專利名稱：：黃蜀葵花提取物、提取和分析方法以及提取物制劑和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中草藥中的活性成分及其提取和分析方法以及提取物的制劑和用途，具體地說是黃蜀葵花提取物、提取和分析方法以及提取物制劑和用途。二
背景技術(shù)：
：黃蜀葵花為錦葵科秋葵屬植物黃蜀葵AbelmoschusManihot(L.)Medic的干燥花，該藥材收載于江蘇省中藥材標(biāo)(1989年版)增補(bǔ)本。關(guān)于黃蜀葵花化學(xué)成分，王先榮等人于1981年，在植物學(xué)報,23(3):222-226(1981)報導(dǎo)了"黃蜀葵花的化學(xué)成分研究"，從黃蜀葵花中分離到槲皮素-3-洋槐糖苷、金絲桃苷、槲皮素-3'-葡萄糖苷、楊梅素、槲皮素等5種黃酮成分。王先榮等人又于2004年，在中國天然藥物,2(2):91-93(2004)報導(dǎo)了"黃蜀葵花黃酮成分的研究".從黃蜀葵花總黃酮中分離到棉皮素-3'-葡萄糖苷、異槲皮苷、金絲桃苷、槲皮素-3'-葡萄糖苷等4種黃酮成分，其中棉皮素-3'-葡萄糖苷為一新化合物。藥理研究表明，黃蜀葵花中黃酮類化合物是其主要生物活性成分。進(jìn)一步的化學(xué)研究表明，黃蜀葵花黃酮類化合物(或謂總黃酮)中以金絲桃苷，異槲皮苷、槲皮素-3'-葡萄糖苷、棉皮素-3'-葡萄糖苷、楊梅素-3-葡萄糖苷、槲皮素-3-洋槐糖苷、棉皮素、楊梅素、槲皮素九種成分含量較多，該九種化合物有以下化學(xué)式棉皮素-3'-葡萄糖苷楊梅素-3-葡萄糖苷槲皮素-3-洋槐糖苷棉皮素楊梅素槲皮素不同方法提取得到的提取物中所含黃酮類化合物的種類及其含量均不相同，或者說含有不同的總黃酮，導(dǎo)致其藥理、藥性的差異也很大，這就意味著每一種提取方法得到的都是一種新的物質(zhì)(組合物)。比如1、申請?zhí)?00410035741.X公開了一種"治療口腔潰瘍、胃潰瘍、燒燙傷、外傷感染的藥物及制備方法"。該方法是"取黃蜀葵花20kg，用20倍量-14倍量60-90%乙醇水回流提取2次，每次lhr，合并提取液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.13-1.16(60'C)的濃縮液；加適量水稀釋，通過大孔吸附樹脂柱或通過聚酰胺柱，用醇水溶液梯度洗脫，水洗脫3個柱體積，10%及30%乙醇各洗脫3個柱體積，70%乙醇洗脫1個柱體積，洗脫液濃縮，干燥，粉碎后得總黃酮提取物，其總黃酮含量為5-95%(重量比)"。該技術(shù)方案的缺點(diǎn)是其一，因六羥基黃酮楊梅素、棉皮素及其苷類成分在30%乙醇中不穩(wěn)定，其二，沒有具體明確所提供的有效部位由哪些黃酮成分組成及其含量。2、申請?zhí)?00610097615.6公開了一種"黃蜀葵花總黃酮提取物、其制備及其應(yīng)用"。將提取分離后的濾液通過AB-8，DM301等弱極性和中極性大孔吸附樹脂，或聚酰胺柱層析富集總黃酮，聚酰胺柱層析雖能得高純度總黃酮，但因聚酰胺柱每次層析后均需要堿-酸再生，故,該法成本高,工時長，不適用于制備口服用二類原料藥。黃蜀葵花總黃酮及其制劑目前只見到用于治療口腔潰瘍的臨床藥理報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供一種黃蜀葵花總黃酮含量較高的且有其確定指紋圖譜的黃蜀葵花提取物及其提取和分析方法。本發(fā)明另一目的是將黃蜀葵花提取物作為原料藥、加工成口服制劑。本發(fā)明目的還在于通過黃蜀葵花提取物抗心腦缺血機(jī)制的研究以確認(rèn)其在制備治療心腦缺血性藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所稱的黃蜀葵花提取物中總黃酮指紋圖譜就是指提取物中含有上述九種黃酮類化合物，此外還有若干未知成分。本提取物的特征就是提取物中含有槲皮素-3-洋槐糖苷、金絲桃苷，異槲皮苷、槲皮素-3'-葡萄糖苷、棉皮素-3'-葡萄糖苷、楊梅素-3-葡萄糖苷、棉皮素、楊梅素、槲皮素黃酮類化合物；提取物中總黃酮含量以金絲桃苷計為50%-75%(重量百分比，下同)其中，金絲桃苷含量為10.0-15.0%、異槲皮苷含量為7.0-12.0%、槲皮素-3'-葡萄糖苷含量為8.0-12.0%。本提取物的提取方法以黃蜀葵花為原料，包括粗提物的制備和精制，所述粗提物的制備是黃蜀葵花用至少5倍量(重量與體積比w/v，如10g黃蜀葵花加入至少50ml75%乙醇)濃度為75%乙醇溶液(體積百分比，下同)回流提取至少兩次，分離得到乙醇提取液并合并，或者將乙醇提取液減壓濃縮至1/5體積后分離得到濃縮液(I)，濃縮液(I)用HPD400或HPD700大孔吸附樹脂層析柱制備粗提物，其方法是濃縮液(I)上柱后先用水洗脫5-8柱體積，次用10%乙醇洗脫1-2個柱體積，最后用65%乙醇或65%甲醇(體積百分比)洗脫至無刀C"反應(yīng)，收集65%乙醇或65%甲醇洗脫液，經(jīng)減壓脫溶、干燥后得到粗提物；或者將乙醇提取液減壓濃縮至濃縮液體積與生藥重之比為0.5-1:1時分離得到濃縮液(II)，濃縮液(II)用水飽和的正丁醇溶液萃取至少5次，合并萃取液，經(jīng)減壓脫溶、干燥后得到粗提物。所述的精制是對粗提進(jìn)行精制。粗提物用醋酸乙酯-乙醇共沸點(diǎn)混合液或醋酸乙酯-甲醇共沸點(diǎn)混合液回流提取至少兩次，分離得到精提液，合并精提液，經(jīng)減壓脫溶、干燥后得到黃蜀葵花提取物，該提取物中有確定的總黃酮指紋圖譜，總黃酮的含量以金絲桃苷計為50-75%(重量百分比，下同)。提取物中總黃酮指紋圖譜采用高效液相色譜法進(jìn)行測定指紋圖譜見圖l。色譜分析條件為(l)色譜柱采用ODS-C18色譜柱15(kmx4.6mm，5ym;(2)流動相采用線性梯度洗脫，其中A相為乙腈一甲醇(10:1)，B相為O.4%磷酸溶液.