專利名稱：：短葶山麥冬c在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于制藥領(lǐng)域，涉及短葶山麥冬c在制藥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：短葶山麥冬Z/〃'ope/mwcan'(Decne.)Baily作為《中國藥典》1995版新增品種-山麥冬的原植物之一，已在長(zhǎng)期的傳統(tǒng)中醫(yī)臨床實(shí)踐中顯示出其特有的療效。但是，短葶山麥冬在臨床的應(yīng)用仍集中于飲片或是復(fù)方制劑，如生脈散、參麥注射液等，而迄今還未見單獨(dú)以其提取物或單體化合物作為臨床藥物使用的，因此，對(duì)其進(jìn)行深入研究和開發(fā)具有重要意義。在化學(xué)成分研究方面，主要集中在短葶山麥冬的皂苷類成分的分離和鑒別，由于山麥冬屬植物須根中的總皂苷含量在相當(dāng)長(zhǎng)的生長(zhǎng)期內(nèi)遠(yuǎn)高于其塊根，因此將短葶山麥冬的須根作為研究的對(duì)象，迄今已從短葶山麥冬中分離并鑒別了六個(gè)單體皂苷類成分，其中一個(gè)為短葶山麥冬C(DT13)。至今為止，世界上還沒有一個(gè)理想的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物。腫瘤患者一旦出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，即使進(jìn)行手術(shù)、放、化療，生存期限仍無法得到較好的延長(zhǎng)。短葶山麥冬C在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥方面的應(yīng)用也未見報(bào)導(dǎo)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供短葶山麥冬C在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥方面的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案是短葶山麥冬C在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥方面的應(yīng)用，特別是在制備與腫瘤新生血管生成抑制相關(guān)的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥中的應(yīng)用。研究顯示，短葶山麥冬c對(duì)乳腺癌、黑色素瘤等多種腫瘤轉(zhuǎn)移有明顯抑制作用。本發(fā)明中短葶山麥冬c可以和藥學(xué)上允許的任意一種輔料制成藥物組合物，也可以和其他與短葶山麥冬c不發(fā)生拮抗作用的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥組成復(fù)方制劑。這些制劑可以是藥學(xué)上允許的任意一種劑型，包括但不限于片劑、顆粒劑、丸劑、口服液、注射劑、膜劑、膠囊劑、脂質(zhì)體等。短葶山麥冬c的用量可根據(jù)用藥途徑、患者年齡、體重、體表面積、所治療的疾病類型和嚴(yán)重程度等變化，其日劑量可以是lmg/kg，可以一次或多次施用。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)DT13能夠明顯抑制人乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移、黏附能力，體內(nèi)發(fā)現(xiàn)DT13能夠抑制黑色素瘤B16的肺轉(zhuǎn)移。DT13作為一個(gè)具有明顯抗轉(zhuǎn)移活性的候選藥物，研究闡明DT13的抗轉(zhuǎn)移作用及其與新生血管生成抑制作用的相互關(guān)系，可以為從腫瘤新生血管生成抑制劑入手發(fā)展DT13抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物提供借鑒，為制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥提供了新的選擇。圖1是DT-13對(duì)缺氧狀態(tài)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435遷移能力的影響。圖2是DT-13對(duì)缺氧狀態(tài)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7遷移能力的影響。圖3是DT-13對(duì)缺氧狀態(tài)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231遷移能力的影響。圖4是DT-13對(duì)血管生成的抑制實(shí)驗(yàn)照片。圖5是DT-13對(duì)血管生成的抑制實(shí)驗(yàn)照片。具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。