專利名稱：一次柱層析制備高純度藻膽蛋白的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明提供一種從藍藻和紅藻中同時提取分離高純度藻藍蛋白、藻紅蛋 白和別藻藍蛋白的簡單、快捷的方法。屬于生物工程提取分離技術(shù)領域。
背景技術(shù)：
藻膽蛋白(Phyeobilipmteins， PBP)是存在于某些藻類(主要是紅藻、藍 藻)的藻膽體(Phycobili-somes， PBS)中的一類色素復合蛋白。藻膽體是紅藻 和藍藻所特有的一種超分子捕光色素復合體，通過錨定蛋白固著在類囊體膜 外表面。藻膽蛋白具有強烈的熒光性，發(fā)橙紅色熒光，而其本身則呈紅色、 紫色或藍色等，故為有色多肽。它和連接多肽一起構(gòu)成藻膽體，兩者分別占 藻膽體的80%和20%。按光譜特性藻膽蛋白分四類藻紅蛋白 (Phycoerythrins，PE)，藻藍蛋白(Phycocyanins， PC)，藻紅藍蛋白 (Phycoerythrocyanins， PEC)和別藻藍蛋白(Allophycoeyanins， APC)。藻膽 蛋白是由脫輔基蛋白和藻藍素(開鏈的四吡咯發(fā)色團)通過一個或兩個硫醚 鍵共價連接而成的結(jié)(綴)合蛋白。每種藻膽蛋白由等摩爾量的a和0亞 基構(gòu)成，a亞基的大小約為13kD-20kD， P亞基約為14kD-24kD。藻藍蛋白 的a亞基含i個藻藍素，e亞基含2個藻藍素，而別藻藍蛋白的每個亞基
中皆只有l(wèi)個藻藍素。藻膽蛋白是一種營養(yǎng)豐富的蛋白質(zhì)，其氨基酸組成齊 全，必需氨基酸含量高，占氨基酸總量的37. 42%。它可以幫助調(diào)節(jié)和合成人 體代謝所需要的多種重要酶，還具有明顯的抗氧化、抗炎癥作用，能清除輻 射以及選擇性的抑制加氧酶-2的活性，同時還能調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)，增強免 疫系統(tǒng)功能，提高人體對疾病的抵抗能力，所以藻膽蛋白可以制成食品和藥 品用于醫(yī)療保健；同時，藻膽蛋白也是一種很好的可以取代人工合成色素的 天然色素，用作食品和化妝品的添加劑，不僅可以避免人工色素對人體可能 的副作用，而且藻膽蛋白本身就有極強的保健功能；此外，高純度的藻膽蛋 白又可制成熒光試劑和生化試劑，用于臨床醫(yī)學診斷、免疫化學及生物工程 等研究領域；藻膽蛋白還是一種具有開發(fā)潛力的光敏劑，用于腫瘤的光動力 治療。所以藻膽蛋白的應用范圍廣闊，具有很高的開發(fā)、利用價值。但是， 藻紅蛋白和藻藍蛋白的純度(A62^A28。要達到4. 0以上才能用作生化試劑 和臨床藥物。因此，對藻膽蛋白粗提物進一步分離純化，清除雜蛋白、提高 純度是目前藻膽蛋白開發(fā)利用亟待解決的關(guān)鍵技術(shù)。
已報道的有關(guān)制備藻膽蛋白的專利技術(shù)都是從螺旋藻中提取單一的藻 藍蛋白或是藻藍蛋白和別藻藍蛋白的混合物，并且分離技術(shù)也尚存在一些缺 陷工藝簡單的，制得的藻膽蛋白純度低；產(chǎn)物純度高者，工藝復雜，得率 亦不高。例如中國專利CN1106414A和CN1130028A介紹了從螺旋藻中分離 藻藍蛋白的方法，工藝簡單，但所得藻藍蛋白純度極低；中國專利CN 101003565A公布了螺旋藻中同時制備藻藍蛋白和別藻藍蛋白的方法，但得到 的藻藍蛋白和別藻藍蛋白純度低，僅能作為食品添加劑；中國專利 CN00117512. 