流動相梯度時間(min)A(%)B(%)時間(min)A(%)B(%)0-32168432-35277335-52277352-53168453-601684(3)檢測波長為360nm:(4)柱溫為27。C;(5)流速1.Oml/rain。提取物中總黃酮含量測定以金絲桃苷為對照品、采用J/C/3絡(luò)合比色法進(jìn)行測定，總黃酮含量為50-75%。提取物中三種黃酮成分金絲桃苷、異槲皮苷以及槲皮素-3'-葡萄糖苷含量測定均采用高效液相色譜法測定，色譜分析條件為色譜柱采用ODS-C18色譜柱150mmx6mm，5um;(2)流動相水-乙腈-磷酸(825:175:1)。(3)檢測波長為365nm:(4)柱溫為27。C;(5)流速1.Oml/min。本發(fā)明所述的黃蜀葵花提取物制劑是指以提取物為活性成分的口服制劑，其特征是由提取物和藥用輔料加工的滴丸或片劑或膠囊劑或軟膠囊劑。心腦缺血是心腦血管疾病，心腦缺血會導(dǎo)致心腦損傷，若不及時救治會留下后遺癥。本發(fā)明所稱的黃蜀葵花提取物的用途就是該提取物在制備治療心腦缺血疾病藥物中的應(yīng)用。與已有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在1、本發(fā)明黃蜀葵花提取物由槲皮素-3-洋槐糖苷、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素-3'_葡萄糖苷、棉皮素-3'-葡萄糖苷、楊梅素-3-葡萄糖苷、棉皮素、楊梅素、槲皮素等黃酮類成分組成;并以總黃酮含量、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素-3'-葡萄糖苷的含量對其進(jìn)行確切的表征，以這一表征方式進(jìn)行表征的黃酮類物質(zhì)以及口服黃蜀葵花總黃酮提取物的藥劑具有顯著的治療心腦缺血性疾病作用及其作用機(jī)理，均未見相關(guān)文獻(xiàn)的報道。2、本發(fā)明采用高效液相色譜法，可以對提取物中金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素-3'-葡萄糖苷的黃酮成分進(jìn)行明確定性和定量。3、本發(fā)明口服黃蜀葵花總黃酮提取物的藥劑治療心腦缺血疾病有可靠的療效。4、本發(fā)明可以滿足廣大心腦缺血患者對不同劑型的要求。四圖l是黃蜀葵花提取物液相色譜指紋圖譜。圖中3、槲皮素-3-洋槐糖苷、5.金絲桃苷、6.異槲皮苷、7.楊梅素3-葡萄糖苷、9.棉皮素、IO.楊梅素、ll.棉皮素-3'-葡萄糖苷、12.槲皮素-3'-葡萄糖苷、13.槲皮素。1、2、4、8為未知物。五具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例對黃蜀葵花提取物提取方法，提取物制劑的制備方法及藥理實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步詳述。(一)、提取物的制備實(shí)施例l:取黃蜀葵花生藥粗粉lkg，加10000ml75%乙醇加熱回流提取2小時，共提取3次，合并提取液，放冷，過濾，減壓回收乙醇至l/5體積，靜置12小時過濾；濾液通過HPD400大孔吸附樹脂柱層析，首先用水沖洗5—8個柱體積，用10%乙醇洗脫1-2個柱體積,再用65%乙醇洗脫至無AC"反應(yīng)，收集65%乙醇洗脫液；將該洗脫液在低于6(TC條件下減壓濃縮，真空干燥得黃蜀葵花提取物粗品；取提取物粗品，用10倍量(W/V)共沸點(diǎn)醋酸乙酯一乙醇回流提取3次，每次i-2小時，回收溶劑，8crc減壓干燥得到黃蜀葵花提取物產(chǎn)品。按重量百分比提取物收得率為3.5%，提取物中按重量百分比總黃酮(以金絲桃苷計)含量為70.0%，其中以下黃酮成分含量為金絲桃苷14.0%、異槲皮苷11.5%、槲皮素-3'-葡萄糖苷10.0%、其它黃酮類成分余量。實(shí)施例2:取黃蜀葵花生藥粗粉lkg，加10000ml75%乙醇加熱回流提取2小時，共提取3次，合并提取液，放冷，過濾，減壓回收乙醇至1/5體積，靜置12小時過濾；濾液通過HPD700大孔吸附樹脂柱層析，首先用水沖洗5—8個柱體積，用10%乙醇洗脫1-2個柱體積,再用65%乙醇或洗脫至無力/03反應(yīng)，收集65%乙醇或洗脫液；將該洗脫液在低于6(fC條件下減壓濃縮，真空干燥得黃蜀葵花提取物粗品；取提取物粗品，用10倍量(W/V)共沸點(diǎn)醋酸乙酯一甲醇回流提取3次，每次l-2小時，回收溶劑，6(TC減壓干燥得到黃蜀葵花提取物產(chǎn)品。按重量百分比提取物收得率為3.7%，提取物中按重量百分比總黃酮(以金絲桃苷計)含量為65.0%,其中以下黃酮成分含量為金絲桃苷13.2%、異槲皮苷10.5%、槲皮素-3'-葡萄糖苷9.5%、其它黃酮類成分余量。實(shí)施例3:取黃蜀葵花生藥粗粉lkg，加8000ml60W乙醇加熱回流提取2小時，共提取3次，合并提取液，放冷，過濾，濾液，將該濾液在低于60。C條件下減壓濃縮至濃縮液體積與生藥重之比為0.5-1:l,用1:1(V/V)水飽和的正丁醇卒取8-10次,合并正丁醇卒取液,用無水硫酸鈉干燥、過濾，在低于80。C條件下減壓濃縮，真空干燥得黃蜀葵花提取物粗品；取提取物粗品，用10倍量(W/V)共沸點(diǎn)醋酸乙酯一乙醇回流提取3次，每次1-2小時，回收溶劑，80°C減壓干燥得黃蜀葵花提取物產(chǎn)品。按重量百分比提取物收得率為3.2%，其總黃酮(以金絲桃苷計)含量為56.0%，其中以下黃酮成分含量為金絲桃苷11.5%、異槲皮苷10.5%、槲皮素-3'-葡萄糖苷9.0%，其它黃酮類成分余量。(二)、提取物制劑的制備實(shí)施例4:黃蜀葵花總黃酮片組分量黃蜀葵花提取物5-100g糊精90g微晶纖維素105g低取代羥丙甲纖維素15g70%的乙醇溶液15ml硬脂酸鎂lg制備過程黃蜀葵花提取物、糊精、硬脂酸鎂、低取代羥丙甲纖維素分別粉碎過80目篩；將黃蜀葵花與糊精、2/3量的低取代羥丙甲纖維素及70%的乙醇溶液混合研磨，使均勻，制軟材；再20目篩制顆粒，干燥，整粒后加入剩余的低取代羥丙甲纖維素，混勻，再加入硬脂酸鎂混勻，壓1000片；檢驗(yàn)合格后包裝。