專利名稱：麥冬皂苷d在制備調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡基因藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及麥冬皂苷D在制藥中的新用途，具體地說是涉及麥冬皂苷D在制備調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞周期基因藥物中的應(yīng)用，屬中藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
1.麥冬通過保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞來完成養(yǎng)陰行血之功效麥冬為臨床滋養(yǎng)陰液的常用之品，是養(yǎng)陰生津的代表藥物之一。麥冬，百合科植物麥冬Ophiogon japonicus(Thumb.)Ker-Gawl.的干燥塊根。主要含多種糖甙麥門冬皂苷B、D，23，24二羥基羅斯考皂，麥冬甙元-3-O-a-L-吡喃鼠李糖基(1-2)-β-D-吡喃葡萄糖甙，甲基麥冬黃烷酮A、B，麥冬黃烷酮A、B，6-醛基異麥冬黃烷酮A、B，麥冬甙元，丙三醇以及β-谷甾醇、豆甾醇。另含揮發(fā)油，從中分得長葉烯、α-廣藿香烯、β-廣藿香烯、香附子烯、愈創(chuàng)奧烯、α-律草烯、樟腦、芳樟醇等成分。麥冬始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味甘、微苦，性微寒，歸肺、胃、心經(jīng)。具有養(yǎng)陰生津、潤肺清心的功效。
前期研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)陰代表中藥麥冬的藥物血清胚層有效部位群/組分/成分，具有不同程度的保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，其中正丁醇部位的藥效作用更為顯著，以標(biāo)準(zhǔn)品麥冬皂苷D為對(duì)照進(jìn)行高效液相分析發(fā)現(xiàn)，其中含有麥冬皂苷D成分。
2.麥冬皂苷D的研究進(jìn)展沿階草屬麥冬主產(chǎn)于四川綿陽，三臺(tái)和浙江慈溪，蕭山等地。杭麥冬與川麥冬的總皂苷的含量差異與栽培年限相關(guān)，杭麥冬生長周期為2～3年，川麥冬的栽培期為1年。不同產(chǎn)地麥冬的單體成分麥冬皂苷B、D含量也有較大差別，杭麥冬主含麥冬皂苷B、含少量皂苷D；而川麥冬主含麥冬皂苷D、含少量皂苷B。
研究發(fā)現(xiàn)麥冬皂苷D可顯著抑制靜脈血栓模型大鼠早期外周血中性粒細(xì)胞活化、粘附；減輕血栓重量；降低血清sICAM-1含量；其副作用低；麥冬皂苷D還可下調(diào)大鼠靜脈血栓部位TF蛋白表達(dá)，并抑制MAPKp38和JNK磷酸化，提示麥冬皂苷D可通過影響上述信號(hào)通路，降低炎癥反應(yīng)，抑制血栓形成。另麥冬皂苷有顯著性的抗炎作用，魯斯可皂苷元和麥冬皂苷D為其中的兩種活性成分。
同種不同產(chǎn)地樣品中麥冬皂苷D的含量有較大差別，浙江產(chǎn)麥冬含量較低，四川產(chǎn)麥冬含量較高。對(duì)浙江產(chǎn)麥冬、四川產(chǎn)麥冬不同批次樣品測(cè)定，發(fā)現(xiàn)麥冬皂苷D的含量差別較大，且同一產(chǎn)地浙江產(chǎn)麥冬中麥冬皂苷D的含量相差更大。生長年限對(duì)麥冬皂苷D的含量有一定的影響，年限長，含量略有增加。因此麥冬皂苷D含量的高低僅僅可作為川麥冬質(zhì)量指標(biāo)，而不適合作為浙麥冬質(zhì)量的指標(biāo)。
由于皂苷為一類極性較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化合物，它無紫外吸收，無專一顯色劑，再加上麥冬皂苷測(cè)定經(jīng)常受糖的干擾，若采用紫外檢測(cè)末端吸收法，則靈敏度低，且有干擾峰，無法使用。因此，我們采用比色法測(cè)定麥冬總皂苷含量為0.2855％，利用HPLC-ELSD法測(cè)定麥冬皂苷D的含量為0.03229％。為進(jìn)一步獲取其內(nèi)在成分的信息，我們進(jìn)行了ESI-TOF-MS測(cè)試，以ESI正離子為麥冬皂苷主要電離方式，乙腈-水梯度洗脫，205nm為檢測(cè)波長提取紫外色譜圖，確定35.52min為麥冬皂苷D，其裂解方式為先脫去與巖藻糖(1→2)連接的鼠李糖及(1→3)連接的木糖，后脫去巖藻糖。采用兩種測(cè)試方法全面綜合分析麥冬皂苷D。
