專利名稱：一種生產(chǎn)高純度低聚半乳糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高純度低聚半乳糖的制備方法，具體而言，它涉及巧妙的利用專用樹(shù) 脂和模擬移動(dòng)床技術(shù)從低純度低聚半乳糖的酶轉(zhuǎn)化液中分離制備高純度低聚半乳糖。
背景技術(shù)：
低聚半乳糖(Galacto-Oligosaccharides，G0S)是是一種具有天然屬性的功能性 低聚糖，其分子結(jié)構(gòu)一般是在葡萄糖或乳糖分子上連接2飛個(gè)半乳糖基，即Glu-(Gal)n, (η = 2 5)。在自然界中，動(dòng)物的乳汁中存在微量的G0S，而人母乳中含量較多，嬰兒體內(nèi)的 雙歧桿菌菌群的建立很大程度上依賴母乳中的GOS成分。正因?yàn)槿绱?，低聚半乳糖是在?多功能性低聚糖中令人矚目的一種。低聚半乳糖具有很多益生功能，如促進(jìn)機(jī)體腸道內(nèi)雙 歧桿菌的增殖、結(jié)合吸收外源性病原菌、抑制病原菌和腹瀉、防止便秘、保護(hù)肝臟、降低血清 膽固醇和降低血壓等。商品化的GOS是利用乳糖為原料在生物酶的作用下反應(yīng)生成，所得 的產(chǎn)品為含有GOS的混合物，一般還含有葡萄糖，半乳糖和乳糖，其中主產(chǎn)品低聚半乳糖的 含量都較低。例如Yakult Honsha公司的01igomate-55產(chǎn)品，F(xiàn)rieslandCampina公司的 VivinalGOS 產(chǎn)品，Nissin Sugar 公司的 Cup-Oligo 產(chǎn)品，Clasado 公司的 GOS BiMuno 產(chǎn)品 等，其產(chǎn)品的低聚半乳糖含量都在60 %以內(nèi)。由于低純度的GOS產(chǎn)品中還含有較多的乳糖 會(huì)引起部分人群的乳糖不耐癥，另外其中含有的葡萄糖也影響了糖尿病人使用，這些都使 得其應(yīng)用范圍受到限制。因此，需要生成高純度的GOS產(chǎn)品來(lái)擴(kuò)大其使用范圍。目前生產(chǎn)高純度的GOS產(chǎn)品的技術(shù)有納濾膜法，微生物發(fā)酵法，酶氧化法，和固定 床色譜分離法等。利用納濾膜法提純G0S，通過(guò)選擇合適孔徑的納濾膜，可以部分的去除單 糖(葡萄糖、半乳糖)和二糖(乳糖)以提高GOS產(chǎn)品的純度，但是該方法需要極大量的水 消耗造成了成本高，而且GOS純度很難達(dá)到85 %以上，限制了工業(yè)化應(yīng)用。利用微生物法工藝為利用酵母優(yōu)先代謝葡萄糖的特性來(lái)消耗 去除葡萄糖，但是該方法難以去除乳糖成分，仍然無(wú)法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的高純度GOS生產(chǎn)。利 用酶氧化法是通過(guò)葡萄糖氧化酶把葡萄糖氧化為葡萄糖酸再進(jìn)一步通過(guò)離子交換來(lái)去除， 但它同樣無(wú)法去除乳糖成分，而且葡萄糖氧化酶的昂貴價(jià)格也阻礙了其工業(yè)化應(yīng)用。固定 色譜分離法是利用硅膠或有機(jī)聚合物樹(shù)脂作為填料裝填在一個(gè)色譜柱中，先在頂部注入進(jìn) 料，然后再注入流動(dòng)相，在流動(dòng)相的推動(dòng)下利用不同分子在填料上遷移速度的不同，實(shí)現(xiàn)了 低聚半乳糖和其他成分的分離，從色譜柱底部可以分段收集到各個(gè)組分。但是固定床色譜 分離法的分離效率低，產(chǎn)品純度低，流動(dòng)相消耗大，生產(chǎn)成本高的缺點(diǎn)限制了其工業(yè)化應(yīng) 用。