專利名稱：：黃蜀葵花有效部位——總黃酮提取物的制備工藝及新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是指一種黃蜀葵花有效部位一總黃酮提取物的新用途，具體是在制備治療急慢性胃炎、消化系統(tǒng)潰瘍藥物、燒燙傷、外傷感染藥物以及癰疽腫毒藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：黃蜀葵花為錦葵科植物黃蜀葵Abelmoschusmanihot(L.)Medic.的干燥花冠(帶雄蕊及花柱)，收載于《江蘇省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(1989年版)增補(bǔ)本、《山東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》2002年版。具有清利濕熱，消炎解毒之功效，是我國傳統(tǒng)的藥用植物，入藥歷史可追溯至1500年前晉朝葛洪所著的《肘后方》，記載其"通淋，消腫，解毒。治淋病，癰疽腫毒，湯火燙傷。"在民間有較多的應(yīng)用，用以治療疔瘡、腮腺炎、尿道感染、肺熱咳嗽及燒燙傷等。現(xiàn)代化學(xué)成分研究資料表明，黃蜀葵花的主要成分為黃酮類化合物，在藥理實(shí)驗(yàn)研究方面，有文獻(xiàn)報(bào)道黃蜀葵花的黃酮類成分具有抗炎解熱，抗皰疹病毒，保護(hù)心肌缺血、心腦缺氧性損傷、治療腎病綜合癥等藥理作用。中國專利93110506.4公開了一種利用黃蜀葵花粗提物作為藥物活性成分的治療原發(fā)性腎小球疾病及乳糜尿的藥物；中國專利200610097615.6公開了一種黃蜀葵花總黃酮提取物用于制備治療腎炎藥物。盡管目前對(duì)于黃蜀葵花的研究眾多，但對(duì)于其在民間廣泛應(yīng)用治療"癰疽腫毒，湯火燙傷"的作用，目前尚未有相關(guān)的現(xiàn)代藥理臨床研究報(bào)道，我們經(jīng)藥理預(yù)試研究發(fā)現(xiàn)，從黃蜀葵花中提取分離制備的總黃酮提取物(我們申報(bào)的中國專利200410035741.X，提供了一種黃蜀葵花總黃酮提取物的提取制備方法)制成的軟膏，對(duì)于小鼠ir燙傷模型，在給藥7、14天可明顯縮小燙傷創(chuàng)面面積(P<0.05);給藥14天治療組的小鼠燙傷創(chuàng)面脫痂情況明顯好于相應(yīng)的空白基質(zhì)組(P<0.05)。因此認(rèn)為黃蜀葵花總黃酮提取物制成的軟膏作為一種外用藥，對(duì)燙傷局部有確切的促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用，該藥理作用與民間應(yīng)用相吻合；鎮(zhèn)痛及抗炎試驗(yàn)結(jié)果表明該總黃酮提取物還具有減輕創(chuàng)面疼痛、減少感染幾率的作用。上述作用提示黃蜀葵花總黃酮提取物在燒燙傷，及類似的外傷感染、癰疽腫毒等方面具有很好的應(yīng)用前景。從而完成了本發(fā)明。此外，我們?cè)趯?duì)黃蜀葵花總黃酮進(jìn)行系統(tǒng)的活性研究過程中發(fā)現(xiàn)，總黃酮對(duì)口腔潰瘍具有良好的治療作用，全面系統(tǒng)的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了其對(duì)潰瘍面具有明確的促進(jìn)愈合、抗炎、抑菌及鎮(zhèn)痛活性(已申報(bào)發(fā)明專利，專利申請(qǐng)?zhí)枮?00710113698.8，該專利提供了一種側(cè)金盞總黃酮口腔貼片在治療口腔潰瘍方面的用途及其制備方法)。