專利名稱:麥冬皂苷d作為組織因子途徑抑制劑的醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及麥冬皂苷D作為組織因子(TF)途經(jīng)抑制劑的醫(yī)藥 用途。技術(shù)背景組織因子(tissue factor, TF)又稱為促凝血激酶thromboplastin或CD 142,為單鏈跨膜促凝 糖蛋白,是絲氨酸蛋白酶凝血因子FVDa/FVH的細(xì)胞膜受體,屬于細(xì)胞因子超家族成員。大 量研究顯示,組織因子(TF)作為止血平衡和病理狀態(tài)下凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的最初啟動(dòng)因子,當(dāng) 血管破損后或在病理情況下,血液暴露于能表達(dá)TF的細(xì)胞表面,受體TF即與其配體Vn或VUa 形成復(fù)合物,進(jìn)而同時(shí)激活凝血因子X和IX,最后形成纖維蛋白,導(dǎo)致血液凝固,是血栓 形成和發(fā)展的一種關(guān)鍵因素,在動(dòng)脈粥樣硬化、深靜脈血栓、高血壓、心絞痛、彌散性內(nèi)凝 血、腫瘤等許多疾病發(fā)生發(fā)展均起重要作用。新近研究表明,血栓與炎癥密切相關(guān),TF是聯(lián) 系炎癥與血栓回路的重要因子,通常僅表達(dá)于成纖維細(xì)胞和外膜細(xì)胞等血管外細(xì)胞,在病理 刺激如炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF-a)等的誘導(dǎo)下內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞等也大量表達(dá)TF, 炎癥刺激或組織損傷時(shí),TF上調(diào)激活內(nèi)源性凝血途徑,F(xiàn)VIIa, FXa and FIIa接連活化,導(dǎo)致 高凝,纖維蛋白大量生成,出現(xiàn)血栓。TF上調(diào)在血栓和炎癥回路中起關(guān)鍵核心的作用,凝血 因子FVIIa, FXa and FIIa和纖維蛋白都具有促炎性,可激發(fā)多種細(xì)胞表達(dá)TNF、白介素類、 粘附分子等多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào),這樣導(dǎo)致的炎癥通過反饋性TF上調(diào)保證"纖維蛋白性血栓",反 之又可引起血小板/白細(xì)胞活化,形成"細(xì)胞性"血栓。TF引起的凝血可能引發(fā)血栓形成而導(dǎo)致 各種心血管疾病諸如心臟病發(fā)作、中風(fēng)、不穩(wěn)定性心絞痛、移植片衰竭或其他冠狀動(dòng)脈疾 病,還可能并發(fā)各種血栓栓塞障礙及凝塞,分別例如肺栓塞、心房纖維顫動(dòng)及栓塞及擴(kuò)散性 血管內(nèi)凝血。體液操作亦可能引起不良性血栓,特別是在輸血或體液抽樣及涉及體外循環(huán)(例 如心肺迂回補(bǔ)助外科手術(shù))及透析過程中。因此阻止TF表達(dá)上調(diào),關(guān)閉血栓炎癥回路,可 達(dá)到抗栓抗炎目的TF的活性抑制,己成為當(dāng)前防治心血管疾病的一個(gè)引人注目的藥物耙點(diǎn)。另外,隨著對(duì)TF作用的了解加深,除了其在凝血過程中的作用,TF還承擔(dān)了信號(hào)受體和其他非凝血功能。這使得它在系統(tǒng)性炎癥、凝血紊亂、動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤的血管發(fā)生及轉(zhuǎn)移,糖尿病等疾病中起重要作用。TF的非凝血功能中,與腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系甚為引人注目,它在惡性黑色素瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤細(xì)胞及腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的表達(dá)均異常增高,近年來國(guó)外臨床觀察及體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)F Vfla/TF復(fù)合物具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移的作用。另據(jù)研文獻(xiàn)報(bào)道,TF在人朗格罕胰島中也有表達(dá),在大部分的胰島內(nèi)分泌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了 TF ("胰島產(chǎn)生TF"),表明TF的分泌和胰島素 的分泌存在著一定的聯(lián)系。這種TF很有可能與II型糖尿病或其前期患者患動(dòng)脈粥樣硬化和 心血管疾病的高發(fā)病率有關(guān)。因此,干預(yù)TF途徑可能為多種疾病的治療、預(yù)防提供新的策 略,己成為國(guó)內(nèi)外日益關(guān)注的研究熱點(diǎn)(Chu AJ. Ce//歷oc/zem Fw"". 