因而，需要尋找更有效更經(jīng)濟(jì)的方法來(lái)生產(chǎn)高純度的GOS產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于尋求一種生產(chǎn)高純度低聚半乳糖的方法，采用連續(xù)高效色譜分 離技術(shù)，得到高純度的低聚半乳糖產(chǎn)品。本發(fā)明的主要技術(shù)方案包括了 1以乳糖作為原料，在β半乳糖苷酶的下生成含有葡萄糖、半乳糖、乳糖和低聚半乳糖的混合物；2合成適合分離低聚半乳糖與葡萄糖、半 乳糖、乳糖等雜糖的特種分離樹(shù)脂；3將含低聚半乳糖和雜糖的混合液，在裝有特種吸附分 離樹(shù)脂的模擬移動(dòng)床色譜分離系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)分離，制得高純度的低聚半乳糖溶液，經(jīng)過(guò)濃縮、 噴霧干燥得到低聚半乳糖產(chǎn)品。分離出來(lái)的雜糖可以返回β半乳糖苷酶的反應(yīng)步驟進(jìn)行 綜合利用。本發(fā)明中，乳糖溶液在β半乳糖苷酶的作用下生成低聚半乳糖混合物，其反應(yīng)方 程式如下
<formula>formula see original document page 5</formula>如將含 300g/L的乳糖溶液經(jīng)過(guò)裝有β半乳糖苷酶的固定化酶反應(yīng)柱，反應(yīng)溫 度為35°C 65°C，反應(yīng)pH為4. 5 6. 5。流出反應(yīng)液中低聚半乳糖的含量一般可以達(dá)到 45%。如將含 400g/L的乳糖溶液經(jīng)過(guò)裝有β半乳糖苷酶的固定化酶反應(yīng)柱，反應(yīng)溫 度為35°C 65°C，反應(yīng)pH為4. 5 6. 5。流出反應(yīng)液中低聚半乳糖的含量一般可以達(dá)到 55%。本發(fā)明中制備的特種吸附分離樹(shù)脂為鈉型或鉀型螯合樹(shù)脂。它以酸性大孔樹(shù)脂作 為載體，將其螯合上金屬離子，利用水溶性大分子金屬吸附劑與金屬離子之間的親和力，將 吸附劑吸附在樹(shù)脂表面，并使用交聯(lián)劑將其固定在酸性大孔樹(shù)脂上，我們利用大分子金屬 吸附劑與各種糖分之間的親和力差別，實(shí)現(xiàn)低聚半乳糖與葡萄糖、半乳糖、乳糖等其他雜糖 之間的完全分離。大孔樹(shù)脂可選用酸性聚苯乙烯大孔樹(shù)脂或聚甲基丙烯酸甲酯類大孔樹(shù)脂；交聯(lián)劑
可選用二乙烯苯、三乙烯苯、二丙烯苯等多烯基交聯(lián)劑。本樹(shù)脂所采用交聯(lián)劑在樹(shù)脂中的含量(W/W)為4% 18% ；最佳為8% 12%。本發(fā)明制備的特種吸附分離樹(shù)脂比一般商業(yè)樹(shù)脂具有更高的物理穩(wěn)定性，磨后圓 球率>99%，樹(shù)脂均一系數(shù)<1.2，適用于80°C左右的長(zhǎng)期生產(chǎn)運(yùn)行。該特種吸附樹(shù)脂對(duì)于 葡萄糖、半乳糖、乳糖等小分子糖分具有很高的吸附量。吸附時(shí)，每克樹(shù)脂至少吸附1克小 分子糖分，一般可以達(dá)到1. 5克的吸附量；解吸時(shí)，每克樹(shù)脂至少解吸0. 8克小分子糖分，一 般可以達(dá)到1.1克的解吸量。