殊成分得以分離、濃集或純化。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒，其能夠以較低的成本制備得到，且能夠?qū)崿F(xiàn)游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位準(zhǔn)確和高精準(zhǔn)地定量測(cè)定。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒的簡(jiǎn)便和低成本的制備方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)方法，該方法不僅準(zhǔn)確性好、靈敏度高，且精密度特別是分析間精密度高，此外該方法成本低。為解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括如下試劑第一試劑含熒光素標(biāo)記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體、pH為7. 0-9. O的緩沖溶液，所述的熒光素標(biāo)記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體的濃度為 O. 5 I μ g/mL ；第二試劑含堿性磷酸酶標(biāo)記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體、pH為7. 0-9. O的緩沖溶液，所述的堿性磷酸酶標(biāo)記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體的濃度為O. 5 I μ g/mL ；磁分離試劑含包被著熒光素抗體的磁微粒的懸浮液。根據(jù)本發(fā)明，所述的堿性磷酸酶標(biāo)記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體由堿性磷酸酶與游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體通過(guò)交聯(lián)劑琥珀酰亞胺基-4-[Ν-馬來(lái)酰亞胺甲基]環(huán)己烷-1-羧化物和2-亞氨基四氫噻吩連接構(gòu)成。根據(jù)本發(fā)明，所述包被有熒光素抗體的磁微粒的制備也是較為容易的，且現(xiàn)有技術(shù)已有成熟的制備工藝可以參照。例如可以通過(guò)常規(guī)的物理吸附或化學(xué)偶聯(lián)包被方式制備，沒(méi)有特別限制。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案該包被有熒光素抗體的磁微粒中，熒光素抗體與磁微粒之間相化學(xué)偶聯(lián)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知曉，本發(fā)明的試劑盒還可以進(jìn)一步包括有其它檢測(cè)所需的試齊U，例如底物溶液。但是諸如底物溶液等其它試劑可以另行購(gòu)買(mǎi)或配制，因此，雖然試劑盒中可以包括這些試劑，但它們對(duì)于本發(fā)明試劑盒來(lái)說(shuō)并非必不可少。本發(fā)明采取的又一技術(shù)方案是一種用于游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒的制備方法，其包括分別制備所述的第一試劑、所述的第二試劑以及所述的磁分離試劑的步驟，其中所述的第二試劑的制備方法如下( I)使游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體與交聯(lián)劑2-亞氨基四氫噻吩在甘氨酸溶液中，室溫靜置反應(yīng)，生成游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體與2-亞氨基四氫噻吩的連接物，于2-8°C下保存?zhèn)溆茫?br> (2)使堿性磷酸酶溶液與交聯(lián)劑琥珀酰亞胺基-4_[N-馬來(lái)酰亞胺甲基]環(huán)己烷-1-羧化物溶液混合，室溫靜置反應(yīng)，將反應(yīng)液通過(guò)G-25凝膠柱除鹽，將收集到的堿性磷酸酶與琥珀酰亞胺基-4- [N-馬來(lái)酰亞胺甲基]環(huán)己烷-1-羧化物的連接物于2-8°C下保存?zhèn)溆?(3)將步驟(I)所得溶液與步驟(2)所得溶液按照游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體與2-亞氨基四氫噻吩的連接物與堿性磷酸酶與琥珀酰亞胺基-4-[N-馬來(lái)酰亞胺甲基]環(huán)己烷-1-羧化物的連接物的摩爾比為1:廣2混合，在2-8°C下反應(yīng)，使生成所述的堿性磷酸酶標(biāo)記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體，反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)液通過(guò)Supperdex200凝膠純化柱純化，選擇合適的pH緩沖液調(diào)整濃度和pH值即得所述的第二試劑。