專利名稱：：一種固相法和液相法結(jié)合制備亮丙瑞林的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于制藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是涉及一種固相法和液相法結(jié)合制備亮丙瑞林的新工藝。
背景技術(shù)：
：亮丙瑞林，制劑中文名稱為醋酸亮丙瑞林、抑那通或者簡稱亮丙瑞林，英文名稱為Leuprorelinacetate、Enanton，Lucrin等，其結(jié)構(gòu)為pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NtiEt分子式<:5必84>116012分子量1209.41CAS登錄號53714-56-0亮丙瑞林屬于GnRH類似物，作用同布舍瑞林。重復(fù)給予大劑量的促黃體生成釋放激素(LH-RH)或其高活性衍生物醋酸亮丙瑞林，在首次給藥后能立即產(chǎn)生一過性的垂體-性腺系統(tǒng)興奮作用(急性作用)，然后抑制垂體生成和釋放促性腺激素。它還進一步抑制卵巢和睪丸對促性腺激素的反應(yīng)，從而降低雌二醇和睪丸酮的生成(慢性作用)。醋酸亮丙瑞林的促黃體生成激素(LH)釋放活性約為LH-RH的100倍，它的抑制垂體-性腺系統(tǒng)功能的作用也強于LH-RH。o、醋酸亮丙瑞林是高活性的LH-RH衍生物，由于它對蛋白分解酶的抵抗力和對LH-RH受體的親和力都比LH-RH強，所以能有效地抑制垂體-性腺系統(tǒng)的功能。此外，醋酸亮丙瑞林又是一種緩釋制劑，它恒定地向血液中釋放醋酸亮丙瑞林，故能有效地降低卵巢和睪丸的反應(yīng)，產(chǎn)生高度有利的垂體-性腺系統(tǒng)的抑制作用。對子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤或絕經(jīng)前乳腺癌患者，每4周1次皮下注射醋酸亮丙瑞林，使血清中雌二醇下降到接近絕經(jīng)期的水平。因此本品有卵巢功能抑制作用，可抑制正常排卵和使月經(jīng)停止。對前列腺癌患者皮下注射醋酸亮丙瑞林，每4周1次，使血清睪丸酮濃度降至去勢水平之下，表明本品有藥理學(xué)的去勢作用。對患有中樞性性早熟的男孩和女孩每4周1次，皮下注射醋酸亮丙瑞林后，血清中促性腺激素的水平降至青春期前的水平，表明對第二性征有進行性抑制作用。亮丙瑞林的適應(yīng)癥為子宮內(nèi)膜異位癥;伴有月經(jīng)過多、下腹痛、腰痛及貧血等的子宮肌瘤；絕經(jīng)前乳腺癌，且雌激素受體陽性患者；前列腺癌；中樞性性早熟癥。臨床主要用于前列腺癌及子宮內(nèi)膜異位癥。亮丙瑞林是1974年由日本武田化工的FujinoMasahiko等人首先發(fā)現(xiàn)促黃體激素釋放激素的九肽酰胺類似物具有很好的活性，并且發(fā)明合成工藝。其先后在日本、德國、美國等國家申請專利，專利號分別為JP19740027442、DE2446005、US4008209等。隨后，又有一些研究機構(gòu)和個人發(fā)表了一些合成工藝，專利號為EP1088555、EP1777232、US5480868、CN1865280等。目前已經(jīng)公布的亮丙瑞林制備工藝都有著一定的缺陷，不能在操作復(fù)雜性、危險性、生產(chǎn)周期、產(chǎn)品總收率、產(chǎn)品成本和污染環(huán)境等方面達到一種較好的結(jié)合；應(yīng)用價值不高。