該項(xiàng)研究結(jié)果提示，黃蜀葵花的黃酮類化合物可能對(duì)消化性潰瘍?nèi)缥笣?、十二指腸潰瘍也具有一定的作用，但目前尚未有以黃蜀葵花總黃酮治療胃潰瘍及十二指腸潰瘍的文獻(xiàn)報(bào)道。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，在1999年已有學(xué)者對(duì)"金絲桃苷對(duì)小鼠胃粘膜損傷的保護(hù)作用及機(jī)制"進(jìn)行了公開發(fā)表，其研究結(jié)果顯示，金絲桃苷可降低小鼠乙醇性胃黏膜損傷面積。考慮黃蜀葵花總黃酮提取物含有十余種結(jié)構(gòu)類似的黃酮化合物成分，其中金絲桃苷含量高達(dá)10%以上，總黃酮含量達(dá)50%以上，可以發(fā)揮協(xié)同作用。有鑒于此，我們進(jìn)行了深入的藥理預(yù)試研究，對(duì)黃蜀葵花總黃酮和金絲桃苷的促進(jìn)胃潰瘍粘膜愈合作用進(jìn)行比較。結(jié)果表明，二者均能明顯降低小鼠乙醇性胃黏膜損傷面積，與金絲桃苷相比，總黃酮提取物的縮小損傷面積更小。由此推斷黃蜀葵花總黃酮具有比金絲桃苷更好的保護(hù)胃潰瘍粘膜損傷的作用，對(duì)急慢性胃炎、胃潰瘍有效。同時(shí)，將該提取物以腸溶形式制成制劑，對(duì)十二指腸潰瘍亦具有相同的作用。從而完成了本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種黃蜀葵花有效部位——總黃酮提取物的藥物新用途，具體是用作制備治療急慢性胃炎、消化性潰瘍、燒燙傷、外傷感染以及以及癰疽腫毒的藥物中的用途。本發(fā)明所指的黃蜀葵花總黃酮有效部位特指中國發(fā)明專利200410035741.X所提取得到的黃蜀葵花總黃酮提取物，本發(fā)明嚴(yán)格遵守上述專利中的制備方法，為了確證質(zhì)量，我們用高效液相和紫外_分光光度法控制提取物中主要有效成分金絲桃苷和總黃酮含量。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種治療急慢性胃炎、消化性潰瘍、燒燙傷、外傷感染以及癰疽腫毒的藥物組合物，含有治療有效量的黃蜀葵花有效部位——總黃酮提取物和藥用載體。所述藥物組合物，還可以含有有效治療劑量的黃蜀葵花總黃酮提取物和其他具有抗炎、抑菌、鎮(zhèn)痛作用的藥物。上述藥物組合物可以采用制劑學(xué)的常規(guī)方法制備成各種劑型，如治療急慢性胃炎、消化性潰瘍采用口服的片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液、腸溶衣片、腸溶膠囊等；治療燒燙傷、外傷感染以及癰疽腫毒采用外用的軟膏、乳膏、噴霧劑、凝膠劑等。建議臨床患者使用黃蜀葵花總黃酮有效部位的劑量為250500mg/次，一日三次。藥理試驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明總黃酮提取物對(duì)體外幽門螺桿菌具有較好的抑菌作用；對(duì)酸性乙醇致大鼠急性胃粘膜損傷具有明顯的保護(hù)作用；具有抗炎鎮(zhèn)痛作用；對(duì)小鼠11°燙傷模型，在給藥7、14天可明顯縮小燙傷創(chuàng)面面積。上述藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明提取物對(duì)治療急慢性胃炎、消化性潰瘍、燒燙傷、外傷感染以及癰疽腫毒具有良好的效果。此外，將本發(fā)明制成顆粒，為60例胃潰瘍患者試用結(jié)果表明，與枸櫞酸鉍雷尼替丁片比較，黃蜀葵花總黃酮顆粒對(duì)胃炎的癥狀改善總有效率91.7%，尤其是2周內(nèi)使上腹痛消失率高達(dá)89.4%，對(duì)上腹痛、不適、飽脹、反酸、噯氣等消化不良癥狀均有明顯改善。