本發(fā)明提出的高收率、無(wú)污染的生產(chǎn)高純度低聚半乳糖的模擬移動(dòng)床色譜技術(shù)， 經(jīng)過(guò)酶轉(zhuǎn)化得到的葡萄糖、半乳糖、乳糖和低聚半乳糖混合液，可以直接進(jìn)入模擬移動(dòng)床系 統(tǒng)進(jìn)行分離，得到高純度的低聚半乳糖產(chǎn)品。同時(shí)分離出來(lái)的雜糖可以返回到上游的酶反 應(yīng)步驟進(jìn)行綜合利用，提高整體產(chǎn)品收率。本發(fā)明的模擬移動(dòng)床色譜分離系統(tǒng)中采用了本發(fā)明的特種吸附樹(shù)脂為固定相填料，采用水為洗脫劑，分離時(shí)工作溫度為55°C 75°C，最佳溫度為65°C。整個(gè)系統(tǒng)是連續(xù)進(jìn) 行進(jìn)料和出料操作。通過(guò)β半乳糖苷酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)得到的含有葡萄糖、半乳糖、乳糖和低聚半乳糖的混 合物直接進(jìn)入模擬移動(dòng)床色譜系統(tǒng)，可以得到兩種組分，一種是富含低聚半乳糖(低聚半 乳糖純度80% 95%，一般> 90% )的組分；另一種為富含小分子雜糖(低聚半乳糖純度 4% 20%，一般< 15% )的組分。模擬移動(dòng)床系統(tǒng)由4根或4根以上的色譜柱首位串聯(lián)起來(lái)的一個(gè)閉合系統(tǒng)，每個(gè) 色譜柱都有進(jìn)料口、進(jìn)水口、循環(huán)口、提取液出料口和殘液出料口 ；整個(gè)模擬移動(dòng)床色譜系 統(tǒng)采用夾套保溫，并通過(guò)可編程控制器(PLC)進(jìn)行自動(dòng)控制來(lái)切換進(jìn)料口、進(jìn)水口、循環(huán) 口、提取液出料口和殘液出料口的位置，從而實(shí)現(xiàn)進(jìn)料、進(jìn)水、提取液和殘液同時(shí)連續(xù)運(yùn)行 操作。按照進(jìn)出料口位置，系統(tǒng)中所有的色譜柱可以分為4個(gè)區(qū)帶I區(qū)帶洗脫水入口到雜糖液出口，成為解析區(qū)。II區(qū)帶雜糖液出口到酶轉(zhuǎn)化液入口，成為提取液富集區(qū)。III區(qū)帶酶轉(zhuǎn)化液入口到低聚半乳糖液出口，成為殘液富集區(qū)。IV區(qū)帶低聚半乳糖液出口到洗脫水入口，成為循環(huán)區(qū)。本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)如下1.低聚半乳糖和其他雜糖在此樹(shù)脂上具有非常好的吸 附分離性能，基本實(shí)現(xiàn)低聚半乳糖和其他雜糖之間的完全分離；2.分離出來(lái)的雜糖可以返 回酶異構(gòu)柱作為低聚半乳糖生產(chǎn)的原料，提高了整體收率；3.利用模擬移動(dòng)床色譜技術(shù)進(jìn) 行連續(xù)分離，樹(shù)脂的利用率極高；4.生產(chǎn)成本低，利用模擬移動(dòng)床色譜技術(shù)提純處理1立方 低聚半乳糖進(jìn)料，只需要2、立方水和少量電耗；5.生產(chǎn)過(guò)程中部使用任何化學(xué)品，沒(méi)有任 何污染排放，是綠色的環(huán)保工藝；6.生產(chǎn)過(guò)程完全自動(dòng)化，勞動(dòng)強(qiáng)度低，生產(chǎn)占地少。


圖1為低聚半乳糖生產(chǎn)工藝流程圖。圖2為模擬移動(dòng)床色譜的分區(qū)圖
具體實(shí)施例方式a、酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)低聚半乳糖混合物在乳糖溶液中加入β半乳糖苷酶，經(jīng)過(guò)酶反應(yīng) 把乳糖轉(zhuǎn)化為低聚半乳糖，同時(shí)也產(chǎn)生了部分葡萄糖和半乳糖；其反應(yīng)方程式如下