進(jìn)一步地，所述的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體、所述的堿性磷酸酶的純度均大于等于95wt%，且所述堿性磷酸酶的比活性超過(guò)lOOOu/mg，所述堿性磷酸酶的緩沖液的濃度超過(guò)5mg/ml。根據(jù)一個(gè)具體方面，所述的第一試劑的制備方法如下配制含有熒光素的pH為擴(kuò)10的緩沖液，然后按照熒光素與游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體的分子比為2(Γ200:1的比例，將所述含有熒光素的pH為 Γ Ο的緩沖液與游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體混合，室溫靜置反應(yīng)，將反應(yīng)液通過(guò)G-25凝膠柱進(jìn)行分離，除去游離的熒光素，獲得熒光素標(biāo)記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體的溶液，接著用具有適當(dāng)?shù)腜H值的緩沖液調(diào)整濃度和PH，即得所述第一試劑。根據(jù)又一具體方面，所述的磁分離試劑的制備方法如下使含有羧基活性基團(tuán)的磁微粒與熒光素抗體在偶聯(lián)劑的存在下，室溫反應(yīng)2 12小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束，磁分離，去上清，用具有適當(dāng)PH值的緩沖液調(diào)整pH和濃度，即得所述磁分離試劑。優(yōu)選地，所述的磁微粒具有超順磁性，其直徑為O. 5^2微米，每克磁微粒上所帶的羧基活性基團(tuán)的含量不低于 O. 4mmol ;所述的熒光素抗體為單克隆抗體或多克隆抗體，純度大于等于90wt%，稀釋效價(jià)大于1:100萬(wàn)；所述的偶聯(lián)劑為碳二亞胺。本發(fā)明以上所述的緩沖液可以是本領(lǐng)域常用的那些，例如碳酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、TRIS緩沖液。實(shí)際實(shí)施過(guò)程中，可選擇最適合的緩沖液。例如，在第一試劑、第二試劑以及磁分離試劑的制備的最后階段，通常采取含O. 5%牛血清蛋白(BSA)、pH 8.0的O. lmol/L 的 TRIS 緩沖液。本發(fā)明所述的熒光素可以是已知的各種熒光素，常用的有例如異硫氰酸熒光素，四乙基羅丹明，四甲基異硫氰酸羅丹明等。本發(fā)明采取的又一技術(shù)方案是一種定量檢測(cè)血清或血漿樣本中游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位的檢測(cè)方法，該方法是基于磁微粒分離技術(shù)的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)法，所述檢測(cè)方法包括依次進(jìn)行的免疫反應(yīng)步驟、使用磁分離及洗滌設(shè)備對(duì)免疫反應(yīng)的反應(yīng)液進(jìn)行洗滌的步驟以及向洗滌后的反應(yīng)液內(nèi)加入底物溶液并利用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度的步驟，其中，該檢測(cè)方法包括以下步驟(I)、免疫反應(yīng)在檢測(cè)管中加入待測(cè)樣本原液，然后加入第一試劑，混勻，2540°C條件下進(jìn)行第一次溫育；(2)、加入磁分離試劑，混勻，25-40°C條件下進(jìn)行第二次溫育；(3)、多次洗滌；
(4)、加入第二試劑，混勻，25_40°C條件下進(jìn)行第三次溫育；(5)、多次洗滌；(6)、加底物溶液檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度；所述的底物溶液為堿性磷酸酶化學(xué)發(fā)光底物溶液。進(jìn)一步地，所述的第一次溫育的時(shí)間為5_15min，第二次溫育的時(shí)間為3-lOmin，第三次溫育的時(shí)間為5-15min。上述的使用磁分離及洗滌設(shè)備對(duì)免疫反應(yīng)的反應(yīng)液進(jìn)行洗滌的步驟以及向洗滌后的反應(yīng)液內(nèi)加入底物溶液并利用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度的步驟均可參照常規(guī)方法實(shí)施，所用的設(shè)備以及裝置也是常規(guī)的。