側(cè)掛天然半乳糖和賴氨酸的陽離子大分子、制備方法及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物功能材料領(lǐng)域。具體設(shè)及到系列側(cè)掛半乳糖和賴氨酸的陽離子大 分子、制備方法及其作為功能基因載體材料的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，具有低細(xì)胞毒性、低免疫原性及高基因輸送性能等優(yōu)點(diǎn)的非病毒載體的開 發(fā)引起了生物功能材料相關(guān)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。目前常用的非病毒載體有聚己締亞胺（PEI)， 聚酷胺胺型樹枝狀聚合物（PAMAM)，聚甲基丙締酸N，N-二甲氨基己醋（PDMAEMA)等，它們的 特點(diǎn)是含有大量的陽離子片段，能和帶有陰離子主鏈的DNA或RNA有效結(jié)合，從而保護(hù)所運(yùn) 輸基因W避免其被體內(nèi)的酶（如面ase等）降解，進(jìn)一步提高基因運(yùn)輸效能。然而，上述聚 合物都是由非天然材料合成得到，其大都具有生物相容性差，毒性高等缺點(diǎn)。因此利用生物 相容性天然產(chǎn)物發(fā)展新型生物功能材料，其對(duì)于材料科學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)中具有重要意義。一 些由天然氨基酸組成的聚合物，如聚賴氨酸，聚苯丙氨酸，聚組氨酸等，與其他非天然的聚 合物相比，其在體外的基因轉(zhuǎn)染效率高，具有很好的生物相容性和低毒性，在本發(fā)明的前期 工作中，已經(jīng)開發(fā)了一系列具有側(cè)掛天然賴氨酸的陽離子聚合物，發(fā)現(xiàn)其在體外能夠作為 高效、低毒的載體在基因轉(zhuǎn)染生物材料方面得到應(yīng)用。
[0003] 然而，迄今為止，人們發(fā)現(xiàn)許多在體外具有高基因轉(zhuǎn)染性能的載體材料在體內(nèi)環(huán) 境中的基因轉(zhuǎn)染效率急劇下降，使得其無法滿足臨床基因治療的實(shí)際需求。其中一個(gè)重要 原因是陽離子載體容易與血清中帶有負(fù)電荷的蛋白發(fā)生非特異性相互作用，導(dǎo)致載體的解 離而無法實(shí)現(xiàn)高效基因轉(zhuǎn)染，該些因素限制了其在臨床基因治療中的實(shí)際應(yīng)用。近年來人 們發(fā)現(xiàn)在陽離子聚合物載體中引入生物相容性的聚己二醇（PEG)組分能夠增加陽離子載 體/基因復(fù)合物在生物介質(zhì)中的穩(wěn)定性，降低納米顆粒表面的正電荷，減少與血液中蛋白 組分的吸附和共聚集，然而，PEG的包覆會(huì)導(dǎo)致較強(qiáng)的電荷屏蔽和體積排斥作用，從而降低 載體/pDNA復(fù)合物的內(nèi)吞能力和轉(zhuǎn)染效率，且已有研究表明PEG可能引起免疫反應(yīng)，在注射 后易被人體循環(huán)系統(tǒng)所清除。為了解決該一問題，很有必要設(shè)計(jì)發(fā)展其它的生物相容性的 親水?dāng)R塊（或片段）來作為PEG的補(bǔ)充材料（或是替代材料），目前，人們發(fā)現(xiàn)一些兩性離 子聚合物和含糖聚合物具有和陽G類似的性能，且不會(huì)產(chǎn)生上述陽G所導(dǎo)致的副作用，很值 得深入研究開發(fā)。其中，含糖聚合物中所采用的糖類化合物來源于天然動(dòng)植物，生物相容性 高，具有很好的親水性W及優(yōu)良的生物降解和代謝性能。直接采用天然陽離子多糖（如殼 聚糖、葡聚糖和環(huán)糊精等）構(gòu)建生物相容性基因載體是近年來基因載體領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)， 然而，天然多糖多具有復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)、分子規(guī)整度較低、也難于實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)、定量的功能化 修飾與改性，使得不同批次之間的產(chǎn)品質(zhì)量難于標(biāo)準(zhǔn)化控制。而且，由于天然多糖基因載體 的結(jié)構(gòu)不能得到精確調(diào)控，因而很難深入闡明其分子結(jié)構(gòu)與材料性能的關(guān)系。上述性能使 得天然多糖基因載體材料的深度的研發(fā)和臨床應(yīng)用受到了一定的制約。
[0004] 綜上所述，發(fā)展制備一類結(jié)構(gòu)規(guī)整、分子量可控的含糖聚合物，非常有利于糖基陽 離子聚合物基因載體材料的進(jìn)一步優(yōu)化和深入研發(fā)，而且很有必要發(fā)展一些操作簡(jiǎn)單，條 件溫和的合成制備方法來制備得到上述糖基陽離子聚合物?；谏鲜鲈颍景l(fā)明中擬W 天然賴氨酸和半乳糖為分子擱塊構(gòu)建功能單體，通過可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移自由基聚合 (RAFT)設(shè)計(jì)合成了一類結(jié)構(gòu)規(guī)整的含有半乳糖和賴氨酸側(cè)基的陽離子聚合物，并將上述聚 合物進(jìn)一步發(fā)展成為一類新型高效、低毒的基因輸送載體材料，特別是期待通過半乳糖親 水基團(tuán)的引入增強(qiáng)該類載體在血清中的穩(wěn)定性，使其初步滿足體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染的要求。該也 是本發(fā)明所致力的目標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種側(cè)掛半乳糖和賴氨酸的水溶性陽離子功能大分 子。