實(shí)施例1DT-13對(duì)細(xì)胞的毒性檢測(cè)(一)材料儀器超凈工作臺(tái)(蘇州艾可林凈化設(shè)備有限公司)，恒溫C02培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國BIO-RAD公司)，倒置生物顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，平板搖床(江蘇省光明實(shí)驗(yàn)儀器廠)。試劑RPMI1640、F12培養(yǎng)基(GIBCO)，胰蛋白酶(SIGMA)，新生牛血清(HYCLONE)，MTT(SIGMA)，DMSO(SIGMA)。細(xì)胞株人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435、MDA-MB-231、MCF-7。(二)方法1、取處于指數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的細(xì)胞各一瓶，加入0.25%胰翠白酶消化液，消化使貼壁細(xì)胞脫落，計(jì)數(shù)24X10"個(gè)/ml，制成細(xì)胞懸液。2、取細(xì)胞懸液接種于96孔板上，置恒溫002培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。3、換液，加入受試藥物DT-13，20lal/孔，培養(yǎng)48小時(shí)。4、將MTT加入96孔板中，培養(yǎng)箱中反應(yīng)4小時(shí)。5、吸去上清液，加入DMSO,150^1/孔，平板搖床上振搖5分鐘。6、用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在波長(zhǎng)為570nm處測(cè)定每孔的吸光值，并計(jì)算細(xì)胞抑制。細(xì)胞抑制率％=(三)結(jié)果人乳腺癌細(xì)胞435陰性對(duì)照組OD值一藥敏組OD值DT-13陰性對(duì)照組OD值終濃度M細(xì)胞抑制率％1><10-79.631>-13.271>-19.331>(IO"413.27xioo%人乳腺癌細(xì)胞MCF-7人乳腺癌細(xì)胞231終濃度M細(xì)胞抑制率％lxl(T730.52lxl0"622.99DT-13lx10-5-9.03lxlO"445.23終濃度M細(xì)胞抑制率％lx10-724.1114.22DT-13lxl0—5-11.54lxl(y413.76實(shí)施例2DT-13對(duì)缺氧狀態(tài)細(xì)胞黏附能力的影響目的體外檢測(cè)缺氧狀態(tài)下，人乳腺癌細(xì)胞對(duì)基底膜粘附能力的變化材料六孔板，96孔板，PBS，1%明膠，2%BSA，無血清培養(yǎng)液，10%小牛血清培養(yǎng)液，消化液(0.25%胰蛋白酶)，MTT試齊IJ，DMSO方法一、明膠板的制備1、稱取一定量的明膠粉，按照lg/100ml量加入熱的PBS溶解，趁熱點(diǎn)入96孔板中，30ul/孔，平放并晃動(dòng)，使明膠平鋪孔底，注意不要有氣泡。2、放置過夜，將明膠吸出，PBS洗一遍。3、用2%BSA封閉1小時(shí)后吸去。4、加入無血清培養(yǎng)基，20~3(^1/孔，平衡l小時(shí)以上，后吸去。，二，細(xì)胞培養(yǎng)1、生長(zhǎng)旺盛的人乳腺癌細(xì)胞，培養(yǎng)于六孔板中，計(jì)數(shù)7X1(^9X104,2ml/孔。2、培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)至鋪滿孔底80%時(shí)，去掉培養(yǎng)基，PBS洗一遍，換成無血清培養(yǎng)基，并且加入受試藥物DT-13,常氧培養(yǎng)。三，黏附能力測(cè)定1、培養(yǎng)后的細(xì)胞去培養(yǎng)基，PBS洗一遍，消化，離心，制成無血清細(xì)胞懸液。2、將無血清細(xì)胞懸液加入處理好的明膠板中，200nl/孔，每一個(gè)劑量設(shè)10個(gè)平行孔?？瞻捉M僅加入無血清培養(yǎng)基。3、培養(yǎng)1小時(shí)后，用注射器將培養(yǎng)液吸去，PBS洗一遍，方法為加入PBS200p1/孔，槍頭小心吹打10下，用注射器吸出。4、加入MTT40(al/孔，孵育4小時(shí)。5、棄去MTT，加入DMSO，150|al/L,平板搖床上振搖5分鐘。6、用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在波長(zhǎng)為570nm處測(cè)定每孔的吸光值，并計(jì)算細(xì)胞黏附抑制率陰性對(duì)照組OD值一藥敏組OD值細(xì)胞黏附抑制率％=-----------------------------------xl00陰性對(duì)照組OD值-空白組OD值結(jié)果MDA-MB-231細(xì)胞黏附抑制率(％)DT-1310-8mol/l20.98DT-1310-7mol/l30.26DT-1310-6mol/l50.12DT-1310-5mol/l55.94MDA-MB-435DTI3IO一58DTI3l一63DT130腳M43MCF-7DT13l一28.6DT13O.l一37.1DT1310nM59.1DT13固81.6實(shí)施例3DT-13對(duì)缺氧狀態(tài)細(xì)胞遷移能力的影響用BoydenChamberTranswell檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。該裝置分內(nèi)外兩室。