其中，堿性磷酸酶化學(xué)發(fā)光底物溶液對(duì)于本領(lǐng)域人員來(lái)說(shuō)也是已知的，可商購(gòu)獲得。本發(fā)明的有益效果在于1、采用本發(fā)明的試劑盒以及結(jié)合傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法和設(shè)備就可以實(shí)現(xiàn)游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位準(zhǔn)確，精密的檢測(cè)；2、本發(fā)明的試劑盒中的第一試劑、磁分離試劑均可以通過(guò)成熟、穩(wěn)定的制備工藝制備得到，生產(chǎn)成本低，且由于制備工藝的穩(wěn)定性，試劑盒分析批間差小，檢測(cè)的分析間精密度提高；3、本發(fā)明的試劑盒中的第二試劑的制備方法，能夠有效將游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體與堿性磷酸酶偶聯(lián)，偶聯(lián)效率高，進(jìn)一步降低試劑盒的成本低和確保試劑盒的檢測(cè)效果。

4、本發(fā)明的檢測(cè)方法檢測(cè)的準(zhǔn)確度好，精密度高，靈敏度高，檢測(cè)范圍寬，樣品無(wú)序預(yù)稀釋?zhuān)僮骱?jiǎn)單省時(shí)。與采用進(jìn)口試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的方法相比，本發(fā)明的檢測(cè)方法在成本上具有顯著的優(yōu)勢(shì)。


圖1為采用本發(fā)明游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒的測(cè)試校準(zhǔn)品檢測(cè)相對(duì)發(fā)光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為濃度，單位為ng/mL，縱坐標(biāo)為發(fā)光值。圖2為為本發(fā)明靈敏度測(cè)試中A，B點(diǎn)連點(diǎn)擬合曲線。圖3為本發(fā)明的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒的血清檢測(cè)結(jié)果與PerkinElmer公司試劑盒檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性，橫坐標(biāo)χ為實(shí)施例1制備得的試劑盒樣本測(cè)值，濃度單位為ng/mL,縱坐標(biāo)y為PerkinElmer公司試劑盒樣本測(cè)值,濃度單位為ng/mL。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1、磁分離試劑的制備。材料與儀器磁微粒的懸浮液磁微粒含量5wt%，含羧基(COOH)活性基團(tuán)，每克(g)磁微粒(干重)羧基含量不低于O. 4毫摩爾(mmol)，具有超順磁性，直徑在O. 5-2 μ m之間?？笷ITC抗體可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體，純度應(yīng)超過(guò)90wt%，稀釋效價(jià)應(yīng)超過(guò)1:100萬(wàn)。2-嗎啉乙磺酸(MES)、碳二亞胺(EDC)、TRIS和其他試劑應(yīng)達(dá)到化學(xué)純。操作步驟1、取IOOmg磁微粒的懸浮液，磁分離去上清，用O. 05mol/L, PH4. 5-5MES緩沖液IOml重懸；2、加入2-4mg的抗FITC抗體，室溫混懸30_60min ；3、加入O. 5-lml,新鮮配制的10mg/ml, EDC水溶液,室溫混懸2_12h ；4、磁分離，去·上清，用含質(zhì)量百分比為O. 5%牛血清白蛋白(BSA)pH8. O的O.1mol/L的TRIS緩沖液重懸到lmg/ml，pH8. O，即為磁分離試劑。實(shí)施例2、第一試劑的制備。材料與儀器抗F- β -HCG單克隆抗體，由北京利德曼生化股份有限公司制備，純度超過(guò)95wt%，濃度為2mg/ml，以磷酸鹽緩沖液保存；異硫氰酸熒光素(FITC)，碳酸鈉等試劑應(yīng)達(dá)到化學(xué)純，G-25凝膠純化柱采購(gòu)自GE公司。操作步驟1、用 O. 1-0. 2mol/L PH9. 0-10. O 的碳酸鹽緩沖液配制 O. 5mg/ml 的 FITC 溶液；2、按照抗F-P-HCG抗體與FITC分子摩爾數(shù)比1:20比例在抗體溶液中加入FITC溶液，混合均勻，室溫靜置超過(guò)12h，反應(yīng)生成抗F- β -HCG抗體-FITC連接物；3、將經(jīng)過(guò)步驟2的反應(yīng)液用G-25凝膠柱進(jìn)行分離，除去未反應(yīng)的FITC，獲得抗F- β -HCG抗體-FITC連接物(即FITC標(biāo)記的抗F- β -HCG抗體)的溶液，將該溶液用含質(zhì)量百分比為O. 