因此，我們認(rèn)為本品可望治療急慢性胃炎，減少胃潰瘍復(fù)發(fā)率，而且安全可靠，值得推廣應(yīng)用。為更好的理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面具體說明黃蜀葵花總黃酮有效部位在制藥領(lǐng)域中的新用途。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1黃蜀葵花有效部位——總黃酮提取物的制備將黃蜀葵花加80%乙醇適量，提取1次，提取2小時(shí)，合并提取液，濾過，濾液濃縮成6(TC時(shí)相對(duì)密度為1.131.16的濃縮液，加適量水水沉24h，抽濾，濃縮至相應(yīng)體積，通過大孔吸附樹脂柱，采用醇水梯度洗脫，水洗脫3個(gè)柱體積，10%及30%乙醇各洗脫3個(gè)柱體積，70%乙醇洗脫1個(gè)柱體積。洗脫液濃縮、干燥、粉碎后得到黃蜀葵花總黃酮提取物，其總黃酮含量為65%。實(shí)施例2黃蜀葵花總黃酮有效部位膠囊的制備取黃蜀葵花總黃酮有效部位提取物250g，硬脂酸鎂50g，過80目篩充分混勻，干法制粒，灌裝膠囊1000粒，每粒含黃蜀葵花總黃酮有效部位250mg。用法每次2粒，每日三次。實(shí)施例3黃蜀葵花總黃酮有效部位片劑的制備取黃蜀葵花總黃酮有效部位提取物250g，微晶纖維素45g，混勻，乙醇濕法制粒，過20目篩。加入硬脂酸鎂5g，混勻，壓制成片重為0.3g/片的片劑1000片，每片含黃蜀葵花總黃酮有效部位250mg。用法每次2片，每日三次。實(shí)施例4黃蜀葵花總黃酮有效部位顆粒劑的制備取黃蜀葵花總黃酮有效部位提取物250g，糊精150g，過80目篩充分混勻，乙醇濕法制粒，包裝成每袋4g的顆粒劑1000袋，每袋含黃蜀葵花總黃酮有效部位250mg。用法每次12袋，每日三次。實(shí)施例5黃蜀葵花總黃酮有效部位乳膏的制備取黃蜀葵花總黃酮有效部位提取物50g，加入甘油60g、三乙醇胺10g、羥苯乙酯2g及水適量，混勻，加熱至85t:，制成水相；另取硬脂酸100g、單硬脂酸甘油酯20g、液狀石蠟60g、十八醇20g、月桂氮卓酮20g、羥苯丙酯lg，加熱至8(TC，制成油相。將油相緩緩加入水相中，攪拌至乳化，制成軟膏1000g，放冷，即為本發(fā)明的乳膏劑。用法外用，先用溫開水清洗患處，再以本品擦患處，每日早晚各涂擦1次。實(shí)施例6藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)(—)體外幽門螺桿菌抑菌試驗(yàn)1、制備含藥瓊脂平板將受試物按倍比稀釋配制不同藥物濃度的培養(yǎng)基，加熱，調(diào)至各自所需ph值，10磅30min滅菌，冷至45。C。傾注成無菌平板(平皿d=65mm、10mL/平皿)，最終使培養(yǎng)基中含受試物原液(0.38g/mL)的稀釋倍數(shù)分別為l:2，1:4、……1:1024。同時(shí)做空白對(duì)照培養(yǎng)基。2、接種取傳至第3代的幼齡菌，分別用生理鹽水按標(biāo)準(zhǔn)比濁管校正濃度為108cfu/mL的待檢菌液，分別接種于不同倍比稀釋的各自含藥瓊脂表面，同時(shí)接種平行點(diǎn)3點(diǎn)，使每點(diǎn)含2ul菌液，每一接種點(diǎn)的液滴直徑為5-8mrn。待接種點(diǎn)干燥后，翻轉(zhuǎn)平板于36t:恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)20h觀察結(jié)果，同時(shí)做空白對(duì)照，判定標(biāo)準(zhǔn)以不出現(xiàn)菌落的瓊脂平板上的最低稀釋受試物濃度為其最低抑菌濃度MIC。