2006, 24(2): 173-92.; Steffel J, Thomas F, Felix C. Tissue Factor in Cardiovascular Diseases: Molecular Mechanisms and Clinical Implications. Circulation. 2006; 113:722-31 )。目前國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)源性的TF抑制劑為組織因子途徑抑制劑(tissue factor pathway inhibitor, TFPI),對(duì)維持體內(nèi)凝血平衡有重要意義,重組獲得的TFPI早期臨床前景美好,但 在敗血癥三期臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果不甚理想,還造成出血危險(xiǎn)性增加;TF的寡核苷酸反義片段可抑 制TF的合成,TF的抗體及其突變體通過直接拮抗TF作用,活性位點(diǎn)失活的FVDa (FVDai) 在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均顯示良好的抗血栓活性;自犬鉤蟲唾液分離的一種抗凝血蛋白(NAPC2)可 通過與FXa結(jié)合阻斷TF效應(yīng),2期臨床實(shí)驗(yàn)中可安全有效地抑制凝血酶生成。另外, 一些己 在臨床應(yīng)用的藥物包括他汀類調(diào)脂藥及環(huán)加氧酶-2 (COX-2)抑制劑,具有抑制TF表達(dá)及活 性作用,為其在心血管疾病應(yīng)用提供新依據(jù)。我國(guó)中草藥資源豐富,中藥有效成分眾多,從 中尋找發(fā)現(xiàn)新型高效副作用低的TF途徑抑制劑,具有廣闊的研究前景。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明公開了麥冬皂苷D的治療新用途,即其具有較強(qiáng)的組織因子(TF)途經(jīng)抑制活性。 其具有治療心腦血管疾病、凝血障礙、侵入性醫(yī)療程序、腫瘤轉(zhuǎn)移或糖尿病的功效。所述的 心腦血管疾病優(yōu)選動(dòng)脈粥樣硬化、腦中風(fēng)或肺栓塞。所述的凝血障礙優(yōu)選彌散性血管內(nèi)凝血 或膿毒血癥。所述的侵入性醫(yī)療程序優(yōu)選血管成形術(shù)、動(dòng)脈內(nèi)切開術(shù)、應(yīng)用移植模、導(dǎo)管的 使用、移植片的植入或動(dòng)靜脈分流器的使用。麥冬皂苷D可以從市場(chǎng)購(gòu)得,也可以制備,相關(guān)制備文獻(xiàn)如(Yu BY etal. Studies on the Glycosides of the Subterranean part of Op/ .o/ ogo" y'opow'cws A"er-GW/er cv. iVa肌tf.. Chem. Pharm. Bull"1993,41(3):566 570 ; Cheng ZH et al. Steroidal glycosides from tubers of O盧opog(w/ap歸.c肌Journal of Asian Natural Products Research, Vol. 8, No. 6, September 2006, 555-559)。本發(fā)明為治療TF相關(guān)疾病提供了新的先導(dǎo)化合物或治療藥物。 以下是部分藥理藥效學(xué)試驗(yàn)方法及結(jié)果1麥冬皂苷D抑制TF活性及表達(dá)的體外實(shí)驗(yàn)研究 1.1實(shí)驗(yàn)材料人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV-304細(xì)胞,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所;地塞米松磷酸鈉注 射液(Dexamethasone Sodium Phosphate Injection,浙江仙琚制藥股份有限公司,批號(hào)040卯1); 重組人腫瘤壞死因子-a (TNF-a, R&D Systems, Inc.) ,NF-kB抑制劑二硫代氨基甲酸咯奈啶 (Pyrrolidine d池iocarbamate, PDTC); RPMI1640培養(yǎng)基干粉(GIBCO BEL),新生牛血清(NCS, 中美合資蘭州民海生物工程材料有限公司);TF發(fā)色底物試劑盒(American Assaypro);兔 抗TF多克隆抗體(武漢博士德公司);磷酸化的絲裂原活化的蛋白激酶(MAPKP38)、細(xì)胞 外調(diào)節(jié)激酶(ERK)、原癌基因C-Jun氨基末端激酶(JNK)抗體(美國(guó)Cell signaling Techology 公司),微管蛋白a-tubulin (Santa Cruz公司)。 1.2實(shí)驗(yàn)儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus),超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司),Z-323K冷凍離心機(jī) (德國(guó)HERMLE公司),離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠制造80-2B; ) , XSZ-D2倒置顯微 鏡(重慶光學(xué)儀器廠),Nuair超低溫冰箱(-70°C,美國(guó)Revoc Technologies),紫外分光光度 計(jì)(Beckman)、電泳儀(Bio-Rad),多功能酶標(biāo)儀(Sunrise, TEC AN)。 