[0006] 本發(fā)明的目的之二在于提供一種側(cè)掛半乳糖和賴氨酸的水溶性陽離子功能大分 子的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的目的之=在于提供一種側(cè)掛半乳糖和賴氨酸的水溶性陽離子功能大分 子作為基因功能載體的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明所提供的一種側(cè)掛半乳糖和賴氨酸的陽離子功能大分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)如通 式（I)所示：
[0009]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一類含有半乳糖和賴氨酸側(cè)基的陽離子聚合物，其具有如下結(jié)構(gòu)通式：
其中，A-表示陰離子：氯離子、溴離子、碘離子、三氟甲磺酸根離子或三氟乙酸根離子； η為含有半乳糖砌塊單體的平均聚合度，為2-50 ;m為含有賴氨酸砌塊單體的平均聚合度， 為10~500。
2. 如權(quán)利要求1所述的一類含有半乳糖和賴氨酸側(cè)基的陽離子聚合物，其特征是所述 的η為2~50 ;所述的m為10~500。
3. 如權(quán)利要求1所述的一類含有半乳糖和賴氨酸側(cè)基的陽離子聚合物的制備方法，其 特征是采用以下步驟獲得： 第一步：將Boc-賴氨酸甲基丙烯酸酯單體
L酮保護(hù)半乳糖 的甲基丙烯酸酯
發(fā)劑偶氮二異丁腈，鏈轉(zhuǎn)移試劑二硫代苯甲酸-(4-氰基戊 酸）酯溶于有機(jī)溶劑中，在l〇_95°C下反應(yīng)10_40h后，蒸餾除去有機(jī)溶劑，純化除掉單體，得 到同時(shí)具有Boc-賴氨酸側(cè)鏈和叉酮保護(hù)半乳糖側(cè)鏈的甲基丙烯酸酯聚合物；通過核磁共 振和凝膠滲透色譜測(cè)試均聚物的分子量和分子量分布；Boc-賴氨酸甲基丙烯酸酯聚合物 的分子量在2千-40萬之間，其通式如下式（II )所示：
其中，Boc表示叔丁氧甲?；?；所述的偶氮二異丁腈，賴氨酸甲基丙烯酸酯單體，叉酮 保護(hù)半乳糖的甲基丙烯酸酯和二硫代苯甲酸-(4-氰基戊酸）的摩爾比為I : 10~5000 : 2 ~500 :1 ~10 ; 第二步：第一步制備得到的聚合物加入有機(jī)酸或無機(jī)酸在10-50°C下反應(yīng)l-5h以去 除保護(hù)基團(tuán)，得到含有半乳糖和賴氨酸側(cè)基的陽離子聚合物，其結(jié)構(gòu)如權(quán)利要求1所示；其 中，第一步制備得到的聚合物和有機(jī)酸或無機(jī)酸的摩爾比為I :1. 5~2. 5。
4. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是所述Boc-賴氨酸甲基丙烯酸酯聚合物的分 子量在8千-30萬之間。
5. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是所述有機(jī)溶劑為二氯甲烷、乙酸乙酯、 1，4-二氧六環(huán)、四氫呋喃、三氯甲烷、二甲基亞砜、N，N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、乙腈、丙 酮、苯或甲苯。
6. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是所述步驟二中使用的有機(jī)或無機(jī)酸是鹽 酸、氫溴酸、氫碘酸、三氟甲磺酸或三氟乙酸。
7. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是所述合成步驟一中的反應(yīng)溫度為40-80°C， 所述合成步驟二中的反應(yīng)溫度為室溫。
8. -種如權(quán)利要求1所述的一類含有半乳糖和賴氨酸側(cè)基的陽離子聚合物用于作為 高效、低毒、耐血清環(huán)境的生物功能材料。
9. 如權(quán)利要求7所述的一類含有半乳糖和賴氨酸側(cè)基的陽離子聚合物的應(yīng)用，其特征 是所述的應(yīng)用指在基因和藥物運(yùn)輸載體領(lǐng)域中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一類側(cè)掛半乳糖和賴氨酸的陽離子聚合物，制備方法及其作為生物功能材料在基因運(yùn)輸中的應(yīng)用。所述的應(yīng)用可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合(RAFT)反應(yīng)來制備陽離子聚合物，條件溫和、易操作、成本低，可制備結(jié)構(gòu)規(guī)整、分子量分布較窄的聚合物，去保護(hù)后可制備得到側(cè)掛半乳糖和賴氨酸的水溶性甲基丙烯酸酯類陽離子聚合物。該系列陽離子聚合物的側(cè)基為天然半乳糖和賴氨酸砌塊，其具有較好的生物相容性。此外，相比于商業(yè)化載體聚乙烯亞胺(bPEI-25k)而言，該系列陽離子聚合物作為基因輸送載體在有血清(10％FBS)存在的條件下具有更高的基因轉(zhuǎn)染效率。因此，該類聚合物在體外基因輸送及基因治療領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，是一類有潛力的臨床基因轉(zhuǎn)染試劑。
【IPC分類】C08F8-00, C08F220-28, C12N15-87, C08F222-22
【公開號(hào)】CN104829786
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510222687
【發(fā)明人】曹阿民, 孫景景, 盛瑞隆, 羅挺, 王昭
【申請(qǐng)人】中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所
【公開日】2015年8月12日
【申請(qǐng)日】2015年5月4日