實(shí)施例5:黃蜀葵花總黃酮滴丸組分量黃蜀葵花提取物l-50gPEG棚015gPEG600022g制備過程將聚乙二醇4000、聚乙二醇6000加熱，再將黃蜀葵花提取物加入其中，充分?jǐn)嚢?，使藥物充分分散于基質(zhì)中；將上述藥液轉(zhuǎn)移至滴丸機(jī)上，70'C8(TC密閉保溫1020分鐘，用無水甲基硅油作冷卻劑，1(TC2(TC梯度冷卻，用3060滴/分速度進(jìn)行滴制，即得成型丸粒。再收集滴丸，用無水石油醚洗滌2次，涼干，包裝即可。實(shí)施例6:黃蜀葵花總黃酮軟膠囊組分量黃蜀葵花提取物5—100g蜂蠟10g食用植物油150g明膠13g制備過程稱取黃蜀葵花提取物與經(jīng)過加熱滅菌、澄清的食用植物油及蜂蠟熔融物混合，充分?jǐn)噭蚣吹媚倚奈铩Ｈ∶髂z加入適量水使其膨脹；另將甘油及余下的水置煮膠鍋中加熱至70'C8(TC，混合均勻，加入膨脹的明膠攪拌，熔化，保溫l-2小時，靜置，使泡沫上浮，除去上浮的泡沫，以潔凈白布濾過，保溫待用。將已制好的明膠液，置明膠液貯槽中控制溫度在6(TC左右，將黃蜀葵花提取物放入藥液貯槽內(nèi)；液狀石蠟溫度以10-25'C為宜，室溫10-20°C，滴頭溫度30-60。C，開始滴丸。滴出的膠丸先均勻地攤于紗網(wǎng)上，在1(TC以下低溫吹風(fēng)4小時以上，再用擦丸機(jī)擦去表面的石蠟，然后再低溫(l(TC以下)吹風(fēng)20小時以上，于40-50'C干燥約24小時。取出干燥的膠丸，燈檢，除去廢丸后，用95%乙醇洗滌，再在40-5(TC以下吹干，經(jīng)質(zhì)量檢查合格后，即可包裝。實(shí)施例7:黃蜀葵花總黃酮膠囊劑組分量黃蜀葵花提取物5—100g淀粉125g70%乙醇適量制備過程將淀粉、黃蜀葵花提取物混勻，過80目篩，加入適量的70%乙醇，制軟材，再用20目篩制顆粒，干燥，整粒，裝膠囊，共制成1000粒，每粒含黃蜀葵花總黃酮提取物5—100mg，即可。(三)、提取物中總黃酮含量及其指紋圖譜的分析測定實(shí)施例8:黃蜀葵花提取物、制劑中總黃酮含量測定，主要組成成分含量測定方法為-(1)、黃蜀葵花提取物的總黃酮含量測定以金絲桃苷為對照品采用^03絡(luò)合比色法進(jìn)行測定，本品含總黃酮(以金絲桃苷計)為50-75%。(2)、黃蜀葵花提取物的主要組成成分:金絲桃苷、異槲皮苷、以及槲皮素-3'-葡萄糖苷的含量測定均采用高效液相色譜法測定，各成分含量見實(shí)施例1-3。色譜分析條件為色譜柱采用0DS-C18色譜柱150mmx6mm，5um;(2)流動相水-乙腈-磷酸(825:175:1)。(3)檢測波長為365nm:(4)柱溫為27。C;(5)流速1.Oml/min。實(shí)施例9:黃蜀葵花提取物中總黃酮指紋圖譜測定方法色譜分析條件為(1)色譜柱采用ODS-C18色譜柱150mmx4.6mm，5um;(2)流動相采用線性梯度洗脫，其中A相為乙腈一甲醇(10:1)，B相為O.4%磷酸溶液.流動相梯度；時間(min)A(%)B(%)時間(min)A(%)B(%)0-32168432-35277335-52277352-53168453—601684(3)檢測波長為360nm:(4)柱溫為27。C;(5)流速1.Oml/rain。(四)、下面用藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果闡明其藥效作用一、黃蜀葵花總黃酮(TFA)對缺血性心肌損傷有保護(hù)作用1TFA對犬心臟血流動力學(xué)及心肌耗氧量的影響1.1對血壓、心率及心電圖的影響結(jié)果如表1所示，與給藥前及NS對照組比較，TFA各劑量組對麻醉犬血壓、心率無明顯影響(P〉0.05)。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01;與用藥前比較，AP<0.05，AAP<0.01。1.3對犬冠脈流量、心輸出量的影響結(jié)果如表3所示，TFA60，30，15mgkg'3個劑量組給藥后30min時均可增加冠脈流量及心輸出量，并一直持續(xù)至120min，與用藥前及NS對照組比較均有顯著性差異。表3黃蜀葵花總黃酮對犬冠脈流量(ml/min)、心輸出量(L/min)的影響(；±s;n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>H9694.9士10530.9±9372.0±9596.4±1U66.4士___^__1596.0__4467.5__4865.43737.63281.6與NS對照組比較*P<0.05;與用藥前比較，AP<0.05。1.5對犬心搏出量、心搏指數(shù)的影響結(jié)果如表5所示，TFA60，30mgkg—12個劑量組在給藥后3(Tl20min內(nèi)能增加心搏出量并提高心搏指數(shù)，與NS對照組比較差異顯著。表5黃蜀葵花總黃酮對犬心搏出量(ml/beat)、心搏指數(shù)(L/beat/m2)的影響(；±s;n=6)給藥后不同時間(min)組別劑量，給藥前-<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>與N對照組比較*P<0.05;與用藥前比較，AP<0.05。1.6對犬心臟指數(shù)、左室作功的影響結(jié)果如表6所示，與NS對照組比較，TFA60，30mgkg—12個劑量組給藥后3(Tl20min內(nèi)能提高心臟指數(shù)(P〈0.05)，但對左室作功無明顯影響(P〉0.05)。表6黃蜀葵花總黃酮對犬心臟指數(shù)(L/min/mO、左室作功(kg.m/min/m"的影響(；±s;n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>與NS對照組比較*P<0.05。