3.麥冬皂苷D的提取分離取5~10目麥冬藥粉，加10倍量70％乙醇，熱回流提取3次，每次2h。合并提取液，減壓濃縮至無醇味。然后，將其溶于1000mL水中，用3倍量乙酸乙酯振搖提取3次，得到乙酸乙酯提取物和水層。將水層繼續(xù)用3倍量正丁醇振搖提取3次，得到正丁醇提取物和水層，合并正丁醇液，用0.1mol/L NaOH振搖提取2次，棄去0.1mol/L NaOH。將正丁醇提取物進(jìn)行大孔樹脂柱洗脫，依次用水、10％乙醇、30％乙醇、60％乙醇、95％乙醇和乙醇梯度洗脫，分別得到相應(yīng)的洗脫物。60％乙醇洗脫物經(jīng)硅膠柱色譜，水飽和正丁醇洗脫，得到麥冬皂苷D。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供麥冬皂苷D在制藥中的新用途，具體地說是提供麥冬皂苷D在制備調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡基因藥物中的應(yīng)用。
保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞是防治心腦血管病癥的重要環(huán)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell，簡稱VEC)能合成多種血管活性物質(zhì)，對(duì)血管的舒縮功能與血液的流動(dòng)性有著不可替代的調(diào)節(jié)作用。血管內(nèi)皮并非單純的襯里，它有著活躍的生理功能。如對(duì)凝血和抗凝；纖溶抗纖溶；血小板聚集和抗聚集；白細(xì)胞粘附和抗粘附；血管舒縮以及平滑肌細(xì)胞間的調(diào)控(促增殖和抗增殖)都處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，一旦受到損傷則失去平衡，有的學(xué)者稱之為內(nèi)皮功能障礙(Endothelial dysfunction)，是促進(jìn)形成早期動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)因素，也是目前研究的熱點(diǎn)。VEC生理功能的動(dòng)態(tài)平衡是維持血行正常的重要條件。因此，當(dāng)VEC受到損傷時(shí)，不僅自身的生理功能被破壞，而且還會(huì)激活多種凝血和促凝因子，致使血液成分改變和粘度增高，導(dǎo)致血液速度減慢或出現(xiàn)旋渦，從而易于產(chǎn)生血瘀。VEC可因諸多因素受損，主要包括自由基、炎癥介質(zhì)、內(nèi)毒素等。這些致病因素作用于VEC，可直接加速其凋亡而引起功能失衡，最終引起促栓作用形成微血栓而引發(fā)、加重心腦血管疾病?？梢?，VEC損傷心腦血管疾病中占有非常重要的地位。所以改善和保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)及功能的完整性，是預(yù)防和治療心腦血管疾病的重要著眼點(diǎn)。
本發(fā)明運(yùn)用基因芯片技術(shù)，將細(xì)胞凋亡基因芯片用于檢測(cè)H2O2及麥冬皂苷D調(diào)控120條凋亡關(guān)鍵基因的特異表達(dá)。這些基因包括TNF配體家族、TNF受體家族、bcl-2家族、Caspase家族、IAP家族、TRAF家族、CARD家族、死亡結(jié)構(gòu)域基因家族成員、致死效應(yīng)結(jié)構(gòu)域基因家族成員、CIDE結(jié)構(gòu)域家族成員，以及P53和ATM通路的基因。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)H2O2可顯著上調(diào)其中27條基因，下調(diào)其中3條基因，而麥冬皂苷D對(duì)上述基因起到對(duì)抗作用從而達(dá)到保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)及功能的完整性。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例麥冬皂苷D調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡基因的研究從中藥材麥冬提取分離的有效成分麥冬皂苷D對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞有抗H2O2所致凋亡的作用。本發(fā)明運(yùn)用基因芯片技術(shù)，針對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)麥冬皂苷D所調(diào)控的血管內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)譜。