2介紹了以新鮮鈍頂螺旋藻為原料制備高純度藻藍蛋白的方法， 但需要經(jīng)過四次柱層析，操作繁瑣，提取率低。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有的高純度藻膽蛋白制備方法復雜、生產(chǎn)成本過高、無法大量制 備等缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種簡單有效的適合大量制備高純度藻紅 蛋白、藻藍蛋白和別藻藍蛋白的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種從藍藻和紅藻中分別制備藻藍 蛋白、藻紅蛋白和別藻藍蛋白的技術(shù)，其方法簡單、快捷、高效，運行成本 低，所得的藻藍蛋白、藻紅蛋白和別藻藍蛋白具有較高的提取率、純度和生 物活性，原料既可采用鮮藻也可采用干藻粉，有效地解決了藻類資源利用的 問題。
解決本發(fā)明的技術(shù)問題所采用的方案如下步驟(1)粗藻膽蛋白的制備 和初步純化，使純度達到A620/A280〉2. 0; (2)羥基磷灰石柱層析；(3)分別洗 脫分離藻紅蛋白、藻藍蛋白和別藻藍蛋白；(4)洗脫液的脫鹽，冷凍干燥， 最終獲得高純度和高提取率的藻紅蛋白、藻藍蛋白和別藻藍蛋白。
所述的方案，步驟1中，對于微藻的細胞破壁，采用pH二7的濃度范圍 在0. 02 0. 5M的磷酸緩沖液(PBS)作提取劑，藻粉或鮮藻與磷酸緩沖液的固液比為1:1 1: 10，攪拌均勻后，置-10'C至-2(TC下冷凍一定時間后，室 溫融解，如此反復凍融4-6次；對于大型海藻的細胞破壁，以10000-12000 轉(zhuǎn)/分組織搗碎機搗碎。細胞破壁并加入提取劑后以轉(zhuǎn)速4800-10000r/min 離心10-30min，取上層清液，加入20 60%硫酸銨分級多次鹽析，以轉(zhuǎn)速 4800-10000r/min離心10-30min，得藍色沉淀即為已初步純化的藻藍粗提物， 然后透析脫鹽，得到純度在2. 0以上的藻膽蛋白。
所述的方案，步驟2中羥基磷灰石采用如下方法制備在適當?shù)臄嚢?下，以5-15 mL/min的流速，將等量的0. 05-2 MCaCls和酤2朋04溶液加到容 器中，加完后靜置沉淀，傾去上清液，以自來水洗滌沉淀。在沉淀中加入40% NaOH溶液80'C水浴2h后，以同溫度自來水洗至中性，再加入0. 001-0. OIM， pH二7.0的磷酸緩沖液80'C下水浴lh，冷卻后傾去上清液即可裝柱，以 0. 001-0. 01M的磷酸緩沖液平衡。
所述的方案，步驟2中，將羥基磷灰石加到層析柱內(nèi)，觀察到柱底有少 量羥基磷灰石沉積時打開柱開關(guān)，繼續(xù)裝柱，使之自然沉降，直至達到所需 的高度為止。羥基磯灰石沉積后，將多余的緩沖液放出，使液面剛好與柱床 表面一致，藻膽蛋白粗提液加入量約為柱床體積的1/10。
所述的方案，步驟3中，待藻膽蛋白粗提物中的蛋白被完全吸附后，用 0. 005 0. 45M的磷酸緩沖液(含0. 1 0. 5M氯化鈉)梯度洗脫，分別收集藻 紅蛋白、藻藍蛋白和別藻藍蛋白的洗脫液。
所述的方案，步驟4中，將收集的藻紅蛋白、藻藍蛋白和別藻藍蛋白的 洗脫液透析脫鹽，最后冷凍干燥，即獲得高純度的藻紅蛋白、藻藍蛋白和別 藻藍蛋白粉末。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，主要具有以下優(yōu)點
1、 按流程微藻或大型藻^細胞破碎">鹽溶^鹽析">透析"》離心(除