1.7對犬每分鐘百克心肌血流量、心肌耗氧指數(shù)的影響結(jié)果如表7所示，與用藥前及NS對照組比較，TFA60,30mg4^12個劑量組在給藥后30120min內(nèi)能增加每IOO克心肌血流量(P<0.05)，但對心肌耗氧指數(shù)無明顯影響(P>0.05)。表7黃蜀葵花總黃酮對犬每分鐘百克心肌血流量(ml/100g/min)、心肌耗氧指數(shù)的影響(S±s;<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>與對照組比較*P<0.05;與用藥前比較，AP<0.05。1.8對犬心肌耗氧量、心肌氧利用率的影響結(jié)果如表8所示，與陽性藥一樣，TFA各劑量組對麻醉犬心肌耗氧量、心肌氧利用率無明顯影響(P>0.05)。表8黃蜀葵花總黃酮對犬心肌耗氧量(ml/100g/min)、心肌氧利用率(％)的影響(；±s;n=6)NS—48.76±6.6250.79±6.1750.92±5.8851.44±3.7051.60±4.56148.56±182.24±216.11±242.00±195.01±20.9236.86*40.47*A58.5"A43.49A155.14±185.92±198.39±222.22±180.41±31.7024.67*28.98一49.44*A27.51169.07±185.44±201.90±236.56±202.47±28.8944.0644.95*59.31*厶50.76181.04±175.60±196.67±213.89±199.27士36.3936.9032.9748.8541.32155.89±152.87±151.79±148.27±146.87±38,0143.8536.3120.1323.20151.30±141.52±139.47±145.27士153.84士25.4430.9117.2234.2322.66154.72土140.77±147.52±143.98±145.38土37.6342.9744.1333.0130.43133.68±131.41±129,17±145.38±142.30±27.0523.9319.1429.6231.34166.84±168.50±155.52±141.98±140.29±24.2656.3647.4649.9140.65給藥后不同時間(min)別劑量給藥前-(mg.kg-1)3060120180_13.49±4.0313.26±4.3113.39±5.6312.41±3.8111.72±2.415010.95士3.9412.21±3.2011.60±5.2815.15±5.1812.86±2.866011.78±6.8013.72±6.5611.38±3.9314.15±5.9912.37±4.333011.71±4.8510.01±2.6812.12±3.4713.95±5.1413.85±6.101514.53±3.8010.94±3.1811.49±2.1113.06±2.9413.61±4.04oGo皿克心肌血流量so必Go區(qū)心肌耗氧指數(shù)sN迅G心肌耗氧量與對照組比較無顯著性差異。2TFA對大鼠急性心肌缺血損傷的保護(hù)作用2.1對急性心肌缺血心肌梗死范圍的影響用NBT染色法顯示心肌梗死范圍的大小，結(jié)果如表9所示，模型組大鼠冠脈結(jié)扎30min，其心肌梗死范圍可達(dá)58.99%±8.94%，而TFA3個劑量組均不同程度地減小了心肌的梗死范圍，均優(yōu)于EGB陽性藥對照組，其中TFA100mg'kg—4且大鼠其心肌梗死范圍僅為41.69%±9.96%，較模型組顯著降低，抑制率達(dá)29%。提示，TFA具有減小心肌梗死范圍的作用。表9TFA對急性心肌缺血大鼠心肌梗死面積的影響(Jr土s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>與Sham組比較，AAP<0.01;與模型組比較，><0.05，><0.012.2對血漿中LDH及CK活力的影響結(jié)果如表10所示，模型組大鼠血漿中LDH及CK的活力均顯著升高，表明冠脈結(jié)扎損傷了大鼠的心肌細(xì)胞膜，LDH及CK從細(xì)胞中外漏，使其在細(xì)胞中活性降低，而在血漿中活性明顯升高。TFAIOO，50，25mg'kg"3個劑量組均可顯著抑制LDH活力的異常增高，同時，TFA100mgkg—1劑量組還可抑制CK活力的異常升高。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表10TFA對急性心肌缺血大鼠血漿中LDH含量及CK活力的影響(^士s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>與Sham組比較，厶厶尸〈0.01;與模型組比較，><0.05，PO.013TFA對離體大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用3.1對心肌組織勻漿中CPK、LDH含量的影響如表11所示，缺血再灌后，大鼠心肌組織勻漿中LDH、CPK的含量均明顯低于正常非缺血組，分別為正常非缺血組的84.22%和59.40%。而TFA(100，50，25mg.L")3個劑量組與缺血組相比，均使LDH的漏出顯著減少。對CPK的漏出，TFA100mg.L"，50mg.L"2個劑量也使其顯著性的降低(P0.05)。表11TFA對缺血再灌注離體大鼠心肌組織勻槳中LDH及CPK活力的影響(X±S，n=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>與非缺血組比較，Ap〈0.05，AAP<0.01;與IR組比較，*尸<0.05，><0.013.2對心肌組織勻漿中MDA含量及SOD活性的影響結(jié)果如表12所示，缺血再灌后，大鼠心肌組織勻漿中MDA生成量明顯高于正常非缺血組，達(dá)正常非缺血組的1.47倍，TFA(100，50，25mg.L—1)3個劑量組與缺血組相比，均使MDA生成量明顯減少，接近于正常非缺血組。