1材料與方法1.1主要試劑RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO，USA)(每升含20％小牛血清、L-谷氨酰胺0.33mg、青霉素100u、鏈霉素100u、pH-7.4)；消化劑為0.25％胰蛋白酶(MERCK，USA)；四川綿陽產(chǎn)麥冬，購自南京市藥材公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室鑒定為Ophiopogon japonicus.(L.f.)Ker-Gawl.的塊根。
RNA抽提試劑TRIZOL試劑(Invitrogen life technologies)，氯仿，異丙醇，75％乙醇(以DEPC處理的水配制)，無RNA酶的水，無RNA酶的糖原(Invitrogen life technologies)。
RNA質(zhì)量檢測(cè)試劑TE10mM Tris-HCl pH8，1mM EDTA，0.4M MOPS，pH7.0，0.1M乙酸鈉，0.01M EDTA，甲醛，甲醛上樣染液(ambion)，溴化乙錠(Ethidium Bromide，EB)，瓊脂糖。
cRNA標(biāo)記與合成試劑TrueLabeling-AMPTM線性RNA擴(kuò)增試劑盒(cDNA合成G1TrueLabeling引物，RIRNA酶抑制劑，G2cDNA合成酶混合液，G35X cDNA合成緩沖液，H2O除RNA酶的H2O。RNA線性擴(kuò)增以及cRNA合成G42.5X RNA擴(kuò)增緩沖液，G5擴(kuò)增酶類混合液)。Biotin-16-dUTP(Roche Cat.No.1-093-070)，SuperArray ArrayGrade cRNA純化試劑盒。
芯片雜交試劑Oligo GEArray芯片Human Apoptosis MicroarrayOHS-012(美國SuperArray公司提供)。20X SSC(900ml H2O中溶解175.3g的NaCl和88.2g的二水檸檬酸鈉，用1M的HCl調(diào)節(jié)pH到7.0，加水至1L)，20％SDS(1L H2O中溶解200g十二烷基磺酸鈉)。
化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒Chemiluminescent DetectionKit(SuperArray Bioscience，Catalog Number D-01)，GEA封閉液Q，5X緩沖液F，AP，緩沖液G，CDP-Star化學(xué)發(fā)光底物。
1.2麥冬皂苷D的提取分離取5~10目麥冬藥粉，加10倍量70％乙醇，熱回流提取3次，每次2h。合并提取液，減壓濃縮至無醇味。然后，將其溶于1000mL水中，用3倍量乙酸乙酯振搖提取3次，得到乙酸乙酯提取物和水層。將水層繼續(xù)用3倍量正丁醇振搖提取3次，得到正丁醇提取物和水層，合并正丁醇液，用0.1mol/L NaOH振搖提取2次，棄去0.1mol/L NaOH。將正丁醇提取物進(jìn)行大孔樹脂柱洗脫，依次用水、10％乙醇、30％乙醇、60％乙醇、95％乙醇和乙醇梯度洗脫，分別得到相應(yīng)的洗脫物。60％乙醇洗脫物經(jīng)硅膠柱色譜，水飽和正丁醇洗脫，得到麥冬皂苷D。
1.3藥物分組分為對(duì)照組、造模組(100umolH2O2)和麥冬皂苷D組(100umolH2O2+1.29ug/ml麥冬皂苷D)。
1.4血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)無菌條件下取胎齡為37~40wk的新生兒臍帶(長約30~50cm)，排盡殘血，剪去鉗夾部分，投入滅菌保存液(0.14mol/L NaCl、4mmol/L KCl、15mmol/L Hepse、11mmol/L葡萄糖、pH7.3)中，4℃保存。
