專利名稱：一種環(huán)菠蘿蜜烷三萜皂苷化合物及其抗腫瘤作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從類葉升麻全草或根莖中提取分離一種新化合物及其衍生物，其骨架屬于環(huán)菠蘿蜜烷型三萜皂苷；本發(fā)明還涉及該化合物在制備藥物方面的用途，特別是在制備抗腫瘤藥物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
升麻族(Tribe Cimicifuga)屬于毛茛科，包括鐵破鑼屬，黃三七屬，升麻屬，類葉升麻屬，和垂果升麻屬5個屬群。其中類葉升麻[Actaea asiatica Hara]系類葉升麻屬(Actaea)植物；是一種民間常用草藥。其根莖或全草藥用，具有發(fā)表透疹，清熱解毒，升舉陽氣的功效；民間用來治療風熱頭痛，麻疹不透，陽毒發(fā)班；脫肛，子宮脫落。升麻族植物的主要化學成分是9，19-環(huán)菠蘿蜜烷型三萜和肉桂酸類化合物。近年來對升麻族植物及其化學成分的研究發(fā)現(xiàn)，除了具有改善更年期潮熱，多汗等癥狀，治療更年期綜合癥，其中的三萜類成分更加具有抑制體外腫瘤細胞生長，抗氧化和抗HIV病毒的作用。目前尚未見有類似本發(fā)明所述化合物及其衍生物化學結(jié)構(gòu)的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本實驗室利用現(xiàn)代分離技術(shù)和結(jié)構(gòu)測定手段對類葉升麻進行化學成分研究過程中，從中分離得到一種結(jié)構(gòu)新穎的單體化合物，通過活性篩選，發(fā)現(xiàn)這些單體化合物具有很強的藥理活性。
本發(fā)明的目的之一是提供一種結(jié)構(gòu)如下的9，19-環(huán)菠蘿蜜烷型三萜皂苷化合物及其藥學上可接受的鹽 式(1)本發(fā)明還提供制備該化合物及其藥學上可接受的鹽的方法。
本發(fā)明還提供該化合物及其藥學上可接受的鹽在制備治療腫瘤藥物中的應用。
本發(fā)明的化合物在體外細胞毒實驗中可明顯抑制肝癌腫瘤細胞系HepG2和乳腺癌腫瘤細胞系MCF-7的增殖，具有細胞毒作用，是一種腫瘤治療藥物(IC50＝9.9，9.8μM)。
本發(fā)明所涉及的式(1)化合物，迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)專利或文獻報道。
本發(fā)明的化合物可以經(jīng)過分離提取得到，其制備方法可以采用如下方法1)類葉升麻根莖為原料，乙醇回流提取，回收溶劑，得浸膏；2)將浸膏用水溶解，依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，得乙酸乙酯萃取物；3)乙酸乙酯萃取物用硅膠低壓柱層析，以石油醚-丙酮-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，共收集合并成5份；4)其中第1份再次用硅膠低壓柱層析，以氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，共收集9份；5)其中第7份用反相C-18中壓柱層析，以甲醇-水系統(tǒng)梯度洗脫，共收集合并為3份；6)其中第3份經(jīng)高效制備液相在12分鐘處得到一白色晶體，即式(1)化合物。
具體可以是以類葉升麻[Actaea asiatica Hara]根莖(4.0Kg)為原料，經(jīng)用70％乙醇回流提取三次，每次三小時；合并三次提取液后，回收溶劑，得浸膏。將浸膏用水溶解，依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，得乙酸乙酯萃取物300g。乙酸乙酯萃取物用硅膠(200-300目)低壓柱層析，以石油醚-丙酮-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫(1∶0∶0-9∶1∶0-8∶2∶0.2-7∶2.5∶0.5-6∶3∶1-4∶4∶2)，每份5000ml，共收集合并成5份，其中第1份(102g)，再次用硅膠(200-300目)低壓柱層析，以氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫(10∶0-9∶1-8∶2-7∶3-6∶4-5∶5)，每份5000ml，共收集9份。其中第7份(7.5g)用反相C-18中壓柱層析，以甲醇-水系統(tǒng)梯度洗脫(40∶60，50∶50，60∶40，)，每份1000ml，共收集合并為3份，其中第3份經(jīng)高效制備液相(MeOH-H2O，80∶20，flow rate 2.5ml/min，column temp.35℃)在12分鐘處得到一白色晶體，高效分析液相檢查為單一峰，得到R1為β-D-xylopyranosyl，R2為COCH3，R3為H的式(1)化合物(即化合物I，5mg)。