3、結(jié)果本品對(duì)幽門螺桿菌有明顯的抑菌作用，其最低抑菌濃度(MIC)為0.00298g/ml。(二)抗炎試驗(yàn)1.試驗(yàn)方法將體重27-32g雄性小鼠50只，隨機(jī)分為黃蜀葵花總黃酮提取物大劑量組(500mg/kg)、中劑量組(250mg/kg)、小劑量組(125mg/kg)、阿司匹林(200mg/kg)陽性對(duì)照組和自來水空白對(duì)照組，每組10只。每日灌胃給藥一次，連續(xù)3天，灌胃體積0.8ml/29g，對(duì)照組灌胃等體積的自來水。末次給藥后1.5小時(shí)，將30ul二甲苯涂于小鼠左耳廓前后兩面致炎，右側(cè)耳廓作為對(duì)照。致炎后30分鐘將小鼠處死，用直徑9mm打孔器在相同的部位取下左、右耳片，稱重，計(jì)算左、右耳片重量差為腫脹度。結(jié)果見表l。表1.對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響(n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*:與空白對(duì)照組相比2.試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果表明，黃蜀葵花總黃酮提取物250mg/kg—500mg/kg對(duì)二甲苯所引起的小鼠耳廓腫脹具有明顯的抑制作用(P<0.05)。[O(HO](三)鎮(zhèn)痛試驗(yàn)1.試驗(yàn)方法預(yù)選痛閾(熱板溫度55±0.5°C)在30秒鐘內(nèi)的小鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分為黃蜀葵花總黃酮提取物大劑量(500mg/kg)組、中劑量(250mg/kg)組、小劑量(125mg/kg)組，陽性對(duì)照(500mg/kg)組及空白對(duì)照組，灌胃給藥，體積0.8ml/20g，對(duì)照組給等體積的水。將小鼠置XZC-2B型自控溫度熱板儀中，分別測定各鼠給藥后90、120、150分鐘時(shí)的疼痛閾值。2.試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果見表2。結(jié)果表明，黃蜀葵花總黃酮提取物大劑量、中劑量及陽性對(duì)照物可明顯提高熱板法所引起的疼痛閾值(P<0.05)。表明黃蜀葵花總黃酮提取物有一定的鎮(zhèn)痛作用。表2.對(duì)小鼠熱板致痛的影響(n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*分別與空白對(duì)照組相比P<0.05(四)胃潰瘍?cè)囼?yàn)觀察黃蜀葵花總黃酮提取物與金絲桃苷對(duì)酸性乙醇致大鼠急性胃粘膜損傷的影響。動(dòng)物分組，于給藥第7天各組動(dòng)物分別禁食不禁水48h，試驗(yàn)前各組動(dòng)物再灌胃給藥(水)l次，2h后每只大鼠灌胃酸性乙醇2mL(150mmol/L鹽酸-60X乙醇)，lh后分別用過量乙醚麻醉大鼠致死，開腹取胃，用夾子夾緊賁門，由幽門注入1^甲醛溶液5mL，夾緊幽門，將全胃置于1%甲醛溶液中固定10min，沿胃大彎剪開，將胃外翻，用清水輕輕洗去內(nèi)容物，將胃平鋪于玻璃扳上，用精密卡尺測量胃黏膜損傷長度，以損傷長度(損傷寬度大于lmm者加倍計(jì)算)總和作為胃黏膜損傷指數(shù)，并計(jì)算抑制率，結(jié)果見表3。