然后用D-Hanks液(pH7.3~7.4)反復(fù)灌洗臍靜脈，直至將余血沖洗干凈。向靜脈內(nèi)注入0.25％的胰蛋白酶5~10ml，在37℃下孵育10min。收集臍靜脈腔內(nèi)的消化液，此后迅速注入適量(5ml)含20％小牛血清的培養(yǎng)液以終止酶消化作用并收集入刻度離心管中。收集細(xì)胞的全過程應(yīng)在兩分鐘內(nèi)完成。室溫下1000rpm，離心10分鐘，倒盡上清液，吸取1ml培養(yǎng)液于離心管中，吹打成懸液，用0.4％臺(tái)酚藍(lán)染色少量細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)活細(xì)胞在95％以上，再加入20％RPMI-1640培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107·L-1，將此濃度的原代HUVEC移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。置于5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。第1個(gè)24h更換培養(yǎng)液的1/2，以后每隔24h換液1次。根據(jù)相差顯微鏡下細(xì)胞呈單層鵝卵石樣排列、免疫細(xì)胞化學(xué)法染色細(xì)胞第VIII因子相關(guān)抗原呈陽性，確定培養(yǎng)細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞。
1.5 RNA抽提a.勻漿直接在3.5cm直徑的培養(yǎng)盤中加入1ml TRIZOL試劑裂解細(xì)胞，裂解時(shí)用槍吸打幾次。加入TRIZOL試劑的量取決于培養(yǎng)盤的面積(每10cm2加1ml)而不是培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量。
b.兩相分離勻漿后樣品于15到30℃孵育5分鐘，以便核酸蛋白復(fù)合體完全解離。每1ml的TRIZOL試劑勻漿的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12,000×g離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層核上層的無色的水相。RNA全部被分配于水相中。水相的體積大約使勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60％。
c.RNA沉淀將水相轉(zhuǎn)移到新離心管中。水相與異丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入異丙醇的量為每個(gè)樣品勻漿時(shí)加入1ml TRIZOL試劑的此時(shí)加0.5ml的異丙醇?；靹蚝?5到30℃孵育10分鐘后，于4℃ 12,000×g離心10分鐘。
d.RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL試劑勻漿的樣品中加入至少1ml的75％乙醇，清洗RNA沉淀。振蕩后，4℃7,500×g離心5分鐘。
e.重新溶解RNA沉淀去除乙醇溶液，空氣中干燥RNA沉淀5-10分鐘。溶解RNA時(shí)，先加入無RNA酶的水用槍反復(fù)吹打幾次，然后55到60℃孵育10分鐘。獲得的RNA溶液保存于-70℃。
1.6 RNA質(zhì)量檢測(cè)a.紫外吸收測(cè)定法取少量液體用TE稀釋(一般1∶100稀釋)后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，可以測(cè)定RNA溶液濃度和純度。用來稀釋的TE不需要經(jīng)過無RNA酶處理，因?yàn)镽NA的微量降解不會(huì)明顯影響分光光度計(jì)的讀值。測(cè)量前需先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。濃度測(cè)定在A260下讀值為1表示40μg RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計(jì)算公式為A260 X稀釋倍數(shù)X 40μg/ml。RNA溶液的A260/A280的比值是一種RNA純度檢測(cè)方法，比值范圍1.8到2.1。