變性蛋白)">粗藻膽蛋白">冷凍干燥，粗藻藍的純度已達到藥品級(A62。/A2so
>2.0)要求，提取率和純度顯著地得到提高。
2、 自制的柱層析用羥基磷灰石，生產(chǎn)成本低，粒度適中，分離純化藻 膽蛋白效率高，適用于大規(guī)模工業(yè)化應用。
3、 經(jīng)硫酸銨分級鹽析后的粗藻膽蛋白，僅一次羥基磷灰石柱層析可同時獲得藻紅蛋白(A測/A280〉5.0)、藻藍蛋白(A620/A28?！?. 0)和別藻藍蛋白 (A650/A280〉4.0)，均高于生化試劑級的純度要求，此方法簡單方便，減少了 多次層析的繁瑣操作，避免了產(chǎn)品損失。
4、制備藻膽蛋白的原料可以是藍藻或紅藻，也可以是鮮藻或干藻粉， 有效地解決藻類資源的利用和高值化問題。
具體實施例方式
實施實例1
1、 藻膽蛋白粗提物的制備
取產(chǎn)于海南三亞的鈍頂螺旋藻干粉，用pH二7， 0. 02 0. 5M的磷酸緩沖
液作提取劑，藻粉與磷酸緩沖液的固液比為1: 10，攪拌均勻后冷凍一定時 間，室溫融解，如此反復凍融數(shù)次，然后以4800r/min轉(zhuǎn)速離心10niin，取 其上清液，加入20% 60%硫酸銨分四次鹽溶、鹽析、離心，得藍色沉淀即 為藻藍粗提物，透析脫鹽后，得到純度為A63o/A28。二2.06的藻膽蛋白。
2、 羥基磷灰石的制備
(1) 溶液的配制分別配制0.01M， pH二7. 0的磷酸緩沖液，1MCaCl2和 1MNa2HP04溶液。
(2) 制備羥基磷灰石以12 mL/min的滴加速度將500mL 1MCaCl2溶液 和500mLlMNa3HP0,溶液加到燒杯中并攪拌，滴加完畢后，靜止磷酸氫 鈣沉淀。傾去上清液，以約3L自來水洗滌沉淀，加入25mL 40% NaOH 液80'C水浴2h，靜止后的沉淀以同溫度自來水洗至中性。
(3)平衡羥基磷灰石加0.01mol/L， pH二7. 0的磷酸緩沖液8CTC下水浴 lh，靜止冷卻后傾去上清液即可裝柱，以0. 01mol/L的磷酸緩沖液平 衡。
3、 藻藍蛋白和別藻藍蛋白的分離純化 將羥基磷灰石加到層析柱內(nèi)，觀察到柱底有少量羥基磷灰石沉積時打開
柱開關(guān)，繼續(xù)裝柱，使之自然沉降，直至達到所需的高度為止。羥基磷灰石 沉積后，將多余的緩沖液放出，使液面剛好與柱床表面一致。加藻膽蛋白粗 提物，所加粗提液的量約為柱床體積的1/10，待粗提物中的蛋白被完全吸附 后，用0.005、 0.01、 0.02、 0.05、 0.1、 0.2、 0.3、 0. 4M磷酸緩沖液(含 0.2M氯化鈉)梯度洗脫，分別收集藻藍蛋白和別藻藍蛋白的洗脫液。收集的
藻藍蛋白和別藻藍蛋白的洗脫液透析脫鹽，最后冷凍干燥，得藻藍蛋白(A620/A280=5.05)和別藻藍蛋白(A650/A280=4.13)。
實施實例2
1、 藻膽蛋白粗提物的制備
取產(chǎn)于廣東湛江的新鮮魚腥藻，加入磷酸緩沖液作提取劑，固液比為 1:6，以實施實例1同樣步驟方法制備藻膽蛋白粗提物，粗提物純度達A620/A280=2.19。
2、 羥基磷灰石的制備
(1) 溶液的配制分別配制0.01M，pH=7. 0的磷酸緩沖液，1MCaCl2和1MNa2HP04溶液。
(2) 制備羥基磷灰石以12 mL/min的滴加速度將500mL 1MCaCl2溶液和500mLlMNa3HP04溶液加到燒杯中并攪拌，滴加完畢后，靜止磷酸氣鈣沉淀。傾去上清液，以約3L自來水洗漆沉淀，加入25mL 40% NaOH 液80℃水浴2h，靜止后的沉淀以同溫度自來水洗至中性。