發(fā)明內(nèi)容6本發(fā)明的目的是提供了一種高收率、低成本、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小、有利于實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的亮丙瑞林的固-液結(jié)合的合成工藝，解決現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案一種固相法和液相法結(jié)合制備亮丙瑞林的方法，其特征是，包括如下步驟1)由Fmoc-Pro-OH和替代度為0.2mmol/g1.2mmol/g的HMPB-AM樹脂為起始原料，得到Fmoc-Pro-HMPB-AM樹脂；2)將Fmoc-Pro-HMPB-AM樹脂采用Fmoc/tBu固相法逐一偶聯(lián)的方式依次連接具有保護基團的氨基酸，合成得到側(cè)鏈全保護亮丙瑞林前體肽-HMPB-AM樹脂；3)對側(cè)鏈全保護亮丙瑞林前體肽-HMPB-AM樹脂進行切割，得到側(cè)鏈全保護亮丙瑞林前體肽；4)對側(cè)鏈全保護亮丙瑞林前體肽經(jīng)過乙胺化，得到側(cè)鏈全保護亮丙瑞林；5)對側(cè)鏈全保護亮丙瑞林經(jīng)過脫側(cè)鏈保護基團的反應(yīng)，獲得亮丙瑞林粗肽；6)對亮丙瑞林粗肽經(jīng)過高壓液相柱分離純化、凍干機凍干得到亮丙瑞林精肽。優(yōu)選的方案是所述HMPB-AM樹脂替代度為0.6mmol/g。更為優(yōu)選的方案是所述保護的Fmoc-Pro-HMPB-AM樹脂，是Fmoc-Pro-OH與HMPB-AM樹脂以有機溶劑作反應(yīng)溶劑，在有機堿的作用下生成「所述有機溶劑是N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，或者是二氯甲烷(DCM)，或者是N-甲基吡咯烷酮(NMP)，或者是二甲基亞砜(DMSO);所述有機堿是N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)，或者是三乙胺(TEA)，或者是N-甲基嗎啡啉(NMM),或者是2，4，6-三甲基吡啶(TMP)。更為優(yōu)選的方案是所述有機溶劑是N，N-二甲基甲酰胺(DMF);所述有機堿是N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)。更為優(yōu)選的方案是所述的具有保護基團的氨基酸釆用Fmoc基團保護，各種氨基酸分別以Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc誦D-Leu-OH、Fmoc誦Tyr-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH和pGlu的形式應(yīng)用。更為優(yōu)選的方案是所述的Fmoc保護基通過20%六氫哌啶的DMF溶液處理來除去。更為優(yōu)選的方案是所述逐一偶聯(lián)時氨基酸相對于合成規(guī)模的投料比為1-6倍；所述逐一偶聯(lián)劑體系是DCC/HOBt，或者是EDC/HOBt，或者是DIC/HOBt，或者是DIC/HOAt，或者是PyBOP/HOBt，或者是PyAOP/HOAt，或者是TBTU/HOBt，或者是HBTU/HOBt，或者是HCTU/HOCt，或者是HATU/HOAt;偶聯(lián)反應(yīng)溶劑是四氫呋喃(THF)，或者是二氧六環(huán)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，或者是二氯甲烷(DCM)，或者是N-甲基吡咯烷酮(NMP)，或者是二甲基亞砜(DMSO);偶聯(lián)反應(yīng)的有機堿是N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)，或者是三乙胺(TEA)，或者是N-甲基嗎啡啉(NMM)，或者是2，4，6-三甲基吡啶(TMP);偶聯(lián)反應(yīng)時間為1-3小時。更為優(yōu)選的方案是所述逐一偶聯(lián)時氨基酸相對于合成規(guī)模的投料比為2倍，偶聯(lián)劑體系是DCC/HOBt，偶聯(lián)反應(yīng)溶劑是二氯甲垸(DCM)，偶聯(lián)反應(yīng)的有機堿是N,N-二異丙基乙胺(DIPEA),偶聯(lián)反應(yīng)時間為2小時。