<formula>formula see original document page 6</formula>
<formula>formula see original document page 6</formula>b、合成樹(shù)脂以酸性大孔樹(shù)脂作為載體，將其螯合上金屬離子，利用水溶性大分子金屬吸附劑與金屬離子之間的親和力，將吸附劑吸附在樹(shù)脂表面，并使用交聯(lián)劑將其固定在酸性大孔樹(shù)脂上，合成適合于分離低聚半乳糖和雜糖的鈉型或鉀型螯合樹(shù)脂，交聯(lián)劑在 酸性大孔樹(shù)脂中的含量為4% 18% ；C、分離提純將得到的酶轉(zhuǎn)化液作為進(jìn)料，通過(guò)裝填有以上述鈉型或鉀型螯合 樹(shù)脂作為固定相吸附劑填料的模擬移動(dòng)床色譜分離系統(tǒng)中，采用水為洗脫劑，分離溫度為 55°C 75°C，利用大分子金屬吸附劑與各種糖分之間的親和力差異，實(shí)現(xiàn)低聚半乳糖與雜 糖之間的完全分離，制得高純度低聚半乳糖溶液，在經(jīng)過(guò)常規(guī)的蒸發(fā)濃縮、噴霧干燥得到高 純度低聚半乳糖產(chǎn)品。在進(jìn)行模擬移動(dòng)床色譜分離時(shí)，連續(xù)進(jìn)行進(jìn)料、出料操作，同時(shí)得到兩種出料組 分一類為低聚半乳糖純度達(dá)到80% 95%的富含低聚半乳糖的組分；另一類為低聚半乳 糖純度< 20%的主要含有雜糖液的組分。在濃度為200 400g/L的乳糖溶液經(jīng)過(guò)裝有β半乳糖苷酶的固定化酶反應(yīng)柱， 反應(yīng)溫度為35°C 65°C，反應(yīng)ρΗ為4. 5 6. 5。流出反應(yīng)液中低聚半乳糖的含量為40% 60%之間。大孔樹(shù)脂為酸性聚苯乙烯大孔樹(shù)脂或聚甲基丙烯酸甲酯類大孔樹(shù)脂；交聯(lián)劑為多 烯基交聯(lián)劑。模擬移動(dòng)床色譜分離系統(tǒng)中所采用的模擬移動(dòng)床裝置是由4根或4根以上的色譜 柱首位串聯(lián)起來(lái)的一個(gè)閉合系統(tǒng)，每個(gè)色譜柱都有進(jìn)料口、進(jìn)水口、循環(huán)口、提取液出料口 和殘液出料口 ；整個(gè)模擬移動(dòng)床色譜系統(tǒng)采用夾套保溫，可以調(diào)節(jié)系統(tǒng)保溫溫度在設(shè)定的 恒定溫度之間。模擬移動(dòng)床色譜分離系統(tǒng)按照進(jìn)出料口位置，系統(tǒng)中所有的色譜柱可以分為4個(gè) 區(qū)帶I區(qū)帶洗脫水入口到雜糖液出口，成為解析區(qū)。II區(qū)帶雜糖液出口到酶轉(zhuǎn)化液入口，成為提取液富集區(qū)。III區(qū)帶酶轉(zhuǎn)化液入口到低聚半乳糖液出口，成為殘液富集區(qū)。IV區(qū)帶低聚半乳糖液出口到洗脫水入口，成為循環(huán)區(qū)。下一步結(jié)合實(shí)施實(shí)例來(lái)進(jìn)一步介紹本發(fā)明工藝。實(shí)施例一進(jìn)料為濃度為300g/L的乳糖溶液經(jīng)過(guò)裝有β半乳糖苷酶的固定化酶反應(yīng)柱，反 應(yīng)溫度為50°C，反應(yīng)ρΗ為5.0。流出的酶轉(zhuǎn)化液中低聚半乳糖的含量為45%，乳糖18%， 半乳糖12%，葡萄糖25%。