表3對(duì)酸性乙醇致大鼠急性胃黏膜損傷的影響x士s<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>與模型對(duì)照組比較fp>0.05。。P<0.05...P<0.01從結(jié)果可見，各組大鼠胃粘膜均有不同程度損傷，黃蜀葵花總黃酮0.28g/kg、0.84g/kg、金絲桃苷0.lg/kg及三九胃泰0.5g/kg均較模型對(duì)照組輕，損傷指數(shù)明顯降低(P<0.05)。(五)黃蜀葵花總黃酮軟膏對(duì)小鼠燒燙傷的治療作用1、實(shí)驗(yàn)方法選健康雄性昆明小鼠30只，體重25-30g，建立模型前24小時(shí)將小鼠背部剪毛，再用配制好的Na2S將小鼠背部脫毛，脫毛區(qū)面積為2.5X2.5cm。脫毛后24小時(shí)用YLS-Q5便攜式溫控燙傷儀建立小鼠燙傷模型。燙傷儀直徑16mm、表面溫度10(TC、壓力500g。造模時(shí)將燙傷儀表面直接接觸小鼠背部脫毛區(qū)4秒鐘，創(chuàng)面皮膚組織蒼白，創(chuàng)面損傷均勻一致，創(chuàng)緣形成環(huán)繞一圈的白色邊界線，與周圍正常皮膚可明顯分界，造模即刻無水泡形成。此為小鼠ir燙傷模型。2、分組與給藥模型建立后立即將小鼠隨機(jī)分為黃蜀葵花總黃酮軟膏(40g/kg)、空白基質(zhì)，每組10只小鼠，空白基質(zhì)組給藥體積同受試物組。將各試驗(yàn)藥物及賦形劑均勻涂于相應(yīng)各組小鼠背部創(chuàng)面，每日涂藥2次，連續(xù)用藥至創(chuàng)面完全愈合。3、觀察指標(biāo)于燙傷第7、14天測量小鼠燙傷區(qū)創(chuàng)傷面積，于燙傷第14、15天記錄小鼠脫痂及皮毛再生情況。結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)及x2檢驗(yàn)。4、結(jié)果見表4:表4-1黃蜀葵花總黃酮軟膏對(duì)小鼠燙傷面積的影響(n=10，X士SD)測量時(shí)間劑量組別燙傷面積(mm2)P值給藥7天-40g/kg空白基質(zhì)黃蜀葵花總黃酮軟膏1.717土0.283].358±0.257<0.05給藥14天—40g/kg空A基質(zhì)黃蜀葵花總黃酮軟膏0.8i7±0.3230.459±0.278<0.05表4_2.黃蜀葵花總黃酮軟膏對(duì)小鼠燙傷創(chuàng)面脫痂的影響j量時(shí)間劑量組別脫痂小鼠數(shù)(只)/未脫痂小鼠數(shù)(只)x2值給藥14天40g/kg空白基質(zhì)黃蜀葵花總黃酮軟膏2/107/10<0.05表4-3.黃蜀葵花總黃酮軟膏對(duì)小鼠燙傷創(chuàng)面皮毛再生的影響J量時(shí)間劑量組別皮毛再生小鼠數(shù)(只)/皮毛未再生小鼠數(shù)x2值(只)給藥15天40g/kg空白基質(zhì)黃蜀葵花總黃酮軟膏0/104/10>0.055、結(jié)論試驗(yàn)結(jié)果表明黃蜀葵花總黃酮軟膏在給藥7、14天可明顯縮小燙傷創(chuàng)面面積(P<0.05);給藥14天黃蜀葵花總黃酮軟膏組的小鼠燙傷創(chuàng)面脫痂情況明顯好于相應(yīng)的空白基質(zhì)組，(P<0.05)。本試驗(yàn)認(rèn)為黃蜀葵花總黃酮軟膏作為一種外用藥對(duì)燙傷局部有促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用。實(shí)施例7黃蜀葵花總黃酮顆粒胃炎患者的治療作用1、治療對(duì)象選擇有上腹痛、上腹脹滿、返酸、噯氣等上消化道癥狀，經(jīng)胃鏡及活檢證實(shí)為Hp陽性的慢性胃炎患者120例2、治療方法治療組60例黃蜀葵花總黃酮顆粒500mg，每天3次，飯后服用；對(duì)照組60例金得樂(枸櫞酸鉍雷尼替丁片)，每粒0.2克，每次2粒，一日2次，口服。