b.變性瓊脂糖凝膠電泳制膠1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃，10ml的10X MOPS電泳緩沖液(0.4M MOPS，pH7.0，0.1M乙酸鈉，0.01MEDTA)和18ml的37％甲醛溶液(12.3M)。灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25μl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1X MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個(gè)毫米。取3μg RNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。上樣于膠孔中，5-6V/cm電壓下電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2-3cm。紫外透射光下觀察并拍照。
1.7 cRNA標(biāo)記與合成a.cDNA合成先配制退火混合液每個(gè)RNA樣品均如下配制于一個(gè)滅菌的PCR管中0.1-3.0μg總RNA，1.0μl G1，加去RNA酶的H2O至總體積為10μl。用移液槍輕輕吸打幾次混合均勻，稍微離心使液體聚集于管底。70℃水浴10min后立刻放于冰中。再配制cDNA合成混合液，在離心管中依次加入，按每張芯片4μl除RNA酶的H2O，4μl 5X cDNA合成緩沖液(G3)，1μl RNA酶抑制劑(RI)，1μl cDNA合成酶混合液(G2)，總體積10μl。用移液槍輕輕吸打幾次混合均勻，稍微離心使液體聚集于管底。置于冰上待用。cDNA合成反應(yīng)每10μl退火混合液中加入10μl的cDNA合成混合液。移液槍輕輕吸打幾次混合均勻，稍微離心使液體聚集于管底。42℃水浴50分鐘。短暫離心(約2秒)使液體聚集于管底。然后進(jìn)行cRNA合成步驟或-20℃保存過夜。
b.cRNA合成，標(biāo)記和擴(kuò)增先配制擴(kuò)增混合液試劑盒中所有管溶解后離心溶液至管底，置冰中待用。在離心管中依次加入擴(kuò)增混合液按每張芯片16μl 2.5X RNA擴(kuò)增緩沖液(G4)，2μl Biotin-16-UTP(Roche or ENZO)，2μl擴(kuò)增酶類混合液(G5)，總體積為20μl。分別加入20μl擴(kuò)增混合液。吸打混勻并離心至管底。37℃水浴4小時(shí)以上。
c.cRNA純化使用SuperArray ArrayGrade cRNA純化試劑盒(貨號(hào)GA-012)。按步驟配制cRNA樣品，將cRNA結(jié)合至純化柱上，清洗純化柱，再將cRNA從純化柱中洗脫。
d.質(zhì)量控制取499μl的TE(pH8.0)至比色管中，確認(rèn)管壁無氣泡。比色管放入紫外分光光度計(jì)，調(diào)零。在比色管中直接加入1μl cRNA，吸打混合均勻。讀出其在230，260和280nm的吸光率。取出比色管，棄去液體，洗干凈涼干。計(jì)算濃度A260×40×500(稀釋倍數(shù))＝樣品濃度(μg/ml)。計(jì)算260/280和260/230比值以確定樣品純度。純化的樣品具有如下比值RNA的260/280比值＞2.0，RNA的260/230比值＞2.0。
1.8芯片雜交a.預(yù)雜交加約5ml去離子水于雜交管中預(yù)濕芯片膜，擰緊管蓋倒放5分鐘。60℃預(yù)熱GEAhyb雜交液(GEAhyb Hybridization Solution)多次顛倒試劑瓶以徹底溶解瓶中組分。去除雜交管中的水，加入2ml預(yù)熱的GEAhyb雜交液，轉(zhuǎn)動(dòng)管子。確定管蓋擰緊。將雜交管放在雜交爐中，旋緊蓋子。加熱后檢測(cè)雜交管蓋是否仍然密封。以轉(zhuǎn)速5-10rpm 60℃預(yù)雜交1到兩小時(shí)。
b.雜交配制樣品雜交液加入4到20μg用TrueLabeling-AMP試劑盒制備的生物素標(biāo)記的cRNA樣品至0.75ml預(yù)熱的GEAhyb雜交液中，混合均勻放于60℃。棄去雜交管中的預(yù)雜交液，加入含有標(biāo)記的cRNA的樣品雜交液。于60℃保持5到10rpm旋轉(zhuǎn)雜交過夜。