1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1 ECV304細(xì)胞TF活性測(cè)定ECV304細(xì)胞37°C、 5%032常規(guī)培養(yǎng),消化傳代,接種于96孔板,每孔100 |il,待長(zhǎng) 滿單層后,分別加不同濃度麥冬皂苷D孵育1 h,再加TNF-oc (終濃度10 ng/ml) 孵育4 h。 隨后收集細(xì)胞,反復(fù)凍融3次裂解細(xì)胞。參考試劑盒說明書,采用發(fā)色底物法,測(cè)定裂解液 TF活性。1.3.2 ECV304細(xì)胞TF表達(dá)及信號(hào)通路測(cè)定ECV304細(xì)胞消化傳代,分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組,即對(duì)照組,模型組,麥冬皂苷D和陽性對(duì)照組,分別接種于100ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶,待長(zhǎng)滿單層后,分別加對(duì)照溶媒、麥冬皂苷D (終濃度10pM) 及PDTC (終濃度50pM)作用lh,再加TNF-a (終濃度10ng/ml) 處理4 h。隨后收集細(xì)胞, 提取總蛋白,采用蛋白印跡(Westeniblotting)方法測(cè)定TF表達(dá)及其上游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路P38蛋白 激酶、P42JNK磷酸化的情況。 1.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.4.1麥冬皂苷D對(duì)TNF-a誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞TF活性的影響圖1結(jié)果顯示,TNF-a可明顯增加ECV304細(xì)胞TF活性,預(yù)先給予麥冬皂苷D 0.1、 1、 10|aM三個(gè)濃度,均可顯著抑制升高的TF活性。1.4.2麥冬皂苷D對(duì)TNF-oc誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞TF表達(dá)及其信號(hào)通路的影響圖2結(jié)果顯示,TNF-a可明顯促進(jìn)ECV304細(xì)胞TF表達(dá),并誘導(dǎo)MAPK p38和JNK顯著 活化,磷酸化抗體表達(dá)明顯增加,而總p38和JNK無明顯變化,提示p38和JNK信號(hào)通路 參與TF活化;麥冬皂苷D預(yù)處理,可明顯下調(diào)TF表達(dá),抑制P38和JNK磷酸化,而不影 響ERK。2麥冬皂苷D抑制TF表達(dá)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究2.1實(shí)驗(yàn)材料雄性SD大鼠,體重280 340g。核糖核酸提取試劑TRIZOL試劑(Invitrogen life technologies) , RNA酶抑制劑、MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP混合液(Promega公司);GAPDH弓l物,5'-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC, 3'-GGTACCACCATGTACCCAGG; Rat TF 弓|物,5,- GGAGTGGCAACCGAAACC, 3'-TGTAAGGAGTGAGACGCCG;(北京三博生物技術(shù)公司合成)。兔抗TF多克隆抗體,磷 酸化的絲裂原活化的蛋Cr激酶MAPKP38、 JNK抗體,微管蛋白a-tubulin抗體來源同上。 2.2實(shí)驗(yàn)儀器PCR儀(MJ Minicycler公司),JD-801凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)(南京大學(xué)江蘇省捷達(dá)科 技發(fā)展有限公司),紫外分光光度計(jì)(Beckman),電泳儀(Bio-Rad) , Z-323K冷凍離心機(jī)(德國(guó)HERMLE公司),Nuair超低溫冰箱(-70。C,美國(guó)Revoc Technologies)。 2.3實(shí)驗(yàn)方法2.3.1下腔靜脈結(jié)扎大鼠靜脈血栓模型血管組織TF基因表達(dá)測(cè)定18只大鼠隨機(jī)分為3組,分別為假手術(shù)組、模型組和藥物處理組,分別灌胃給予等容量 蒸餾水與麥冬皂苷D0.7mg/kg, lh后進(jìn)行下腔靜脈結(jié)扎手術(shù),于術(shù)后17h,再給藥1次,lh 后放血處死,分離血管,采用TRIZOL試劑提取組織RNA,取上述組織RNA5pg,逆轉(zhuǎn)錄得 到cDNA溶液,在MJ Minicyder PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為94 °C 30 s,60 °C 1 min, 72 。