化合物I，白色晶體，mp.142-145℃，[a]20D-67°(c 1.52，MeOH).高分辨質(zhì)譜HRESIMS(見圖1)給出m/z 667.3815[M+Na]+(calcd 667.3822)，確定其分子式為C37H56O9，不飽和度為9。
IR譜(見圖2)在3600-3100及979，1041cm-1出現(xiàn)強吸收峰，示苷類化合物；在1732，1242cm-1顯示強吸收帶，表明分子結(jié)構(gòu)中含乙?；?。紫外吸收光譜中除了三萜類化合物的常見邊緣吸收外，在265nm處有強吸收峰。
1H NMR譜(見圖3)高場區(qū)顯示一對AB系統(tǒng)質(zhì)子的信號[δ0.0.19(1H，d，J＝4.0Hz，19-H)，0.61(1H，d，J＝4.0Hz，19-H)]，四個叔甲基質(zhì)子的單峰信號[δ0.90，1.01，1.22，1.32]，三個重疊的雙峰甲基的質(zhì)子信號[δ1.14，1.15，1.16]，一個乙?；|(zhì)子信號[δ2.15]，一個烯氫信號[δ6.21，d，J＝4.0Hz]和一個糖的端基質(zhì)子信號[δ4.82，d，J＝7.6Hz]。在13C NMR譜(見圖4)中有五個連氧碳信號出現(xiàn)在δ109.1，80.1，77.2，72.8和68.7，另外還有兩個連氧碳出現(xiàn)在δ78.4和77.1，兩個不飽和碳出現(xiàn)在δ117.7和151.2。以上信息表明該化合物為-9，19-環(huán)菠蘿蜜烷型三萜木糖苷，且含有一個乙酰基(表1)。
根據(jù)HMQC(見圖5)和HMBC(見圖6)譜圖信息，將化合物波譜信息與已知化合物比較，發(fā)現(xiàn)在化合物的氫譜中，除了在δ1.16的常見的21-CH3雙峰甲基外，在δ1.14，1.15還有兩個雙峰甲基。我們推測化合物結(jié)構(gòu)中有異丙基(-CH(CH3)2)片斷存在于側(cè)鏈末端。而氫譜中化學位移值為δ3.32的多重峰則為異丙基中兩個甲基旁邊的質(zhì)子。在碳譜中在δ172.3和202.0有兩個羰基碳，前者歸屬為乙?；系聂驶笳邉t推斷為24-C，因為在HMBC中，δ202.0和兩個雙峰甲基[δ1.14，1.15，分別3H，d，J＝6.7Hz，H-26，27]有顯著相關(guān)。在化合物I中，22-H信號消失，取而代之的是一個在低場區(qū)的烯氫信號[δ6.21，d，J＝4.0Hz]，并且在HMBC中，這個烯氫和20-C[δ27.1]，21-C[δ26.0]以及24-C[δ202.0]有顯著相關(guān)，因此推斷此質(zhì)子位于22-C，且在22-C和23-C之間有雙鍵存在。
在HMBC圖譜中，還可以看到如下顯著相關(guān)Ha-11(δ2.64)/δ78.4(C-12)；Ha-15(δ2.06)/δ50.5(C-13)，δ49.7(C-14)，δ77.1(C-16)；H-16(δ4.27)/δ49.7(C-14)；H-17(δ2.12)/δ117.7(C-22)，δ151.2(C-23)，δ78.4(C-12)；H-20(δ2.49)/δ117.7(C-22)，δ151.2(C-23)。綜合一維，二維波譜信息，所有的碳氫信號都得以歸屬(表1)。
糖的端基氫信號出現(xiàn)在δ4.82(1H，d，J＝7.6Hz)說明苷鍵為β構(gòu)型。糖在母核上的連接位點由HMBC譜圖中端基氫與δ89.6的顯著相關(guān)確定在C-3位?；衔锏慕^對立體構(gòu)型在NOESY的基礎(chǔ)上，并結(jié)合已知化合物的信息得以確定。
綜合以上光譜分析，確定化合物I的結(jié)構(gòu)為16β23-expoxy-12β-acetoxy-22，23-didehydro-24-one-25-hydro-9，19-cycloanostane-3-O-β-D-xylopyranoside。
化合物I結(jié)構(gòu)測定的實驗數(shù)據(jù)IR(KBr)vmax(cm-1)3395(OH)，2943(CH)，2869，1732，1678，1632，1458，1385，1242，1041，980。HRESIMS m/z 667.3815(calcd 667.3822for [M+Na]+).1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)見表1。
表1 化合物I的1H，13C-NMR數(shù)據(jù)(溶劑為氘代吡啶)


