專利名稱：：山茶種子中的三萜皂苷及其制備方法和醫(yī)藥用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術領域：
，涉及山茶種子中的三萜皂苷及其制備方法和醫(yī)藥用途。
背景技術：
：山茶Camelliasinensis是山茶科山茶屬植物，在我國大面積栽培，是一種優(yōu)良的經濟作物。其嫩芽一一茶葉的化學成分和生物活性有系統(tǒng)的研究報道。據已有的研究資料表明茶的化學成分有600種之多，其中的有機化合物達500種以上。它們合成和轉化的生化反應途徑有著互相聯(lián)系、互相制約的關系。其生物活性涉及抗炎、抗過敏、抗氧化、清除自由基、降血糖、降血脂、胃腸促進、保肝、癌前損傷預防等多方面活性。近年來，隨著茶園種植業(yè)采取無性扦插繁殖，大量的山茶種子作為副產物亟待進一步合理開發(fā)利用?！侗静菥V目》記載茶籽苦寒，有毒，治喘急痰嗽，去痰垢。在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)，茶種子中含有大量的皂苷類成分。茶種總皂苷是一種優(yōu)良的表面活性劑，是新型化妝品和洗滌劑的原料。醫(yī)療方面有較好的保護胃粘膜、降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗真菌、抗炎、抗過敏和抗血管擴張作用。山茶種子總皂苷的提取及利用其有效成分生產加工成制劑未有報道。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供如通式(1)所示的山茶種子中的三萜皂苷類成分、及其制備方法和醫(yī)藥用途。本發(fā)明提供了山茶種子中的三萜皂苷，其為如下通式(1)中所表示的齊墩果垸衍生物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>通式(1)中，Rl為氫或羥基或酰氧基；R2為氫或酰氧基(?；N類包括乙?；?、當歸?；?、惕鉻?；?、肉桂?；?；R3為氫或酰氧基(?；N類包括乙酰基、當歸?；⑻桡t?；⑷夤瘐；?；R4為氫或酰氧基(?；N類包括乙酰基、當歸酰基、惕鉻?；?、肉桂?；?；R5為甲基或羥甲基或醛基或羧基或羧基甲酯；R6為氫或糖基(包括葡萄糖醛酸基、阿拉伯糖基、半乳糖基、葡萄糖基、木糖基及由它們組成的寡糖鏈)。其中新化合物是<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>本發(fā)明還提供了山茶種子中三萜皂苷的制備方法，其制備方法如下(1)取干燥山茶種子搾油后所得茶子餅，加入提取溶劑浸泡，藥材與提取溶劑的比例為l:5至1:12，于50~IO(TC條件下加熱0.5~3小時，提取14次，合并各次提取液濃縮至藥材量的2~10倍體積；(2)提取液經大孔樹脂(HPD1QG或D1G1或AB-8等通用樹脂)吸附，用03(W的稀醇洗去雜質，再用40%~100%醇液洗脫得山茶種子粗總皂苷(含量50%~70%);(3)所得山茶種子粗總皂苷加少量水溶解，經開口ODS柱色譜，用0~30財希醇洗去茶黃酮雜質，再用40%~90%醇液洗脫得山茶種子總皂苷(含量70%~95%);(4)所得山茶種子總皂苷經HPLC進一步分離純化反相鍵合硅膠為固定相((:-18，C-30,C-8等)，以甲醇-水(含0.05%冰醋酸)體積比30~80%或乙腈-水(含0.05冰醋酸)體積比20%~70%或甲醇-乙腈-水(含0.05%冰醋酸)體積比2:50:48~16:20:64為流動相，示差或紫外(190~220nm)檢測器檢測，得到通式(1)中所示各種類型三萜皂苷類成分。本發(fā)明提供的山茶種子中三萜皂苷的制備方法，所述步驟(l)中的提取溶劑為水、甲醇、乙醇等，甲醇或乙醇的濃度為5%~95%;提取方法為煎煮法或加熱回流提取法。本發(fā)明提供的山茶種子中三萜皂苷的制備方法，所述步驟(3)中醇液為不同濃度的甲醇或乙醇。