5%牛血清白蛋白(BSA)PH8. O的O. lmol/L的TRIS緩沖液稀釋到O. 5-1 μ g/ml，pH為7-9，即為第一試劑。實(shí)施例3、第二試劑的制備。材料與儀器抗F-P-HCG單克隆抗體，由北京利德曼生化股份有限公司制備，純度超過(guò)95%，濃度超過(guò)lmg/ml，以磷酸鹽緩沖液保存；堿性磷酸酶純度約為99%，比活性約為1500U/mg，濃度為10mg/ml ；偶聯(lián)劑琥珀酰亞胺基-4-[N-馬來(lái)酰亞胺甲基]環(huán)己烷-1-羧化物(SMCC)，2_亞氨基四氫噻吩(2-1T)購(gòu)自THERMO公司，TRIS等化學(xué)試劑應(yīng)達(dá)到化學(xué)純；AKTA-purifier蛋白純化儀和Supperde x200凝膠純化柱為GE公司產(chǎn)品。操作步驟1、取Img抗FHCG抗體，加入10mg/ml的偶聯(lián)劑2-1T溶液2-4 μ 1，室溫靜置20min，加入0. lmol/L的甘氨酸溶液10 μ 1，室溫靜置5min。用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后抗體，2-8 °C保存?zhèn)溆茫?、取1. 5mg的ALP溶液，加入5mg/ml的SMCC溶液10-20 μ 1，室溫靜置30mi η,用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后抗體，2-8°C保存?zhèn)溆茫?、將上述活化的抗F-β -HCG抗體與活化的ALP混合，2_8°C條件下靜置12_24h，用Supperdex200凝膠純化柱純化偶聯(lián)物，獲得連接物濃溶液，2_8°C保存?zhèn)溆谩?br> 4、將抗體-ALP連接物濃溶液用含質(zhì)量百分比為O. 5%牛血清白蛋白(BSA) PH8. O的O. lmol/L的TRIS緩沖液稀釋到O. 5-1 μ g/ml, pH7_9，即為第二試劑。實(shí)施例4用于游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位定量檢測(cè)的試劑盒該試劑盒包括按照實(shí)施例1方法制備的磁分離試劑50ml ；按照實(shí)施例2方法制備的第一試劑(濃度為O. 75 μ g/ml), 50ml ；按照實(shí)施例3方法制備的第二試劑(濃度為O. 75 μ g/ml), 50ml。實(shí)施例5用于游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位定量檢測(cè)的試劑盒該試劑盒包括按照實(shí)施例1方法制備的磁分離試劑50ml ；按照實(shí)施例2方法制備的第一試劑(濃度為O. 5 μ g/ml), 50ml ；按照實(shí)施例3方法制備的第二試劑(濃度為O. 5 μ g/ml), 50ml。實(shí)施例6采取實(shí)施例4的試劑盒進(jìn)行游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位的定量檢測(cè)(一)檢測(cè)實(shí)施下述檢測(cè)步驟由全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀自動(dòng)完成，也可手工操作完成。1、在檢測(cè)管中加入10 μ I待測(cè)樣本(血清或血漿)原液，然后加入50 μ I第一試劑，混勻，37 ± I °C條件下溫育IOmi η ；2、加入50 μ I磁分離試劑，混勻，37 ± I °C條件下溫育5mi η ；3、使磁微粒在磁場(chǎng)中沉降，去除上清，加入600 μ I的清洗液，去除磁場(chǎng)，震蕩使磁微粒充分混懸。重復(fù)此操作，共操作3次。4、加入100 μ I第二試劑，混勻，37±1°C條件下溫育IOmi η ；5、使磁微粒在磁場(chǎng)中沉降，去除上清，加入600 μ I的清洗液，去除磁場(chǎng)，震蕩使磁微粒充分混懸。重復(fù)此操作，共操作3次。6、將磁微粒在磁場(chǎng)中沉降，去除上清，加入100 μ I的堿性磷酸酶化學(xué)發(fā)光底物溶液(北京阿匹斯生物技術(shù)有限公司APCL-1 )，去除磁場(chǎng)，充分混懸后檢測(cè)I秒內(nèi)相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度值(RLU)，。(二)繪制校準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線參見(jiàn)圖1.(三)靈敏度評(píng)價(jià)檢測(cè)“O”濃度樣本，重復(fù)檢測(cè)20次 ，計(jì)算相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度(RLU)的平均值(M)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，并計(jì)算M+2SD值，根據(jù)零濃度校準(zhǔn)品和相鄰校準(zhǔn)品之間的濃度-RLU進(jìn)行兩點(diǎn)回歸擬合得出一次方程，將M+2SD值帶入上述方程中，求出對(duì)應(yīng)的濃度值，即為最低檢測(cè)限。本方法的靈敏度不大于O. 2ng/mL。其中A點(diǎn)的發(fā)光值參見(jiàn)表1:表I