(3)平衡羥基磷灰石加0. 01mol/L， pH=7.0的磷酸緩沖液80℃下水浴lh，靜止冷卻后傾去上清液即可裝柱，以0. Olmol/L的磷酸緩沖液平衡。
3、 藻藍蛋白和別藻藍蛋白的分離純化
將羥基磷灰石加到層析柱內(nèi)，觀察到柱底有少量羥基磷灰石沉積時打開 柱開關(guān)，繼續(xù)裝柱，使之自然沉降，直至達到所需的高度為止。羥基磷灰石沉積后，將多余的緩沖液放出，使液面剛好與柱床表面一致。加藻膽蛋白粗提液的量約為柱床體積的1/10，待粗提物中的蛋白被完全吸附后，用0. 005、0. 01、 0.02、 0.05、 0.1、 0.2、 0.3、 0. 4M磷酸緩沖液(含O. 2M氯化鈉)梯度洗脫，分別收集藻藍蛋白和別藻藍蛋白的洗脫液。收集的藻藍蛋白和別藻藍蛋白的洗脫液透析脫鹽，最后冷凍干燥，得藻藍蛋白(A620/A280=5.36)和 別藻藍蛋白(A650/A280=4.03)。
實施實例3
1、 藻膽蛋白粗提物的制備
取產(chǎn)于廣東汕頭的新鮮壇紫菜，以12000轉(zhuǎn)/分組織搗碎機搗碎。細胞破壁并加入提取劑后以轉(zhuǎn)速4800r/min離心20min，取上層清液，加入20 60 %硫酸銨分級多次鹽析，以轉(zhuǎn)速10000r/min離心min，沉淀即為藻膽蛋白粗 提物，然后透析脫鹽，得到純度A62。/A^2.02的藻膽蛋白。
2、羥基磷灰石的制備
(1) 溶液的配制分別配制O.OIM， pH=7.0的磷酸緩沖液，1MCaCl2和 l麗a2HP0,溶液。
(2) 制備羥基磷灰石以12 mL/min的滴加速度將500mL 1MCaCl2溶液 和500mL l麗a3HP04溶液加到燒杯中并攪拌，滴加完畢后，靜止磷酸氫鈣 沉淀。傾去上清液，以約3L自來水洗滌沉淀，加入25mL 40% NaOH液80 t:水浴2h，靜止后的沉淀以同溫度自來水洗至中性。
(3)平衡羥基磷灰石加0. 01mol/L， pH二7.0的磷酸緩沖液80。C下水浴 lh，靜止冷卻后傾去上清液即可裝柱，以0. Olmol/L的磷酸緩沖液平
3藻紅蛋白、藻藍蛋白和別藻藍蛋白的分離純化
將羥基磷灰石加到層析柱內(nèi)，觀察到柱底有少量羥基磷灰石沉積時打開 柱開關(guān)，繼續(xù)裝柱，使之自然沉降，直至達到所需的高度為止。羥基磷灰石 沉積后，將多余的緩沖液放出，使液面剛好與柱床表面一致。藻膽蛋白粗提 液加入量約為柱床體積的1/10，待粗提物中的蛋白被完全吸附后，用0. 005、 0.01、 0.02、 0.05、 0.1、 0.15、 0.2、 0.25、 0. 3M磷酸緩沖液(含O. 2M氯 化鈉)梯度洗脫，分別收集藻紅蛋白、藻藍蛋白和別藻藍蛋白的洗脫液。將 收集的三種藻膽蛋白洗脫液透析脫鹽，最后冷凍干燥，得藻紅蛋白 (WA加:5. 14)、藻藍蛋白(A62。/A瀏二5.38)和別藻藍蛋白(iWA欲:4. 20)。
權(quán)利要求
1、一次柱層析制備高純度藻膽蛋白的方法，其特征在于采用pH＝7濃度范圍在0.02～0.5M的磷酸緩沖液作提取劑，將藻細胞破碎后，離心分離，去除沉淀，收集上清液，用20％～60％硫酸銨分級多次鹽析后收集藻膽蛋白沉淀，沉淀溶解于磷酸鹽緩沖液后經(jīng)一次羥基磷灰石柱層析，使用濃度范圍為0.005～0.45M的磷酸緩沖液，含0.1～0.5M氯化鈉梯度洗脫，控制流速在1～15mL/min，收集各組分洗脫液，冷凍干燥，得到純度A620nm/A280nm＞5.0的藻紅蛋白、藻藍蛋白和A650nm/A280nm＞4.0的別藻藍蛋白。