將此酶轉(zhuǎn)化液通過(guò)模擬移動(dòng)床色譜，模擬移動(dòng)床色譜系統(tǒng)操作 條件如下分離溫度60°C，進(jìn)料流量1升/小時(shí)，洗脫水流量1. 7升/小時(shí)，系統(tǒng)操作壓力 1. 0ΜΡ，進(jìn)料20小時(shí)后達(dá)到穩(wěn)定，得到的出料情況如下1)低聚半乳糖部分干物質(zhì)濃度約13% (體積為進(jìn)料的 1. 1倍)；低聚半乳糖 純度87.2%，乳糖11.0%，半乳糖0.5%，葡萄糖1.0%。2)雜糖部分干物質(zhì)濃度約17% (體積為進(jìn)料的 1.1倍)；低聚半乳糖純度 4.4%,乳糖27.4%,半乳糖23. 1%,葡萄糖48. 0%o實(shí)施例二進(jìn)料為濃度為400g/L的乳糖溶液經(jīng)過(guò)裝有β半乳糖苷酶的固定化酶反應(yīng)柱，反應(yīng)溫度為55°C，反應(yīng)pH為5. 5。流出的酶轉(zhuǎn)化液中低聚半乳糖的含量為56%，乳糖18%，半乳糖4%，葡萄糖22%。將此酶轉(zhuǎn)化液通過(guò)模擬移動(dòng)床色譜，模擬移動(dòng)床色譜系統(tǒng)操作 條件如下分離溫度65°C，進(jìn)料流量1升/小時(shí)，洗脫水流量2. 9升/小時(shí)，系統(tǒng)操作壓力 1. 1MP，進(jìn)料20小時(shí)后達(dá)到穩(wěn)定，得到的出料情況如下1)低聚半乳糖部分干物質(zhì)濃度約14% (體積為進(jìn)料的 2. 8倍)；低聚半乳糖 純度92%，乳糖6. 1%，半乳糖0.3%，葡萄糖1.3%。2)雜糖部分干物質(zhì)濃度約19% (體積為進(jìn)料的 1.2倍)；低聚半乳糖純度 6.7%，乳糖34. 3%,半乳糖9.1%，葡萄糖50. 3%0
權(quán)利要求
一種生產(chǎn)高純度低聚半乳糖的方法，其特征在于，a、酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)低聚半乳糖混合物在乳糖溶液中加入β半乳糖苷酶，經(jīng)過(guò)酶反應(yīng)把乳糖轉(zhuǎn)化為低聚半乳糖，同時(shí)也產(chǎn)生了部分葡萄糖和半乳糖；其反應(yīng)方程式如下b、合成樹(shù)脂以酸性大孔樹(shù)脂作為載體，將其螯合上金屬離子，利用水溶性大分子金屬吸附劑與金屬離子之間的親和力，將吸附劑吸附在樹(shù)脂表面，并使用交聯(lián)劑將其固定在酸性大孔樹(shù)脂上，合成適合于分離低聚半乳糖和雜糖的鈉型或鉀型螯合樹(shù)脂，交聯(lián)劑在酸性大孔樹(shù)脂中的含量為4％～18％；c、分離提純將得到的酶轉(zhuǎn)化液作為進(jìn)料，通過(guò)裝填有以上述鈉型或鉀型螯合樹(shù)脂作為固定相吸附劑填料的模擬移動(dòng)床色譜分離系統(tǒng)中，采用水為洗脫劑，分離溫度為55℃～75℃，利用大分子金屬吸附劑與各種糖分之間的親和力差異，實(shí)現(xiàn)低聚半乳糖與雜糖之間的完全分離，制得高純度低聚半乳糖溶液，在經(jīng)過(guò)常規(guī)的蒸發(fā)濃縮、噴霧干燥得到高純度低聚半乳糖產(chǎn)品。FSA00000058478000011.