更為優(yōu)選的方案是所述的逐一偶聯(lián)時偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束和脫去Fmoc保護后經(jīng)過KaiserTest檢測。更為優(yōu)選的方案是所述的裂解體系是三氟乙酸的二氯甲烷溶液，或者是三氟乙醇的二氯甲垸溶液。更為優(yōu)選的方案是所述的裂解體系是1%三氟乙酸的二氯甲烷溶液。更為優(yōu)選的方案是所述的對側(cè)鏈全保護亮丙瑞林前體肽進行乙胺化反應(yīng)，乙胺化試劑是乙胺/乙酸乙酯溶液，或者是乙胺/乙醇溶液，或者是乙胺/二氯甲烷溶液，或者是乙胺/四氫呋喃溶液和乙胺鹽酸鹽；偶聯(lián)試劑或者是DCC/HOBt，或者是DIC/HOBt，或者是DIC/HOAt，或者是PyBOP/HOBt，或者是PyAOP/HOAt，或者是TBTU/HOBt，或者是HBTU/HOBt，或者是EDC.HCl/HOBt，或者是HCTU/HOCt，或者是HATU/HOAt;乙胺的用量是相對于亮丙瑞林的全保護肽摩爾數(shù)的l-10倍；乙胺化反應(yīng)的溫度是0-40攝氏度；乙胺化反應(yīng)的時間是12-24小時。更為優(yōu)選的方案是所述的對側(cè)鏈全保護亮丙瑞林前體肽進行乙胺化反應(yīng)，乙胺化試劑是乙胺/乙酸乙酯溶液，偶聯(lián)試劑是DCC/HOBt，乙胺的用量是相對于亮丙瑞林的全保護肽摩爾數(shù)的8倍；乙胺化反應(yīng)的溫度是30攝氏度；乙胺化反應(yīng)的時間是18小時。更為優(yōu)選的方案是所述在對側(cè)鏈全保護亮丙瑞林前體肽進行乙胺化反應(yīng)結(jié)束后，對反應(yīng)液進行后處理時采用萃取方式，順序為1M鹽酸洗、水洗、10%碳酸氫鈉洗、水洗、飽和氯化鈉洗。更為優(yōu)選的方案是所述側(cè)鏈全保護亮丙瑞林粗肽經(jīng)過脫側(cè)鏈保護基團的反應(yīng)，獲得亮丙瑞林粗品的實驗過程中，使用的裂解液體系是三氟乙酸:水(95:5v/v)，或者是三氟乙酸:水:三乙基硅烷(90:5:5v/v)，或者是三氟乙酸:苯甲硫醚:水:苯酚:l，2-乙二硫醇(82.5:5:5:5:2.5v/v)，或者是三氟乙酸:苯甲硫醚:水:苯酚:l，2-乙二硫醇:三異丙基硅烷(82.5:5:5:5:2.5:1v/v)，或者是三氟乙酸:苯甲硫醚:苯甲醚:l，2-乙二硫醇(90:5:3:2v/v);裂解反應(yīng)時間是1-4小時。更為優(yōu)選的方案是所述側(cè)鏈全保護亮丙瑞林粗肽脫側(cè)鏈保護基團的反應(yīng)，使用的裂解液是三氟乙酸.'水:三乙基硅烷(90:5:5v/v)體系，裂解反應(yīng)時間是2小時。更為優(yōu)選的方案是所述亮丙瑞林粗肽經(jīng)過高壓液相柱分離純化、凍干機凍干得到亮丙瑞林精肽，在使用高壓液相柱分離純化粗品的過程中填料采用C18反相填料。與已有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點和有益效果本發(fā)明提供了一種反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小、有利于實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的亮丙瑞林的固-液結(jié)合的合成工藝，具有反應(yīng)操作簡單、后處理容易、原料投入少、成本低、收率髙等特點，具有可觀的經(jīng)濟實用價值，同時在多肽藥物設(shè)計合成領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。圖l是本發(fā)明總的工藝流程圖。