與之相反，缺血組SOD活力經(jīng)缺血再灌后明顯低于正常非缺血組，是其81.76%，而采用TFA及Ver灌流，SOD活力均得到明顯提高(尸<0.05,尸<0.01)，最高可達(dá)正常非缺血組的99.92%。表12TFA對缺血再灌注離體大鼠心肌組織勻漿中SOD活力、MDA含量的影響(X±S，n=8)組別劑量(.L陽1)SOD(NU/mg.prot)MDA(nmol/mgprot)非缺血組-35.8±4.18.42.6IR組-29.3±4.1AA12.4±3.0AATFA100mg34.4±3.4*4.5±15承承50mg34.03.7*7.7±4.1*25mg35.81.8**4.6±3.2**Ver6.7nmol35.23.4**7.64.6*與非缺血組比較，，O.Ol;與IR組比較，><0.05,><0.013.3對心肌組織勻漿中NO含量、N0S活力的影響結(jié)果如表13所示，缺血組大鼠心肌組織勻漿中NO、NOS均低于正常非缺血組。與缺血組相比，TFA100mg.與Ver可顯著性地增加NO的生成量，TFA(100mg.L"、25mg.L")和Ver還同時使NOS活力得到顯著性的提高。表13TFA對缺血再灌注離體大鼠心肌組織勻漿中NOS活力、NO含量的影響(X±S，n=8)組別劑量(.L")NO(Umol/g.prot)NOS(U/gprot)非缺血組-1.016±0.339395.876±261.997IR組—0.751±0.412336.385±241.652TFA100mg1.363±0.690*923.481±140.465**50mg0.644±0.324443.476±254.04125mg1.214±0.794659.432±345.595*Ver6.7ymol1.526±0.373**694.229±351.887*與IR組比較，*P<0.05，**P<O.Ol4TFA對缺氧缺糖損傷的體外培養(yǎng)大鼠乳鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用結(jié)果如表14所示，TFA對體外缺氧缺糖所造成的心肌細(xì)胞損傷有顯著保護(hù)作用，在6h及9h兩個不同的時間段均可顯著降低培養(yǎng)液中LDH的活力。表14TFA對體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力的影響(X+-S，n=8)組別對照組模型組TFA劑量(.L'1)Nif100mg30mg10mg5umolLDH(U/L)6h9h37.2±10.443.8±8.0112.5±17.3AA137.6士28.4厶厶52.1±7.7**64.7±9.0**65.8±9.1**85.5±11.3**76.6±11.8**109.8士20.W60.8±10,5**85.7±8.9**與對照組比較，AAP<0.01;與模型組比較，><0.05，5TFA對膠原致血小板聚集率的影響結(jié)果如表15所示，與O.10mg.mr'EGB—樣，在0.0250.10mg.m廣濃度范圍內(nèi)，TFA可明顯抑制加入Coll(lOOmg.ml—1)后2min和5min時的血小板聚集反應(yīng)，最大抑制率均達(dá)到78%。表15TFA對膠原致血小板聚集率的影響(x±s，n=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>與對照組比較,"尸O.Ol6TFA對血栓形成的影響結(jié)果如表16所示，大鼠頸總動脈-靜脈環(huán)路可致血栓形成。與100mg.kg-'EGB結(jié)果相似，100，50，25mgkg—1TFA可明顯降低血栓的濕重;100，50mg.kg—'TFA有降低血栓干重的趨勢，但差異尚無統(tǒng)計學(xué)意義。表16TFA對大鼠頸總動脈-靜脈環(huán)路致血栓形成的影響Cc土s)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。由于大劑量組樣本數(shù)較少，經(jīng)補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如下表。從下表中可以看出，TFA100mg.kg—'組除可顯著降低血栓的濕重，尚可明顯降低血栓的干重，與NS組比較，差異顯著。TFA對大鼠頸總動脈-靜脈環(huán)路致血栓形成的影響(x±s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>與對照組比較，p<0.05，P<0.01。討論與結(jié)論1.犬血流動力學(xué)實(shí)驗(yàn)是研究抗實(shí)驗(yàn)性心肌缺血缺氧藥物必不可少的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，其各項(xiàng)指標(biāo)的測定客觀、直接，是反映藥物對心血管機(jī)能影響的重要手段。本研究通過測定麻醉狀態(tài)下犬的血流動力學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)TFA60，30mg.kg—1，能增加犬冠狀動脈和主動脈的血流量、增加每分鐘100克心肌血流量及心搏出量；提高心搏指數(shù)及心臟指數(shù)；降低左室內(nèi)壓、左室舒張末期壓、總外周血管阻力和冠脈阻力。2.