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一次柱層析制備高純度藻膽蛋白的方法，其 特征在于藻類細胞破碎并加入提取劑后以4800r/min轉(zhuǎn)速離心10 30min， 棄沉淀取上清液，以20% 60%的硫酸銨分級多次鹽析，透析脫鹽，得純度A620nyA2^〉2.0的藻膽蛋白。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一次柱層析制備高純度藻膽蛋白的方法，其 特征在于，羥基磷灰石采用如下方法制備在適當?shù)臄嚢柘拢?-15mL/min 的流速，將等量的0.05-2 M的CaCl2和Na2HP04溶液加到容器中，加完后靜 置沉淀，傾去上清液，以自來水洗漆沉淀，在沉淀中加入4WNaOH溶液80'C 水浴2h后，以同溫度自來水洗至中性，再加入0. 001-0. 01 M， pH^7.0的磷 酸緩沖液80。C下水浴lh，冷卻后傾去上清液即可裝柱，以0. 001-0. 01 M的 磷酸緩沖液平衡。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的羥基磷灰石的制備，其特征在于羥基磷灰石 的顆粒直徑?jīng)Q定柱層析分離藻膽蛋白的純度，CaCl2和Na2HP04溶液的濃度越 低，顆粒越大，反應時的最宜濃度為0. 05-2 M.。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一次柱層析制備高純度藻膽蛋白的方法，其 特征在于在羥基磷灰石柱層析時，藻膽蛋白粗提液加入量約為柱床體積的 1/10，用濃度范圍為0. 005 0. 45 M的磷酸緩沖液，含0. 1 0. 5 M氯化鈉 多級梯度洗脫，流速控制在1 15mL/min 。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一次柱層析制備高純度藻膽蛋白的方法，其 特征在于，將洗脫收集所得的藻紅蛋白、藻藍蛋白和別藻藍蛋白脫鹽、冷凍 干燥，可使藻膽蛋白得到進一步的純化，藻膽蛋白容易變性，結(jié)晶后的固體 更利于保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及從藻類中同時制備高純度藻紅蛋白、藻藍蛋白和別藻藍蛋白的方法，屬于生物工程提取分離技術(shù)。以紅藻或藍藻為原料，用磷酸緩沖液為提取劑，將藻細胞破碎后，經(jīng)硫酸銨分級鹽溶、鹽析、透析后得藻膽蛋白粗提物。粗提物經(jīng)一次羥基磷灰石柱層析，磷酸鹽緩沖液梯度洗脫，冷凍干燥，得到高純度的藻紅蛋白、藻藍蛋白和別藻藍蛋白。本發(fā)明前期采用有效的方法制備的藻膽蛋白粗提物，純度達到藥品級標準(A₆₂₀/A₂₈₀＞2.0)，從而簡化了后續(xù)的純化步驟，只需一次柱層析即可分別得到高純度的藻紅蛋白、藻藍蛋白和別藻藍蛋白。本方法從鮮藻和干藻中提取高純度藻膽蛋白，工藝流程簡單，生產(chǎn)成本低，蛋白得率高，適合大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C07K1/14GK101343310SQ20081013412
公開日2009年1月14日 申請日期2008年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月16日
發(fā)明者馮亞非, 李先文, 溫燕梅, 部音利 申請人:廣東海洋大學