兩組治療期間停用其他胃炎藥物。3、療效評(píng)價(jià)兩組在治療前及治療后各記錄一次癥狀、體征及胃鏡下粘膜狀況及胃粘膜組織學(xué)變化，試驗(yàn)結(jié)束后，所有臨床資料匯總，建立數(shù)據(jù)庫，用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。本研究主要數(shù)據(jù)為計(jì)量資料，若為正態(tài)分布，自身前后比較用配對(duì)t檢驗(yàn)，若為非正態(tài)分布，則用秩8和檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用x2檢驗(yàn)。4、治療結(jié)果(1)治療后主要癥狀改變(見表5)。表5治療前后主要癥狀比較組別例數(shù)胃痛痞滿反酸嘈雜口干苦便溏治療前60585428374135治療組治療后60657597治療前60485730203927對(duì)照組治療后601316792115結(jié)果表明，治療組在改善痞滿、嘈雜、口干苦、便溏方面優(yōu)于對(duì)照組(P<0.05)，胃痛、反酸癥狀改善也明顯。(2)主要癥狀改善情況，見表6:表6主要癥狀改善比較組別例數(shù)治愈顯效有效無效總有效率(％)治療組對(duì)照組603117760208122091.766.7(3)2組病人胃鏡復(fù)查結(jié)果，結(jié)果見表7。(％)組另U例數(shù)愈合例顯效例有效例無效例愈合帛s對(duì)照組治療組6029(48.3)13(21.7)9(15.0)6040(66.7)8(13.3)7(11.7)10(16.7)4(6.7)70.085.080.091.7(4)腹痛消失情況2組病人治療后疼痛消失時(shí)間結(jié)果見表8。表82組病人治療后疼痛消失時(shí)間比較消失時(shí)間_對(duì)照組(%)__治療組(%)_2周內(nèi)45/57(79.0)51/57(89.4)4周內(nèi)51/57(89.5)53/57(93.0)_未消失_6/57(10.5)_4/57(7)_5、結(jié)論黃蜀葵花總黃酮顆粒治療組對(duì)胃炎的癥狀改善總有效率91.7%，尤其是2周內(nèi)使上腹痛消失率高達(dá)89.4%，對(duì)上腹痛、不適、飽脹、反酸、噯氣等消化不良癥狀均有明顯改善。權(quán)利要求一種黃蜀葵花有效部位，其特征在于該有效部位由下述方法制得取黃蜀葵花藥材，加50～90％乙醇回流提取，提取液濃縮，水沉24h，抽濾，濾液通過大孔吸附樹脂柱，采用醇水梯度洗脫，洗脫液濃縮、干燥，得到黃蜀葵花有效部位——總黃酮提取物。2.如權(quán)利要求1所述的黃蜀葵花有效部位，在制備治療急慢性胃炎、消化系統(tǒng)潰瘍藥物中的用途。3.如權(quán)利要求1所述的黃蜀葵花有效部位，在制備治療燒燙傷藥物中的用途。4.如權(quán)利要求1所述的黃蜀葵花有效部位，在制備治療外傷感染藥物以及癰疽腫毒藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明是一種黃蜀葵花有效部位——總黃酮提取物的制備工藝及新用途，具體是在制備治療急慢性胃炎、消化系統(tǒng)潰瘍藥物、燒燙傷、外傷感染藥物以及癰疽腫毒藥物中的用途。文檔編號(hào)A61P31/00GK101757053SQ200810238150公開日2010年6月30日申請(qǐng)日期2008年12月9日優(yōu)先權(quán)日2008年12月9日發(fā)明者凌沛學(xué),吳永霞,尚立霞,張玲,曲延偉申請(qǐng)人:凌沛學(xué)