本發(fā)明還包括本發(fā)明化合物的藥物可接受的鹽，特別是形成藥學上可接受的無毒鹽?？砂闯Ｒ?guī)轉(zhuǎn)化方法制備這些鹽。
本發(fā)明還包括以本發(fā)明化合物作為活性成分的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物，含有生理有效量的式I的9，19-環(huán)菠蘿蜜烷型三萜類化合物及其藥物可接受的鹽，根據(jù)需要還可包括藥物可接受的載體，所說的9，19-環(huán)菠蘿蜜烷型三萜類化合物及其藥物可接受的鹽在組合物的重量比為0.1-99.9％，藥物可接受的載體在組合物中的重量比為0.1-99.9％。本發(fā)明的藥物組合物以適合藥用的制劑形式存在，這些制劑形式可以是片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、緩釋片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、緩釋膠囊劑、口服液、合劑、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、溶液劑、注射劑、粉針劑、凍干粉針劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、滴劑、貼劑、滴丸劑。
本發(fā)明進一步涉及式I所述的9，19-環(huán)菠蘿蜜烷型三萜在制備治療和/或預防腫瘤藥物中的應用。本發(fā)明經(jīng)過實驗證明本發(fā)明化合物及其藥物可接受的鹽具有治療和/或預防腫瘤的作用，本發(fā)明為此進行了細胞毒性試驗，試驗采用人肝癌細胞株(HepG2)和人乳腺癌細胞(MCF-7)，試驗如下1.材料人肝癌細胞株(HepG2)、人乳腺癌細胞株(MCF-7)購自美國ATCC。培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清購自Gibico公司。MTT(3-(4，5-Dimethyiazol-2，5-diphenyl tetrazoliumbromide)，購自Sigma公司。
2.腫瘤細胞培養(yǎng)HepG2和MCF-7細胞分別培養(yǎng)在含10％FBS的RPMI1640(含100u/mlPemcillin以及100ug/ml的Streptomycin)培養(yǎng)基中，收集生長良好并取處于對數(shù)生長期的細胞用培養(yǎng)基配成密度為1×105個細胞/ml的細胞懸液，均勻地接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100ul(即每孔細胞個數(shù)為104個)，在5％CO2，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時待細胞完全貼壁后，給藥組用不同濃度的式I化合物處理，化合物終濃度分別為50ug/ml，40ug/ml，30ug/ml，20ug/ml，10ug/ml，5ug/ml，1ug/ml。同時設(shè)對照組和空白組，每組6個復孔，在5％CO2，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48hr后，加入10μl的10mg/ml-1MTT使終濃度為0.05％，孵育4hr后，離心棄去上清液培養(yǎng)基，加入100μlDMSO，在酶標儀上振蕩60s后，于595nm測定吸光度值。
3.式I化合物對腫瘤細胞的抑制率計算根據(jù)測得的吸光度值進行細胞的存活率計算，各測試孔的OD值減去空白組OD值(完全培養(yǎng)基加MTT，無細胞)，各重復孔的OD值取均數(shù)。細胞的存活率以T/C％表示，T為加藥組細胞的OD值，C為對照組細胞的OD值?；衔飳δ[瘤細胞的抑制率以(1-T/C)％表示。
4.實驗結(jié)果式I化合物體外對三種腫瘤細胞株的IC50值

實驗結(jié)果表明式I化合物對血液瘤和實體瘤具有顯著的抑制作用。


圖1式I化合物的紅外光譜圖2式I化合物的高分辨質(zhì)譜圖3式I化合物的氫譜圖4式I化合物的碳譜圖5式I化合物的HMQC譜圖6式I化合物的HMBC譜