在冠脈結(jié)扎致大鼠急性心肌缺血損傷模型上，TFAIOO，50，25mg.kg—'可顯著減小時心肌的梗死面積，同時顯著抑制LDH從受損心肌細(xì)胞中漏出；在離體大鼠心肌缺血再灌注損傷模型上，TFA0.100，0.050，0.025mgml—'抑制心肌組織中MDA產(chǎn)生，提高SOD活力，減少LDH及CPK的漏出，TFA100mgL—'還可提高NOS活力，促進(jìn)NO生成；在缺氧缺糖致體外培養(yǎng)大鼠乳鼠心肌細(xì)胞損傷模型上，TFA100，30，10mg.L—'可顯著降低缺氧缺糖6h及9h時培養(yǎng)液中LDH的活力，減輕缺氧缺糖所致?lián)p傷，提示TFA對心肌缺血損傷有良好的保護(hù)作用。3.與EGB—樣，TFA在0.1000.025mgm:T范圍內(nèi)，能顯著抑制Coll誘發(fā)的體外血小板聚集反應(yīng)，表明TFA有明顯的抗血小板聚集作用。4.在大鼠頸總動脈-靜脈旁路血栓形成模型上，TFAIOO，50，25mg.kg—'可明顯降低血栓的濕重。由于在第一次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過程中，部分實(shí)驗(yàn)標(biāo)本在烘烤過程中因操作不慎被污染而被剔除，以至各組動物數(shù)不一致，后經(jīng)補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)TFA100mg.kg—'組除可顯著降低血栓的203.01±1.245.10±2.51*5.65±1.116.12±1.921.00±0.490.98±1.021.30±0.590.68±0.47濕重，尚可明顯降低血栓的干重，與NS組比較，抑制率達(dá)40%和45%,提示TFA可明顯抑制血栓的形成。綜上所述，TFA對缺血性心肌損傷有良好的保護(hù)作用，其作用可能與增加冠脈和心肌的血流量、降低血管射血阻力、抑制血小板聚集和血栓形成等有關(guān)。二.黃蜀葵花總黃酮(TFA)對缺血性腦損傷有保護(hù)作用l.TFA對腦缺血損傷的影響1.1TFA對小鼠斷頭后張口喘氣時間的影響結(jié)果如表l所示，20、40、80mg.kg—'TFA可明顯延長小鼠斷頭后張口喘氣時間，并呈一定的量效關(guān)系。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>1.2TFA對夾閉氣管致小鼠ECG時間的影響結(jié)果如表2所示，與60mg.kg—'EGB—樣，在20_80mg.kg—范圍內(nèi)，TFA可明顯延長夾閉氣管致小鼠ECG持續(xù)時間，并呈一定的量效關(guān)系。表2TFA對夾閉氣管致小鼠ECG時間的影響(;c±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>與對照組比4交，P<0.05。1.3TFA對MCAO致大鼠腦缺血損傷的影響1.3.1TFA對腦梗塞組織重量的的影響結(jié)果如表3所示，大鼠MCAO后有明顯的腦梗塞發(fā)生，與EGB—樣，TFA可顯著降低腦梗塞組織重量百分比，在25~100mg.kg"范圍內(nèi)呈一定的量效關(guān)系。表3TFA對MCA0Sbtt^feHili口、重4^f攤(x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>與對照組比較，P<0.05,**P<0.01。1.3.2TFA對MCAO大鼠腦組織中LDH活性和NO含量的的影響結(jié)果如表4所示，與EGB—樣，100mg.kg—1TFA可明顯抑制MCAO大鼠腦組織中LDH活性的降低，25、50mg.kg—'TFA對MCAO大鼠腦組織中LDH活性的降低也有抑制趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；25、50、lOOmg.kg—'TFA還能顯著抑制MCAO大鼠腦組織中NO含量的降低。表4TFA對MCAO致大鼠腦組織中LDH活性和N0^t^;景攤(;<;±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>與對照比4交，P<0.01。1.4TFA對不完全性腦缺血的影響1.4.1對腦含水量和血管通透性的影響結(jié)果如表5所示，與100mg.kg—1EGB—樣，50、100mg.kg—1TFA可抑制大鼠雙側(cè)CCA結(jié)扎致腦水腫的發(fā)生；TFA和EGB對CCA結(jié)扎致腦大鼠組織血管通透性(伊文思藍(lán)OD值)的升高雖有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表5TFA對雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎致大鼠腦缺血的影響(;drs)ffla|劑量腦組織含水量腦組織血管通透性一且力」(mg.kg—1)n百分比(％)(0D值.g—L)與對照比較，*P<0.05,"P<0.01;括號內(nèi)數(shù)字為樣本數(shù)。2.TFA對狗腦血流量等指標(biāo)的影響2.1TFA對狗頸內(nèi)動脈血流量的影響結(jié)果如表7所示，與50mg.kg'EGB—樣，用藥45min時，25、50mg.kg—1TFA可明顯增加狗頸內(nèi)動脈血流量(與對照組比較)，60呢.kg—'TFA雖有增加的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表7TFA對狗頸內(nèi)動脈血流量(ml/min)的影響G士s，n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>與用藥前比較，'P〈0.05，與對照組比較，AP〈0.05。2.2TFA對狗腦血管外周阻力的影響結(jié)果如表8所示，用藥45min時，與50mg.kg—1EGB—樣，30mg.kg—1TFA可明顯降低狗腦血管外周阻力(與對照組及用藥前比較)，且其作用可持續(xù)到90min時(與對照組比較)，15、60mg.kg—'TFA也有增加的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表8TFA對狗腦血管外周阻力(mmHg/ml/min)的影響(x±s，n=6)_<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>151.89±0.861.54±0.4539.80.31*1.76±0.6131.5與用藥前比較，AP〈0.05，與對照組比較，*P<0.05。