內(nèi)室底部為多聚碳酸鹽濾膜(孔徑8pm)，先用1%明膠包被，再用無血清的培養(yǎng)液平衡1h。人乳腺癌細(xì)胞(1.5x104個(gè)細(xì)胞A00pl)懸于含2y。FBS及不同濃度受試化合物的培養(yǎng)液種入內(nèi)室。外室則加入0.6ml含或不含VEGF(20ng/ml)的培養(yǎng)液。37'C孵育6h后，棄去孔中培養(yǎng)液，用90%乙醇固定細(xì)胞10miii。用棉簽輕輕擦去內(nèi)室上層未遷移的細(xì)胞，0.10/0結(jié)晶紫常溫染色10min，用PBS漂凈多余染料，最后用10%乙酸100^1/孔抽提10min，用可調(diào)波長(zhǎng)式微孔板酶標(biāo)儀(VERSAmaxTM，MolecularDeviceCorporation,Sunnyvale,CA，USA)在600nm下測(cè)定OD值。結(jié)果見圖l、2、3,說明DT13能夠明顯抑制三種乳腺癌細(xì)胞的遷移。實(shí)施例4DT-13對(duì)血管生成的抑制實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)材料6日齡雞蛋購于南京浦口、經(jīng)消毒的手術(shù)器械、粗針頭、彎鑷、孵箱、經(jīng)滅菌的濾紙片(制藥膜)、DT-13。操作藥膜的制備DT-13藥物濃度為Pl(^M加入到直徑0.5cm滅菌濾紙膜上，分別加30pl,1(^1，lpl，以制備不同濃度的藥膜。1、將6日齡受精雞蛋擦拭后大頭朝上固定；2、用粗針頭刺破氣室處蛋殼；3、用彎鑷開窗；4、將表面膜小心剝除，選取血管最少的部位放置藥膜；5、寬膠帶封口，標(biāo)記后放于孵箱，2日后拍照觀察結(jié)果。結(jié)果見圖4，箭頭處為放置藥膜處。第二次實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。藥物濃度為30nrno1，20nmo1，lOnmol，lnmol，操作過程同第一次實(shí)驗(yàn)步驟。兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果均發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照相比，DT-13在lOnmol就有明顯的血管生成抑制作用。實(shí)施例5DT-13對(duì)B16黑小鼠轉(zhuǎn)移瘤的抑制作用小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16尾靜脈注射C57小鼠，注射細(xì)胞量1*106個(gè)，同時(shí)給藥DT-13二周后處死動(dòng)物，數(shù)肺部轉(zhuǎn)移灶個(gè)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。組別劑量動(dòng)物數(shù)動(dòng)物數(shù)開始體重結(jié)束體重肺重/體重肺轉(zhuǎn)移灶mg/kg(開始)(結(jié)束)(克)(克)(個(gè)數(shù))<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*:P<0.05**:P<0.01，與溶劑對(duì)照組相比。DT-13高、中劑量組與溶劑對(duì)照組相比，肺重/體重的比值明顯下降，且肺部轉(zhuǎn)移灶數(shù)量也明顯降低。結(jié)果顯示，DT-13對(duì)B16黑小鼠轉(zhuǎn)移瘤有較好的抑制作用。權(quán)利要求1、短葶山麥冬C在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥中的應(yīng)用。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥為腫瘤新生血管生成抑制劑。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于腫瘤為乳腺癌、黑色素瘤。全文摘要本發(fā)明屬于制藥領(lǐng)域，公開了短葶山麥冬C在制藥中的應(yīng)用。本發(fā)明提出了短葶山麥冬C在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥方面的應(yīng)用，特別是在制備與腫瘤新生血管生成抑制相關(guān)的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥中的應(yīng)用。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)短葶山麥冬C能夠明顯抑制人乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移、黏附能力，能夠抑制黑色素瘤B16的肺轉(zhuǎn)移，為制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥中的應(yīng)用提供新的選擇。文檔編號(hào)A61P35/00GK101352448SQ20081019604公開日2009年1月28日申請(qǐng)日期2008年9月11日優(yōu)先權(quán)日2008年9月11日發(fā)明者余伯陽,立孫,張陸勇,偉施,朱丹妮,林森森,袁勝濤申請(qǐng)人:中國藥科大學(xué)