具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明說明書和權(quán)利要求書中所使用的縮寫的含義列如表1所示表1縮略詞表Fmoc9-芴甲氧羰基HBTUO-苯并三唑-N，N,N，,N，-四甲基脲鑰六氟磷酸鹽HATU0-C7-偶氮苯并三氮唑-l-氧)-N,N，N，，N，-四甲基脲鎗六氟磷酸鹽TBTUO-(苯并三唑-1-氧)-N，N,N，，N，-四甲基脲鎗六氟硼酸鹽PyBOP(苯并三唑-l—氧)三吡咯烷子基磷鎗六氟磷酸鹽DIC二異丙基碳二亞胺HOBt1-羥基苯并三唑10<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>具體實施例方式實施例lFmoc-Pro-HMPB-AM樹脂的制備采用替代度為0.2mmol/g的HMPB-AM樹脂進行反應(yīng)，得到的Fmoc-Pro-HMPB-AM樹脂檢測替代度為0.15mmol/g，完成同樣摩爾量的生產(chǎn)過程耗費樹脂量大，溶劑量大，不經(jīng)濟且不利于環(huán)保，不宜使用；采用替代度為1.2mmol/g的HMPB-AM樹脂進行反應(yīng)，得到的Fmoc-Pro-HMPB-AM樹脂檢測替代度可達0.87mmol/g，雖然完成同樣摩爾量的生產(chǎn)過程耗費樹脂量小，但因得到的粗肽純度降低30%，使得下游純化收率降低60-70%。本實施例更為優(yōu)選的方案為將HMPB-AM樹脂lll.Og，替代度為0.9mmol/g，加入到固相反應(yīng)柱中，用DMF洗滌1次，用DCM溶脹樹脂30分鐘后，將77.6gFmoc-Pro-OH，加入上述裝有樹脂的反應(yīng)柱中反應(yīng)2小時。反應(yīng)結(jié)束，用DMF洗滌3次，DCM洗3次，用甲醇封閉30分鐘，后用甲醇收縮得到Fmoc-Pro-HMPB-AM樹脂，檢測替代度為0.6mmol/g。實施例2側(cè)鏈全保護亮丙瑞林前體肽-HMPB-AM樹脂的制備稱取100gFmoc-Pro-HMPB-AM樹脂(0.6mmol/g，60mmol)加入反應(yīng)器中，用DMF洗滌一次，用DCM溶脹0.5小時。溶脹結(jié)束，用20%DBLK去除Fmoc保護，后用DMF洗滌4次，DCM洗2次。將77.76gFmoc-Arg(pbf)-OH(120mmol)，24.315gHOBt(180mmo1)，37.8gDCC溶于DCM中(可以加入少量DMF助溶)，加入固相反應(yīng)器中，室溫反應(yīng)2h(反應(yīng)終點以茚三酮法檢測為準(zhǔn))。重復(fù)以上步驟，依次完成Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-Tyr-OH、、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH和pGlu等剩余氨基酸的連接。當(dāng)pGlu偶聯(lián)結(jié)束后，將樹脂用DMF洗滌3次，DCM洗3次，后用甲醇收縮，放置在真空干燥器中干燥過夜。第二天，稱重得到側(cè)鏈全保護亮丙瑞林前體肽-HMPB-AM樹脂201.082g(樹脂增重率99.1%)。實施例3側(cè)鏈全保護亮丙瑞林前體肽-HMPB-AM樹脂的制備稱取1111.lgFmoc-Pro-HMPB-AM樹脂(0.45mmol/g,500mmol)加入反應(yīng)器中，用DMF洗滌一次，用DCM溶脹0.5小時。溶脹結(jié)束，用20XDBLK去除Fmoc保護，后用DMF洗滌4次，DCM洗2次。將6化.8gFmoc-Arg(pbf)陽OH(lOOOmmol),202.7gHOBt(1500mmo1)，568.8gHBTU(1500mmol)溶于DCM中(可以加入少量DMF助溶)，加入固相反應(yīng)器中，接著將523.0ml(3000mmol)DIPEA導(dǎo)入反應(yīng)柱，室溫反應(yīng)2h(反應(yīng)終點以茚三酮法檢測為準(zhǔn))。重復(fù)以上步驟，依次完成Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-Tyr-OH、、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH和pGki等剩余氨基酸的連接。當(dāng)pGhi偶聯(lián)結(jié)束后，將樹脂用DMF洗滌3次，DCM洗3次，后用甲醇收縮，放置在真空干燥器中干燥過夜。