c.洗膜每張芯片需配制5ml的洗液1和5ml的洗液2。洗液12X SSC，1％SDS(混合10ml 20X SSC，5ml 20％SDS，和85ml ddH2O)。洗液20.1XSSC，0.5％SDS(混合0.5ml 20X SSC，2.5ml 20％SDS和97ml ddH2O)。洗液1和洗液2使用前均需要預(yù)熱至60℃。加入5ml洗液1至雜交管中，簡單轉(zhuǎn)動(dòng)幾下，放回雜交爐中。60℃ 20到30rpm轉(zhuǎn)動(dòng)洗膜15分鐘。棄去洗液。加入5ml洗液2至雜交管中，簡單轉(zhuǎn)動(dòng)幾下，放回雜交爐中。60℃ 20到30rpm轉(zhuǎn)動(dòng)下，洗膜15分鐘。立刻棄去洗液，蓋上雜交管蓋以保持膜濕潤，冷卻至室溫。
1.9化學(xué)發(fā)光檢測(cè)a.膜封閉最后一次洗膜后，棄去洗液，立刻加入1.5ml GEAb封閉液Q，在雜交儀中30到40rpm孵育40分鐘。
b.加入鏈親和素偶聯(lián)的堿性磷酸酶(AP)配制1X緩沖液F用水將5X緩沖液F稀釋5倍。(每雜交管準(zhǔn)備18ml的1X緩沖液F)。配制結(jié)合混合液AP1X緩沖液F(1∶7,500)混合。(每雜交管配制2ml結(jié)合緩沖液)。棄去雜交管中的GEA封閉液Q，加入2ml結(jié)合緩沖液，在雜交儀中輕輕搖動(dòng)孵育10分鐘。
c.洗膜洗膜4次加入4ml的1×緩沖液F溫和振蕩5分鐘，棄去1×緩沖液F。加入3ml緩沖液G溫和震蕩分鐘；倒掉，再用3ml緩沖液G重復(fù)洗一次。
d.檢測(cè)加入1.0ml CDP-Star化學(xué)發(fā)光底物至雜交管中，室溫孵育2分鐘。取出膜，放在一張濾紙上以去除多余的CDP-Star溶液，然后用于凈的塑料膜兩面包住，驅(qū)除氣泡，用X-射線膠片曝光。
2.0圖象采集和數(shù)據(jù)分析a.圖象和數(shù)據(jù)采集X-射線膠片曝光后，將膠片上的圖象用掃描儀掃描并轉(zhuǎn)換為灰度TIFF格式的圖片文件保存。運(yùn)行ScanAlyze軟件，將灰度TIFF格式圖片的點(diǎn)陣轉(zhuǎn)化為數(shù)字型數(shù)據(jù)，將此原始數(shù)據(jù)儲(chǔ)存為Microsoft Excel文件。
b.數(shù)據(jù)分析使用芯片配套軟件GEArray Analyzer對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去背景計(jì)算以及比較運(yùn)算。每張芯片都點(diǎn)有負(fù)對(duì)照(PUC18DNA和空白)以及管家基因，包括β-actin，GAPDH，Cyclophilin A和核糖體蛋白L13a。原始數(shù)據(jù)將首先被減掉背景最小值，繼而用管家基因來進(jìn)行校正，校正后的數(shù)據(jù)用來進(jìn)行樣品間基因轉(zhuǎn)錄的相對(duì)豐度分析。
2結(jié)果細(xì)胞凋亡基因芯片可檢測(cè)以下基因表達(dá)TNF配體家族基因LTA，TNF，TNFSF10，TNFSF14，TNFSF18，TNFSF5，TNFSF6，TNFSF7，TNFSF8，TNFSF9。
TNF受體家族基因LTBR，TNFRSF10A，TNFRSF10B，TNFRSF10C，TNFRSF10D，TNFRSF11B，TNFRSF12A，TNFRSF14，TNFRSF19 TNFRSF1A，TNFRSF1B，TNFRSF21，TNFRSF25，TNFRSF5，TNFRSF6，TNFRSF6B，TNFRSF7，TNFRSF9。
Bcl-2家族基因BAD，BAG，BAG3，BAG4，BAK1，BAX，BCL2，BCL2A1，BCL2L1，BCL2L10，BCL2L11，BCL2L12，BCL2L13，BCL2L2，BCLAF1，BID，BIK，BNIP1，BNIP2，BNIP3，BNIP3L，BOK，HRK，MCL1。
Caspase家族基因CASP1，CASP10，CASP14，CASP2，CASP3，CASP4，CASP5，CASP6，CASP7，CASP8，CASP9。
IAP家族基因BIRC1，BIRC2，BIRC3，BIRC4，BIRC5，BIRC6，BIRC7，BIRC8。
TRAF家族基因TRAF1，TRAF2，TRAF3，TRAF4，TRAF5。
CARD家族基因APAF1，BCL10，BIRC2，BIRC3，CARD10，CARD11，CARD12，CARD14，CARD15，CARD4，CARD6，CARD8，CARD9，CASP1，CASP2，CASP4，CASP5，CASP9，CRADD，NOL3，PYCARD，RIPK2。