具體實施例方式下面所列實施例有助于本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實施例1化合物1的制備取類葉升麻[Actaea asiatica Hara]根莖4.0Kg，用20L70％乙醇回流提取三次，每次三小時；合并三次提取液后，回收溶劑，得浸膏。將浸膏用1L水溶解，依次用1L石油醚，4L乙酸乙酯，4L正丁醇萃取，得乙酸乙酯萃取物300g。乙酸乙酯萃取物用硅膠(200-300目)低壓柱層析，以石油醚-丙酮-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫(1∶0∶0-9∶1∶0-8∶2∶0.2-7∶2.5∶0.5-6∶3∶1-4∶4∶2)，每份5000ml，共收集合并成5份，其中第1份(102g)，再次用硅膠(200-300目)低壓柱層析，以氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫(10∶0-9∶1-8∶2-7∶3-6∶4-5∶5)，每份5000ml，共收集9份。其中第7份(7.5g)用反相C-18中壓柱層析，以甲醇-水系統(tǒng)梯度洗脫(40∶60，50∶50，60∶40，)，每份1000ml，共收集合并為3份，其中第3份經(jīng)高效制備液相(MeOH-H2O，80∶20，flow rate 2.5ml/min，column temp.35℃)在12分鐘處得到一白色晶體，高效分析液相檢查為單一峰，得到R1為β-D-xylopyranosyl，R2為COCH3，R3為H的式(1)化合物(即化合物I，5mg)。
實施例2片劑的制備式I化合物20g乳糖 80g硬脂酸鎂 1.0％3％聚維酮乙醇溶液適量共制成1000粒取處方量化合物1與處方量乳糖混合均勻，加3％聚維酮乙醇溶液制軟材，過18目篩制顆粒，50℃干燥30-45分鐘，整粒，加入硬脂酸鎂，混勻，壓片。每片含化合物20mg。
實施例3膠囊劑的制備式I化合物20g乳糖 80g硬脂酸鎂 1.0％3％聚維酮乙醇溶液適量共制成1000粒取處方量式I化合物與處方量乳糖混合均勻，加3％聚維酮乙醇溶液制軟材，過18目篩制顆粒，50℃干燥30-45分鐘，整粒，加入硬脂酸鎂，混勻，充于1號膠囊。每粒含化合物20mg。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)構(gòu)如下的9，19-環(huán)菠蘿蜜烷型三萜皂苷化合物及其藥學上可接受的鹽。
2.權(quán)力要求1的化合物及其藥學上可接受的鹽在制備抗腫瘤藥物中的應用。
3.含有權(quán)力要求1的化合物及其藥學上可接受的鹽的藥物組合物。
4.權(quán)力要求3的藥物組合物，選自片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、滴劑、滴丸劑、貼劑。
5.權(quán)力要求1的化合物及其藥學上可接受的鹽的制備方法，包括以下步驟1)類葉升麻根莖為原料，乙醇回流提取，回收溶劑，得浸膏；2)將浸膏用水溶解，依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，得乙酸乙酯萃取物；3)乙酸乙酯萃取物用硅膠低壓柱層析，以石油醚-丙酮-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，共收集合并成5份；4)其中第1份再次用硅膠低壓柱層析，以氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，共收集9份；5)其中第7份用反相C-18中壓柱層析，以甲醇-水系統(tǒng)梯度洗脫，共收集合并為3份；6)其中第3份經(jīng)高效制備液相在12分鐘處得到一白色晶體，即式(1)化合物。
6.權(quán)力要求5的制備方法，其中步驟1)中的乙醇為70％乙醇，回流提取三次，每次三小時；步驟3)中以石油醚-丙酮-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，洗脫液的比例為1∶0∶0-9∶1∶0-8∶2∶0.2-7∶2.5∶0.5-6∶3∶1-4∶4∶2，步驟4)中以氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，洗脫液的比例為10∶0-9∶1-8∶2-7∶3-6∶4-5∶5；步驟5)中以甲醇-水系統(tǒng)梯度洗脫，洗脫液的比例為40∶60，50∶50，60∶40；步驟6)中高效制備液相，條件為MeOH-H2O，80∶20，流速2.5ml/min，柱溫35℃。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種環(huán)菠蘿蜜烷三萜皂苷化合物及其抗腫瘤作用，它具有式I化學結(jié)構(gòu)通式和體外抑制腫瘤細胞生長活性，本發(fā)明還涉及該化合物及其衍生物在制備藥物方面的用途，特別是在制備抗腫瘤藥物領(lǐng)域。
文檔編號C07J75/00GK1958597SQ20061008732
公開日2007年5月9日 申請日期2006年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月7日
發(fā)明者肖培根, 楊夢蘇, 高璟春, 張金超, 黃峰 申請人:肖培根, 楊夢蘇