第二天，稱重得到側(cè)鏈全保護亮丙瑞林前體肽-HMPB-AM樹脂1921.2g(樹脂增重率95.3%)。實施例4pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(Trt)-Tyr-D-Leu-Leu-Arg(pbf)-Pro-OH的制備(側(cè)鏈全保護亮丙瑞林前體肽的制備)將201.082g側(cè)鏈全保護亮丙瑞林前體肽-HMPB-AM樹脂(60mmo1)加入到3000ml圓底燒瓶中，配制裂解試劑2000ml(三氟乙醇1800ml，DCM200ml)，將裂解試劑倒入樹脂中，室溫反應(yīng)1小時。反應(yīng)結(jié)束，過濾樹脂，收集濾液。用少量DCM洗滌樹脂，合并濾液，將濾液減壓蒸干，并且真空干燥，得到側(cè)鏈全保護亮丙瑞林前體粗肽104.2g(HPLC純度86.5%，收率92.04%，MS1889)。實施例5pGlu-His(Trt)-T卬(Boc)-Ser(Trt)-Tyr-D-Leu-Leu-Arg(pbf)-Pro-OH的制備(側(cè)鏈全保護亮丙瑞林前體肽的制備)將1921.2g側(cè)鏈全保護亮丙瑞林前體肽-HMPB-AM樹脂(500mmo1)加入到30L反應(yīng)釜中，配制裂解試劑300L(三氟乙酸3L，DCM297L)，將裂解試劑倒入樹脂中，室溫反應(yīng)4小時。反應(yīng)結(jié)束，過濾樹脂，收集濾液。用少量DCM洗滌樹脂，合并濾液，將濾液減壓蒸干，并且真空干燥，得到側(cè)鏈全保護亮丙瑞林前體粗肽880.3g(HPLC純度89.7%，收率93.2%，MS1889)。實施例6pGlu-ffis(Trt)-Trp(Boc)-Ser(Trt)-Tyr-D-Leu-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHCH2CH3的制備(側(cè)鏈全保護亮丙瑞林)將104.2g側(cè)鏈全保護亮丙瑞林前體粗肽(55.2mmol)加到2000ml的三口燒瓶中，加入500ml二氯甲烷使其完全溶解。稱取115.9gDCC和74.25gHOBt(552mmo1)加入到上述反應(yīng)瓶中，劇烈攪拌反應(yīng)30min。30min后再反應(yīng)瓶中加入550mllmol/L乙胺的二氯甲烷溶液，室溫反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束，用1M鹽酸洗、水洗、10%碳酸氫鈉洗、水洗、飽和氯化鈉洗，然后用無水硫酸鎂干燥1小時。干燥結(jié)束，過濾濾液濃縮蒸干，減壓干燥得側(cè)鏈全保護亮丙瑞林105.2g(HPLC純度80.5%，收率99.5%，MS1916)。實施例7pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(Trt)-Tyr-D-Leu-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHCH2CH313的制備(側(cè)鏈全保護亮丙瑞林)將880.3g側(cè)鏈全保護亮丙瑞林前體粗肽(466.0mmol)加入到30L的反應(yīng)釜中，加入10LDMF將固體完全溶解。10min后加入969.8gPyBOP(1864mmol)和251.6gHOBt(1864mmo1)，同時加入379.8g乙胺鹽酸鹽，反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)液倒入IOL冰水中，過濾，干燥，稱重得側(cè)鏈全保護亮丙瑞林878.6g(HPLC純度84.2%，收率98.4%，MS1916)。實施例8亮丙瑞林粗肽的制備將19.2g側(cè)鏈全保護亮丙瑞林(10mmo1，純度80.5%)加入到250ml反應(yīng)瓶中，將配制好的裂解試劑200mL(三氟乙酸190ml，水10ml)倒入至上述反應(yīng)瓶中，室溫反應(yīng)2小時。