權(quán)利要求
1.一種游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒，其特征在于，包括如下試劑第一試劑含熒光素標(biāo)記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體、pH為7. 0-9. O的緩沖溶液，所述的熒光素標(biāo)記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體的濃度為O.5 I μ g/mL ；第二試劑含堿性磷酸酶標(biāo)記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體、pH為7.0-9. O的緩沖溶液，所述的堿性磷酸酶標(biāo)記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體的濃度為 O. 5" μ g/mL ；磁分離試劑含包被著熒光素抗體的磁微粒的懸浮液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒，其特征在于所述的堿性磷酸酶標(biāo)記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體由堿性磷酸酶與游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體通過(guò)交聯(lián)劑琥珀酰亞胺基-4-[Ν-馬來(lái)酰亞胺甲基]環(huán)己烷-1-羧化物和2-亞氨基四氫噻吩連接構(gòu)成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒，其特征在于所述的包被著熒光素抗體的磁微粒中，熒光素抗體與磁微粒之間化學(xué)偶聯(lián)。
4.一種如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的試劑盒的制備方法，其包括分別制備所述的第一試劑、所述的第二試劑以及所述的磁分離試劑的步驟，其特征在于所述的第二試劑的制備方法如下(I)使游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體與交聯(lián)劑2-亞氨基四氫噻吩在甘氨酸溶液中，室溫靜置反應(yīng)，生成游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體與2-亞氨基四氫噻吩的連接物，于2-8°C下保存?zhèn)溆茫?2 )使堿性磷酸酶溶液與交聯(lián)劑琥珀酰亞胺基-4- [N-馬來(lái)酰亞胺甲基]環(huán)己烷-1-羧化物溶液混合，室溫靜置反應(yīng)，將反應(yīng)液通過(guò)G-25凝膠柱除鹽，將收集到的堿性磷酸酶與琥珀酰亞胺基-4_[N-馬來(lái)酰亞胺甲基]環(huán)己烷-1-羧化物的連接物于2-8°C下保存?zhèn)溆茫?3)將步驟(I)所得溶液與步驟(2)所得溶液按照游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體與2-亞氨基四氫噻吩的連接物與堿性磷酸酶與琥珀酰亞胺基-4-[Ν-馬來(lái)酰亞胺甲基]環(huán)己烷-1-羧化物的連接物的摩爾比為1:廣2混合，在2-8°C下反應(yīng)，使生成所述的堿性磷酸酶標(biāo)記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體，反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)液通過(guò)Supperdex200凝膠純化柱純化，選擇合適的pH緩沖液調(diào)整濃度和pH值即得所述的第二試劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體、所述的堿性磷酸酶的純度均大于等于95wt%，且所述堿性磷酸酶的比活性超過(guò)1000u/mg,所述堿性磷酸酶的緩沖液的濃度超過(guò)5mg/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的第一試劑的制備方法如下配制含有熒光素的PH為擴(kuò)10的緩沖液，然后按照熒光素與游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體的分子比為2(Γ200:1的比例,將所述含有熒光素的pH為9 