C 1 min,共28個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物在含1嗎/ml EB 1.5% agrose進(jìn)行電泳,用UVP成像系統(tǒng)拍照, JD-801凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)分析。2.3.2下腔靜脈結(jié)扎大鼠靜脈血栓模型血管組織TF蛋白表達(dá)及信號(hào)通路測(cè)定18只大鼠隨機(jī)分為3組,分別為假手術(shù)組、模型組和藥物處理組,分別灌胃給予等容量蒸 餾水與麥冬皂苷D0.7mg/kg, 1 h后進(jìn)行下腔靜脈結(jié)扎手術(shù),給藥4次后,分離血栓部位血管組 織,加入裂解液(250mM蔗糖,1 mM乙二胺四乙酸,50 mM三氨基甲烷-鹽酸緩沖液,1 mM 二硫蘇糖醇,lmM苯甲磺酰氟,pH7.4),提取組織總蛋白,利用考馬氏亮藍(lán)試劑盒定量蛋白。 采用Western blotting方法測(cè)定血管組織TF表達(dá)及其上游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白激酶P38、 JNK磷 酸化的情況。 2.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.4.1麥冬皂苷D對(duì)大鼠靜脈血栓模型血管組織TF基因表達(dá)的影響圖3結(jié)果顯示,假手術(shù)組少量表達(dá)TF,模型組TF表達(dá)明顯增加,給予麥冬皂苷D可 明顯下調(diào)TF表達(dá)。經(jīng)掃描分析,其比值分別為0.29, 1.26, 0.38,表明麥冬皂苷D體內(nèi)給藥 可抑制TF基因表達(dá)增加。2.4.2麥冬皂苷D對(duì)大鼠靜脈血栓模型血管組織TF蛋白表達(dá)的影響圖4結(jié)果顯示,假手術(shù)組靜脈血管基本不表達(dá)TF,模型組血栓形成部位血管大量表達(dá) TF,同時(shí)MAPK p38和JNK顯著活化,磷酸化抗體表達(dá)明顯增加,而總p38和JNK無明顯 變化,提示p38和JNK信號(hào)通路參與TF活化;麥冬皂苷D 0.7 mg/kg處理組大鼠血管TF表 達(dá)明顯下調(diào),同時(shí)磷酸化-p38、 磷酸化-JNK表達(dá)亦明顯降低,表明麥冬阜苷D體內(nèi)給藥可 通過TF上游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,抑制TF蛋白表達(dá)增加。綜上所述,體內(nèi)外結(jié)果均表明麥冬皂苷D可明顯抑制TF活性,并通過上游信號(hào)通路下調(diào) TF表達(dá),為防治TF相關(guān)疾病提供有利依據(jù)。
圖1是麥冬皂苷D對(duì)TNF-a誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞TF活性的影響。##尸<0.01,與對(duì)照組比較; * P<0.05, **尸<0.01與模型組比較圖2是麥冬皂苷D對(duì)TNF-a誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞TF表達(dá)及其信號(hào)通路的影響。Phospho代 表磷酸化圖3是麥冬皂苷D對(duì)大鼠靜脈血栓模型血管組織TF基因表達(dá)的影響圖4是麥冬皂苷D對(duì)大鼠靜脈血栓模型血管組織TF蛋白表達(dá)及信號(hào)通路的影響。Phospho代 表磷酸化。
權(quán)利要求
1、麥冬皂苷D用于制備預(yù)防或治療與組織因子相關(guān)疾病的藥物的用途。
2、 權(quán)利要求l的用途,其中與組織因子相關(guān)疾病是心腦血管疾病、凝血障礙、侵入性醫(yī)療程 序、腫瘤轉(zhuǎn)移或糖尿病。
3、 權(quán)利要求2的用途,其中心腦血管疾病是動(dòng)脈粥樣硬化、腦中風(fēng)或肺栓塞。
4、 權(quán)利要求2的甩途,其中凝血障礙是彌散性血管內(nèi)凝血或膿毒血癥。
5、 權(quán)利要求2的用途,其中侵入性醫(yī)療程序是血管成形術(shù)、動(dòng)脈內(nèi)切開術(shù)、應(yīng)用移植模、導(dǎo) 管的使用、移植片的植入或動(dòng)靜脈分流器的使用。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及麥冬皂苷D的醫(yī)藥用途,即其作為組織因子(TF)途經(jīng)抑制劑的用途,可用于治療心腦血管疾病、凝血障礙、侵入性醫(yī)療程序、腫瘤轉(zhuǎn)移或糖尿病等疾病。
文檔編號(hào)A61P7/00GK101327221SQ20081002209
公開日2008年12月24日 申請(qǐng)日期2008年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月18日
發(fā)明者余伯陽, 寇俊萍 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)