反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)液倒入至2000ml冰乙醚中，洗出大量白色沉淀，離心，洗滌，干燥稱重得亮丙瑞林粗肽11.872g(HPLC純度85.7。/。，收率98.2%,MS1209)。實施例9亮丙瑞林精肽的制備將11.872g亮丙瑞林粗品使用高效液相制備色譜純化，流動相A相0.1。/o-0.30/o磷酸水溶液用三乙胺調(diào)pH至2.0-3.0;B相乙腈和甲醇(V乙腈V甲醇-4:1)混合液。流速70-80ml/min。.檢測波長280nm。梯度B%:12%43%(55min)，收集純度大于98.5%以上餾分，濃縮、凍干得到7.242g亮丙瑞林的精肽(HPLC純度>98.5%，收率61.0%，MS1209)，總收率56.0%。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護范圍。權(quán)利要求1.一種固相法和液相法結(jié)合制備亮丙瑞林的方法，其特征是，包括如下步驟1)由Fmoc-Pro-OH和替代度為0.2mmol/g～1.2mmol/g的HMPB-AM樹脂為起始原料，得到Fmoc-Pro-HMPB-AM樹脂；2)將Fmoc-Pro-HMPB-AM樹脂采用Fmoc/tBu固相法逐一偶聯(lián)的方式依次連接具有保護基團的氨基酸，合成得到側(cè)鏈全保護亮丙瑞林前體肽-HMPB-AM樹脂；3)對側(cè)鏈全保護亮丙瑞林前體肽-HMPB-AM樹脂進行切割，得到側(cè)鏈全保護亮丙瑞林前體肽；4)對側(cè)鏈全保護亮丙瑞林前體肽經(jīng)過乙胺化，得到側(cè)鏈全保護亮丙瑞林；5)對側(cè)鏈全保護亮丙瑞林經(jīng)過脫側(cè)鏈保護基團的反應(yīng)，獲得亮丙瑞林粗肽；6)對亮丙瑞林粗肽經(jīng)過高壓液相柱分離純化、凍干機凍干得到亮丙瑞林精肽。2.如權(quán)利要求1所述固相法和液相法結(jié)合制備亮丙瑞林的方法方法，其特征在于所述HMPB-AM樹脂替代度為0.6mmol/g，所述保護的Fmoc-Pro-HMPB-AM樹脂是Fmoc-Pro-OH與HMPB-AM樹脂以有機溶劑作反應(yīng)溶劑，在有機堿的作用下生成；所述有機溶劑是N，N-二甲基甲酰胺，或者是二氯甲烷，或者是N-甲基吡咯垸酮，或者是二甲基亞砜；所述有機堿是N，N-二異丙基乙胺，或者是三乙胺，或者是N-甲基嗎啡啉，或者是2，4，6-三甲基吡啶。3.如權(quán)利要求1所述固相法和液相法結(jié)合制備亮丙瑞林的方法方法，其特征在于所述的具有保護基團的氨基酸采用Fmoc基團保護，各種氨基酸分別以Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-Tyr隱OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc曙His(Trt)曙OH和pGlu的形式應(yīng)用。所述逐一偶聯(lián)時氨基酸相對于合成規(guī)模的投料比為1-6倍；所述逐一偶聯(lián)劑體系是DCC/HOBt，或者是EDC/HOBt，或者是DIC/HOBt，或者是DIC/HOAt，或者是PyBOP/HOBt，或者是PyAOP/HOAt,或者是TBTU/HOBt，或者是HBTU/HOBt，或者是HCTU/HOCt，或者是HATU/HOAt;偶聯(lián)反應(yīng)溶劑是四氫呋喃，或者是二氧六環(huán)、N，N-二甲基甲酰胺，或者是二氯甲垸，或者是N-甲基吡咯烷酮，或者是二甲基亞砜；偶聯(lián)反應(yīng)的有機堿是N，N-二異丙基乙胺，或者是三乙胺，或者是N-甲基嗎啡啉，或者是2，4，6-三甲基吡啶；偶聯(lián)反應(yīng)時間為1-3小時。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述固相法和液相法結(jié)合制備亮丙瑞林的方法，其特征在于所述的對側(cè)鏈全保護亮丙瑞林前體肽-HMPB-AM樹脂進行切割反應(yīng)中，裂解體系是三氟乙酸的二氯甲烷溶液或三氟乙醇的二氯甲烷溶液。