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述生產(chǎn)高純度低聚半乳糖的方法，其特征在于，在進(jìn)行模擬移動(dòng) 床色譜分離時(shí)，連續(xù)進(jìn)行進(jìn)料、出料操作，同時(shí)得到兩種出料組分一類為低聚半乳糖純度 達(dá)到80%、5%的富含低聚半乳糖的組分；另一類為低聚半乳糖純度<20%的主要含有雜 糖液的組分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述生產(chǎn)高純度低聚半乳糖的方法，其特征在于，在濃度為200 400g/L的乳糖溶液經(jīng)過(guò)裝有0半乳糖苷酶的固定化酶反應(yīng)柱，反應(yīng)溫度為35°C 65°C，反 應(yīng)pH為4. 5 6. 5。流出反應(yīng)液中低聚半乳糖的含量為40% 60%之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述生產(chǎn)高純度低聚半乳糖的方法，其特征在于，大孔樹(shù)脂為酸性 聚苯乙烯大孔樹(shù)脂或聚甲基丙烯酸甲酯類大孔樹(shù)脂；交聯(lián)劑為多烯基交聯(lián)劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述生產(chǎn)高純度低聚半乳糖的方法，其特征在于，模擬移動(dòng)床色譜 分離系統(tǒng)中所采用的模擬移動(dòng)床裝置是由4根或4根以上的色譜柱首位串聯(lián)起來(lái)的一個(gè)閉 合系統(tǒng)，每個(gè)色譜柱都有進(jìn)料口、進(jìn)水口、循環(huán)口、提取液出料口和殘液出料口 ；整個(gè)模擬移 動(dòng)床色譜系統(tǒng)采用夾套保溫，可以調(diào)節(jié)系統(tǒng)保溫溫度在設(shè)定的恒定溫度之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述生產(chǎn)高純度低聚半乳糖的方法，其特征在于，模擬移動(dòng)床色譜 分離系統(tǒng)按照進(jìn)出料口位置，系統(tǒng)中所有的色譜柱可以分為4個(gè)區(qū)帶I區(qū)帶洗脫水入口到雜糖液出口，成為解析區(qū)。11區(qū)帶雜糖液出口到酶轉(zhuǎn)化液入口，成為提取液富集區(qū)。III區(qū)帶酶轉(zhuǎn)化液入口到低聚半乳糖液出口，成為殘液富集區(qū)。IV區(qū)帶低聚半乳糖液出口到洗脫水入口，成為循環(huán)區(qū)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述生產(chǎn)高純度低聚半乳糖的方法，其特征在于，多烯基交聯(lián)劑為 二乙烯苯、三乙烯苯、二丙烯苯。基乙基)銀杏內(nèi)酯B固體口服制劑。
全文摘要
一種生產(chǎn)高純度低聚半乳糖的方法，涉及高純度低聚半乳糖的制備方法。本發(fā)明通過(guò)合成專用樹(shù)脂，利用模擬移動(dòng)床色譜技術(shù)，從低聚半乳糖的酶轉(zhuǎn)化液中分離制備高純度的低聚半乳糖。具體方法是1)以乳糖作為原料，在β半乳糖苷酶的下生產(chǎn)含有葡萄糖、半乳糖、乳糖和低聚半乳糖的混合物。2)再通過(guò)模擬移動(dòng)床色譜系統(tǒng)，在55℃～75℃的操作溫度下，以水作為洗脫劑，使低聚半乳糖和其他成分完全分離，得到富含低聚半乳糖的組分和其他雜糖組分。
文檔編號(hào)C07H3/06GK101831475SQ20101013082
公開(kāi)日2010年9月15日 申請(qǐng)日期2010年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月24日
發(fā)明者方煜宇, 章云 申請(qǐng)人:方煜宇