2.3TFA對狗動脈血壓、ECG和心率的影響與對照組及用藥前比較，15、30、60mg.kg—1TFA對狗平均動脈血壓和心率均無明顯的影響；除15mg.kg—1TFA組的ST段在用藥前與對照組比較有明顯的抬高外，各組ECG的其它指標(biāo)均未見明顯的變化(表9、表IO)。3.TFA對膠原致血小板聚集率的影響結(jié)果如表ll所示，與O.10mg.m廣EGB—樣，在0.025—0.10mg.ml—'濃度范圍內(nèi)，TFA可明顯抑制加入膠原液(100mg.ml—')后2min和5min時誘導(dǎo)的血小板聚集反應(yīng)。表9TFA對狗動脈平均血壓的影響G±s，n=6)組別齊IJ量動脈平均血壓(mmHg)(mg.kg—1)用藥前用藥45rain用藥90min對照一84.8±21.6101.7±15.7104.3±18.6EGB5089.7±14.898.8±8.7103.0±11,3TFA6088.4±21.391.2±22.888.0±15.130107.5±14.4105.4±26.4103.8±21.61591.1±24.7100.3±28.597.3±21.2與用藥前比較，P>0.05，與對照組比較，P〉0.05。表IOTFA對狗心率ECG和的影響(A"土s，n=6)組別劑量(mg.kg-1)HR(bpm)P(mv)QRS(Sec)PR(Sec)ST(mv)T(mv)田蓀前對照EGBTFA50603015田藥對照EGB50202±29198±34199±31197±18207±43202±40177±230.36±0.051±0.10±0.003±0.263±0.090.0050.010.0050.1350.43±0.055±0.09±0.010±0.247±0.070.0050.010.0060.1740.42±0.050±0.09±0.010±0.278±0.100.0050.010.0100.1450.40±0.052±0.10±0.010±0.313±0.110.0060.030.0060.1270.39±0.053±0.11±0.017±0.303±0.130.0060.030.008"0.2290.38±0.049±0.10±0.007±0.248±0.050.0060.010.0080.1410.44±0.055±0.10±0.011±0.217±TFA603015頃蓀對照EGBTFA50603015201±29193±28165±26194±39176±25209±21192±41187±310.050.0030.000.0100.1150.41±0.050±0.09±0.010±0,302±0.090.0040.010.0100.141o.41±0.053±0.10±0.005±0.315±0.120.0050.040.0050.0940.38±0.053±0.11±0.008±0.252±'0.120.0050.020.0080.1550.39±0.048±0.10±0.007±0.258±0.020.0040.010.0080.1520.45±0.049±0.10±0.008±0.283±0.080.0060.010.0100.1540.41±0.052±0.08±0.008±0.408±0.080.0040.010.0040.2160.42±0.052±0.12±0.012±0.335土0.140.0060.030.0100.1200.39±0.053±0.10±0.007±0.311±0.120.0060.040.0050.160與對照組比較，"P〈0.01。4.TFA對血栓形成的影響結(jié)果如表12所示，大鼠頸總動脈-靜脈環(huán)路可致血栓的形成，與lOOmg.kg—'EGB—樣，25、50、lOOmg.kg—'TFA可明顯降低血栓的濕重;50、100mg.kg—1TFA有降低血栓的干重的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表llTFA對膠原致血小板聚集率的影響G±s，n=8)組別濃度(mg.ml—1)2min(%)5min(%)聚集率抑制百分率聚集率抑制百分率對照一23.8±3.0_26.8±3.4一EGB0.1011.9±2.850.013.1±3.0::51.1TFA0.02510.2±1、9:57.111.8±4、(T60.00.0506.6±2.3**72.36.5±3.4**75.70.1005.2±2.0"78.25.9±1.6"78.0與對照組比較，"P<0.01。表12TFA對大鼠頸總動脈-靜脈環(huán)路致血栓形成的影響6H:s)組另u齊U量(mg.kg-')n血栓濕重(mg)血栓干重(mg)對照一98.39±2.511.19±0.81EBG100106.12±1.92*0.68±0.47TFA25105.65±1.11*1.30±0.595085.10±2.51::0.98±1.0210043.01±1.24**l.OO土O.49與對照比較，*P<0.05，*P<0.01。討論與結(jié)論1.小鼠斷頭后張口喘氣模型是一篩選研究抗腦缺血、缺氧藥物較好的實(shí)驗(yàn)方法，其特點(diǎn)為重復(fù)性好、快速簡便。在該模型上，本研究發(fā)現(xiàn)20、40、80mg.kg—'TFA可明顯延長小鼠斷頭后張口喘氣時間；大鼠MCAO是一常用的研究腦缺血損傷的動物模型，與人腦梗塞損傷較為接近。