死亡結(jié)構(gòu)域家族基因CRADD，DAPK1，DAPK2，F(xiàn)ADD，RIPK1，TNFRSF10A，TNFRSF10B，TNFRSF11B，TNFRSF1A，TNFRSF21，TNFRSF25，TNFRSF6，TRADD。
死亡效應(yīng)器家族基因CASP8，CASP10，CFLAR，F(xiàn)ADD。
CIDE Domain家族基因CIDEA，CIDEB，DFFA，DFFB。
p53和DNA損傷反應(yīng)基因ABL1，AKT1，APAF1，BAD，BAX，BCL2，BCL2L1，BID，CASP3，CASP6，CASP7，CASP9，GADD45A，TP53，TP53BP2，TP73，TP73L。
抗凋亡基因AKT1，BAG1，BAG3，BAG4，BCL2，BCL2A1，BCL2L1，BCL2L10，BCL2L2，BFAR，BIRC1，BIRC2，BIRC3，BIRC4，BIRC5，BIRC6，BIRC7，BIRC8，BNIP1，BNIP2，BNIP3，BRAF，CASP2，CFLAR，GDNF，IGF1R，MCL1，TNF，TNFRSF6，TNFRSF6B，TNFRSF7，TNFSF18，TNFSF5。
三組細(xì)胞凋亡芯片經(jīng)過分析比較，不同組間基因上、下調(diào)有顯著差異，造模與對(duì)照組相比較30條基因有顯著差異，其中27條基因顯示H2O2對(duì)其有顯著的上調(diào)作用


3條基因顯示H2O2對(duì)其有顯著的下調(diào)作用

麥冬組與模型組相比較有條基因有顯著差異，其中27條基因顯示麥冬皂苷D可對(duì)抗H2O2的上調(diào)作用，對(duì)其有顯著的下調(diào)作用


3條基因顯示麥冬皂苷D可對(duì)抗H2O2的下調(diào)，有顯著的上調(diào)作用

3.討論細(xì)胞凋亡基因芯片可用于研究細(xì)胞凋亡過程120條關(guān)鍵基因的特異表達(dá)。這些基因可以根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)劃分為12個(gè)類別，包括TNF配體家族、TNF受體家族、bcl-2家族、Caspase家族、IAP家族、TRAF家族、CARD家族、死亡結(jié)構(gòu)域基因家族成員、致死效應(yīng)結(jié)構(gòu)域基因家族成員、CIDE結(jié)構(gòu)域家族成員，以及P53和ATM通路的基因。
H2O2可上調(diào)AKT1、BID、BIRC2、BIRC5、BNIP1、BOK、CARD10、CARD6、CARD8、CASP4、CASP7、DAPK1、DAPK2、DFFA、IGF1R、LTBR、RIPK2、TNFRSF10A、TNFRSF12A、、TNFRSF19、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF6B、TP53、TRADD、TRAF3、TRAF4，而麥冬皂苷D則可下調(diào)上述除BNIP1、CASP4、TNFRSF19以外的所有基因，以及BCL2L1、CRADD、FADD三條基因。H2O2可下調(diào)BAD、CASP9和CIDEA三條基因，而麥冬皂苷D可上調(diào)CASP3、CASP9和CIDEA三條基因。
可見H2O2及麥冬皂苷D調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡所涉及的基因非常相似，可起到對(duì)抗作用。
權(quán)利要求
1.麥冬皂苷D在制備調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡基因藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明把細(xì)胞凋亡基因芯片用于檢測(cè)H
文檔編號(hào)C07H1/08GK101084914SQ200710024568
公開日2007年12月12日 申請(qǐng)日期2007年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月22日
發(fā)明者張旭, 陸兔林, 蔡寶昌, 王明艷, 毛春芹, 張小燕, 張志潔, 楊進(jìn) 申請(qǐng)人:南京中醫(yī)藥大學(xué)