10的緩沖液與游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體混合，室溫靜置反應(yīng)，將反應(yīng)液通過(guò)G-25凝膠柱進(jìn)行分離，除去游離的熒光素，獲得熒光素標(biāo)記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體的溶液，接著用具有適當(dāng)?shù)腜H值的緩沖液調(diào)整濃度和pH，即得所述第一試劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的磁分離試劑的制備方法如下使含有羧基活性基團(tuán)的磁微粒與熒光素抗體在偶聯(lián)劑的存在下，室溫反應(yīng)疒12小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束，磁分離，去上清，用具有適當(dāng)PH值的緩沖液調(diào)整pH和濃度，即得所述磁分離試劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于所述的磁微粒具有超順磁性，其直徑為O. 5^2微米，每克磁微粒上所帶的羧基活性基團(tuán)的含量不低于O. 4mmol ;所述的熒光素抗體為單克隆抗體或多克隆抗體，純度大于等于90wt%，稀釋效價(jià)大于1:100萬(wàn)；所述的偶聯(lián)劑為碳二亞胺。
9.一種采用如權(quán)利要求1所述的試劑盒用于定量檢測(cè)血清或血漿樣本中游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位的檢測(cè)方法，該方法是基于磁微粒分離技術(shù)的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)法，所述檢測(cè)方法包括依次進(jìn)行的免疫反應(yīng)步驟、使用磁分離及洗滌設(shè)備對(duì)免疫反應(yīng)的反應(yīng)液進(jìn)行洗滌的步驟以及向洗滌后的反應(yīng)液內(nèi)加入底物溶液并利用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度的步驟，其特征在于，該檢測(cè)方法包括以下步驟(1)、免疫反應(yīng)在檢測(cè)管中加入待測(cè)樣本原液，然后加入第一試劑，混勻，25-40°C條件下進(jìn)行第一次溫育；(2)、加入磁分離試劑，混勻，25-40°C條件下進(jìn)行第二次溫育；(3)、多次洗滌；(4)、加入第二試劑，混勻，25-40°C條件下進(jìn)行第三次溫育；(5)、多次洗滌；(6)、加底物溶液檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度；所述的底物溶液為堿性磷酸酶化學(xué)發(fā)光底物溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的定量檢測(cè)方法，其特征在于所述的第一次溫育的時(shí)間為5_15min,第二次溫育的時(shí)間為3_10min,第三次溫育的時(shí)間為5_15min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒及其制備和檢測(cè)方法，試劑盒包括第一試劑含異硫氰酸熒光素標(biāo)記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體的溶液；第二試劑含堿性磷酸酶標(biāo)記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體的溶液；磁分離試劑含包被著抗異硫氰酸熒光素抗體的磁微粒的懸浮液。本發(fā)明還公開(kāi)了該試劑盒的制備方法和采用該試劑進(jìn)行游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位的檢測(cè)方法。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明準(zhǔn)確性更好、精密度更高、靈敏度更高，而且待測(cè)樣本無(wú)需預(yù)稀釋?zhuān)僮骱?jiǎn)單省時(shí)，檢測(cè)范圍寬，并且成本低。
文檔編號(hào)G01N33/76GK103048475SQ20121055017
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月18日
發(fā)明者于大為, 程曉蕾 申請(qǐng)人:蘇州浩歐博生物醫(yī)藥有限公司