本研究在該模型上發(fā)現(xiàn)，與IOOmg.kg—'EGB—樣，在25—100mg.kg—'范圍內(nèi)，TFA能顯著減輕腦組織梗塞重量，并呈一定的量效關(guān)系，100mg.kg—1TFA可顯著抑制缺血腦組織中LDH活性的下降，25、50、100mg.kg—'TFA還能顯著抑制MCAO大鼠腦組織中NO含量的降低；在雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎致大鼠不完全性腦缺血模型上，50、100mg.kg—'TFA與50mg.kg—1EGB—樣可顯著抑制腦水腫的發(fā)生，并顯著地改善缺血致腦組織的病理形態(tài)學(xué)的變化。這些結(jié)果表明TFA對腦缺血、缺氧性損傷有保護(hù)作用，其作用可能與提高腦組織中NO含量有關(guān)；另外20、40、80mg.kg—'TFA可明顯延長夾閉氣管致小鼠ECG的持續(xù)時間，此結(jié)果也提示著TFA對缺血、缺氧性損傷有保護(hù)作用。2.通過電磁流量計等方法發(fā)現(xiàn)15、30mg.kg—1TFA能顯著增加給藥45min時狗頸內(nèi)動脈血流量；30mg.kg—1TFA可明顯降低狗腦血管外周阻力，其作用可持續(xù)到90min時；15、30、60mg.kg-1TFA對狗平均動脈血壓和心率均無明顯的影響，實(shí)驗(yàn)中僅見15mg.kg—'TFA組的ST段在用藥前時與對照組比較有明顯的抬高，但由于系發(fā)生在用藥前，并且用藥后45和90min也恢復(fù)正常，推測可能是麻醉引起的暫時性神經(jīng)反射所致，與藥物本身無關(guān)。結(jié)果表明TFA在不明顯影響全身動脈血壓和心臟功能的情況下可顯著增加腦血流量和降低狗腦血管外周阻力，其作用有一定的選擇性。3.與EGB—樣'TFA在0.025—0.100mg.ml—1范圍內(nèi)，能顯著抑制Coll誘發(fā)的家兔血小板聚集反應(yīng)，表明TFA有明顯的抗血小板聚集作用。4.在大鼠頸總動脈-靜脈旁路血栓形成模型上，25、50、100mg.kg—'TFA可明顯降低血栓的濕重，提示TFA對血栓形成有抑制作用。綜上所述，與EGB—樣，TFA對缺血性腦損傷有保護(hù)作用，其作用可能與增加腦血流量及降低腦血管外周阻力、抗血小板聚集和抑制血栓形成有關(guān)。權(quán)利要求1、一種黃蜀葵花提取物，是自黃蜀葵花中提取的主要含黃酮類活性成分的提取物，其特征在于提取物中含有槲皮素-3-洋槐糖苷、金絲桃苷，異槲皮苷、槲皮素-3′-葡萄糖苷、棉皮素-3′-葡萄糖苷、楊梅素-3-葡萄糖苷、棉皮素、楊梅素、槲皮素黃酮類化合物；提取物中總黃酮含量以金絲桃苷計為50-75wt％；其中金絲桃苷含量為10.0-15.0wt％，異槲皮苷含量為7.0-12.0wt％、槲皮素-3′-葡萄糖苷含量為8.0-12.0wt％。2、由權(quán)利要求1所述的黃蜀葵花提取物的提取方法包括粗提取物的制備和精制，所述的粗提取物的制備是黃蜀葵花用至少5倍量(w/v)濃度為75%乙醇溶液回流提取至少兩次，得到乙醇提取液,將乙醇提取液減壓濃縮至1/5體積后分離得到濃縮液(I)，濃縮液(I)上HPD400或HPD700大孔吸附樹脂層析柱，先水洗脫5-8柱體積，次用10%乙醇洗脫1-2柱體積，最后用65%乙醇或65%甲醇洗脫至無^/03反應(yīng)，收集65%乙醇或65%甲醇洗脫液，減壓、脫溶、干燥后得到粗提物；粗提物用醋酸乙酯-乙醇共沸點(diǎn)混合液或醋酸乙酯-甲醇共沸點(diǎn)混合液回流提取至少兩次，得到精提液，精提液減壓脫溶、干燥后得到黃蜀葵花提取物。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的提取方法，其特征在于乙醇提取液減壓濃縮至濃縮液體積與生藥之比為0.5-1:1時分離得到濃縮液(II)，濃縮液(II)用水飽和的正丁醇溶液萃取至少5次，得到萃取液，萃取液減壓脫溶、干燥后得到粗提物。4、由權(quán)利要求1所述的黃蜀葵花提取物的分析方法，是指提取物中總黃酮指紋圖譜分析方法，其特征在于采用液相色譜及以下條件測定指紋圖譜(l)色譜柱采用0DS-C18色譜柱150mmx4.6mm，5yra;(2)流動相采用線性梯度洗脫，其中A相為乙腈一甲醇(10:1)，B相為0.4%磷酸溶液.流動相梯度；時間(min)A(%)B(%)時間(min)A(%)B(%)0-32168432-35277335-52277352-53168453-601684(3)檢測波長為360nm:(4)柱溫為27。C;(5)流速1.Oml/min。5、由權(quán)利要求1所述的黃蜀葵花提取物制劑，是以提取物為活性成分的口服制劑，其特征在于由提取物和藥用輔料加工的滴丸或片劑或膠囊劑或軟膠囊劑。6、由權(quán)利要求1所述的黃蜀葵花提取物的用途，其特征在于該提取物在制備治療心腦缺血疾病藥物中的應(yīng)用。全文摘要一種黃蜀葵花提取物，其總黃酮含量以金絲桃苷計為50-75wt％；其中金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素-3′-葡萄糖苷含量依次為10.0-15.0wt％、7.0-12.0wt％和8.0-12.0wt％，且有總黃酮指紋圖譜。該提取物由黃蜀葵花乙醇提取液的濃縮液通過HPD400或HPD700大孔吸附樹脂柱層析得到粗提物，或由濃縮液用正丁醇萃取得到粗提物，并用醋酸乙酯-乙醇共沸點(diǎn)混合液或醋酸乙酯-甲醇共沸點(diǎn)混合液回流提取得到精提液，精提液減壓脫溶、干燥后而制得。并構(gòu)建了相應(yīng)的含量和指紋圖譜測定方法。該提取物制劑，是以提取物為活性成分和藥用輔料加工制成的滴丸或片劑或膠囊劑或軟膠囊劑。該提取物的用途是在制備治療心腦缺血疾病藥物中的應(yīng)用。文檔編號A61P9/10GK101385748SQ20081019592公開日2009年3月18日申請日期2008年9月5日優(yōu)先權(quán)日2008年9月5日發(fā)明者周春曉,汪年生,勤王,慧袁,磊趙,陳志武申請人:周春曉;王勤