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述固相法和液相法結(jié)合制備亮丙瑞林的方法，其特征在于所述的對側(cè)鏈全保護亮丙瑞林前體肽進行乙胺化反應(yīng)，乙胺化試劑是乙胺/乙酸乙酯溶液，或者是乙胺/乙醇溶液，或者是乙胺/二氯甲烷溶液，或者是乙胺/四氫呋喃溶液和乙胺鹽酸鹽；偶聯(lián)試劑或者是DCC/HOBt，或者是DIC/HOBt，或者是DIC/HOAt，或者是PyBOP/HOBt，或者是PyAOP/HOAt，或者是TBTU/HOBt，或者是HBTU/HOBt，或者是EDCHCl/HOBt，或者是HCTU/HOCt，或者是HATU/HOAt;乙胺的用量是相對于亮丙瑞林的全保護肽摩爾數(shù)的1-10倍；乙胺化反應(yīng)的溫度是0-40攝氏度；乙胺化反應(yīng)的時間是12-24小時；所述在對側(cè)鏈全保護亮丙瑞林前體肽進行乙胺化反應(yīng)結(jié)束后，對反應(yīng)液進行后處理時采用萃取方式，順序為1M鹽酸洗、水洗、10%碳酸氫鈉洗、水洗、飽和氯化鈉洗。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述固相法和液相法結(jié)合制備亮丙瑞林的方法，其特征在于所述側(cè)鏈全保護亮丙瑞林粗肽經(jīng)過脫側(cè)鏈保護基團的反應(yīng)，獲得亮丙瑞林粗品的實驗過程中，使用的裂解液體系是三氟乙酸:水二95:5(v/v)，或者是三氟乙酸:水:三乙基硅垸-90:5:5(v/v)，或者是三氟乙酸:苯甲硫醚:水:苯酚:l，2-乙二硫醇=82.5:5:5:5:2.5(v/v)，或者是三氟乙酸:苯甲硫醚:水:苯酚:l,2-乙二硫醇:三異丙基硅烷=82.5:5:5:5:2.5:1(v/v),或者是三氟乙酸:苯甲硫醚:苯甲醚:l，2-乙二硫醇=90:5:3:2(v/v);裂解反應(yīng)時間是1-4小時。7.如權(quán)利要求l-6任一所述固相法和液相法結(jié)合制備亮丙瑞林的方法，其特征在于所述的脫側(cè)鏈保護基團的反應(yīng)中，F(xiàn)moc保護基通過20。/。六氫哌啶的DMF溶液處理來除去。8.如權(quán)利要求7所述固相法和液相法結(jié)合制備亮丙瑞林的方法，其特征在于所述的逐一偶聯(lián)時偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束和脫去Fmoc保護后經(jīng)過KaiserTest檢測。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述固相法和液相法結(jié)合制備亮丙瑞林的方法，其特征在于所述的高壓液相柱分離純化粗品的過程中填料采用C18反相填料。全文摘要本發(fā)明公開了一種固相法和液相法結(jié)合合成亮丙瑞林的新工藝，包括步驟1)由Fmoc-Pro-OH和HMPB-AM樹脂為起始原料，得到Fmoc-Pro-HMPB-AM樹脂；2)逐一偶聯(lián)合成側(cè)鏈全保護亮丙瑞林前體肽-HMPB-AM樹脂；3)對其進行切割，得到側(cè)鏈全保護亮丙瑞林前體肽；4)對側(cè)鏈全保護亮丙瑞林前體肽乙胺化，得到側(cè)鏈全保護亮丙瑞林；5)對側(cè)鏈全保護亮丙瑞林經(jīng)脫側(cè)鏈保護基團反應(yīng)，獲得亮丙瑞林的粗品；6)亮丙瑞林的粗品經(jīng)過分離純化、凍干得到亮丙瑞林精肽。本發(fā)明具備大規(guī)?；a(chǎn)能力，操作簡易、工藝穩(wěn)定、生產(chǎn)成本低，總收率超過50％，具有極為可觀的經(jīng)濟實用價值和廣泛的應(yīng)用前景。文檔編號C07K7/00GK101538315SQ20091010499公開日2009年9月23日申請日期2009年1月13日優(yōu)先權(quán)日2009年1月13日發(fā)明者建劉,李紅玲,袁建成,馬亞平申請人:深圳市翰宇藥業(yè)有限公司