本發(fā)明提供了山茶種子中三萜皂苷的醫(yī)療用途,如通式(1)中所示的山茶種子中的三萜皂苷類化合物具有胃粘膜保護、抗腫瘤、降血糖、降血脂等作用；可用于制備保護胃粘膜、抗腫瘤、降血糖、降血脂的藥物或保健食品。本發(fā)明的優(yōu)點如下(1)本發(fā)明的制備方法所得山茶種子總皂苷收率高、純度高；(2)如上所示的32個化合物均為新化合物，是山茶種子的特有成分，可作為質量控制的指標；(3)本發(fā)明所得單體茶皂苷收率高、純度高，結構明確，可進行目標性結構修飾，以進一步開發(fā)利用；(4)本發(fā)明所用原料為山茶種子搾油后的茶子餅，為工業(yè)廢料，成本低、易得、有利于環(huán)保；(5)制備方法簡便、易行，污染少，適宜于工業(yè)生產；(6)山茶種子總皂苷和單體茶皂苷生物活性多樣、效果顯著。圖1為茶皂苷T1的^NMR圖譜。圖2為i皂苷Tl的^CNMR的圖譜。圖3為^皂眷T10的iHNMR圖譜。圖4為i皂苷T10的"CNMR的圖譜。圖5為桌皂苷T12的iHNMR的圖譜。圖6為^皂苷T12的"CNMR的圖譜。圖7為^皂吾T20的'HNMR的圖譜。圖8為茶皂苷T20的"CNMR的圖譜。圖9為恭皂苷T33的lHNMk的圖譜。圖10為茶皂苷T33的"CNMR的圖譜。圖11為泰皂苷T34的1HNMR的圖譜。圖12if茶皂吾T34的"CNMR的圖譜。圖1.3為糴皂苷T36的1HNMR的圖譜。圖14為套皂畚T36的。CNMR的圖譜。具體實施例方式以下實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，本發(fā)明不受此限制。實施例1山茶總皂苷的制備取干燥山茶種子榨油后所得茶子餅10kg,去除雜質、灰塵。在中藥提取罐中加入藥材和IO倍量的水，加熱至8(TC,提取兩次，每次2小時，合并各次提取液濃縮至藥材量的4倍體積。提取液經大孔樹脂吸附，用20%乙醇洗去雜質，再用9(W乙醇洗脫得山茶種子粗總皂苷680克(含量60%)。所得山茶種子粗總皂苷力口5倍量水溶解，經開口ODS柱色譜(樣品量填料l:10),用20%乙醇洗去茶黃酮雜質，再用85%乙醇洗脫得山茶種子總阜苦380克(含量85%)所得山茶種子總皂i經反相HPLC(島津L6A)進一步分離純化以ODS和C-30鍵合硅膠為固定相，分別以甲醇-水(含O.05%冰醋酸)體積比70:30為流動相，乙腈-水(含0.05冰醋酸)體積比40:60為流動相，甲醇-乙腈-水、含0.05%冰醋酸)體積比8:32:60為流動相反復分離，示差檢測器檢測'，得到通式(1)中所示各種類型三萜皂苷類成分。實施冽2山茶總皂苷的制備(1)取干燥山茶種子搾油后所得茶子餅6kg,去除雜質、灰塵。(2)在中藥提取罐中加入藥材和8倍量的95%乙醇，加熱至8(TC,提取兩次，每次1.5小時，合并各次提取液濃縮至藥材量的2倍體積。(3)提取液經大孔樹脂吸附，用30%乙醇洗去雜質，再用90%乙醇洗脫得山茶種子粗總皂苷770克(含量65%)。(4)所得山茶種子粗總皂苷加4倍量水溶解，經開口ODS柱色譜(樣品量填枓l:12),用20%乙醇洗去茶黃酮雜質，再用90%乙醇洗脫得山茶種子總皂苷430克(含量87"。(5)所得山茶種子總皂苷經反相HPLC(島津L6A)進一步分離純化以ODS和C-30鍵合硅膠為固定相，分別以甲醇-水(含0.1%冰醋酸)體積比65:35為流動相，乙腈-水(含O.l冰醋酸)體積比33:67為流動相，甲醇-乙腈-水(含0.05%冰醋酸)體積比4:34:62為流動相反復分離，示差檢測器檢測，得到通式(1)中所示各種類型三萜皂苷類成分。實施冽3'考察山茶種子總皂苷對S180荷瘤小鼠腫瘤生長的影響實驗動物8周齡雄性ICR小鼠，平均體重20克。由浙江大學實驗動物中心提供。藥物與瘤株山茶種子總皂苷按照權利要求書2中描述的方法制備；環(huán)磷酰胺(CTX)，200mg/支，上海華聯(lián)制藥有限公司生產，S180腹水瘤小鼠為浙江大學動物實驗中心提供。S180腹水瘤細胞懸液的制備無菌條件下搡作，取接種10d的S180肉瘤腹水型荷瘤小鼠，消毒動物腹部皮膚，用5mL—次性無菌注射器穿入腹腔，吸取腫瘤細胞生長良好的腹水,所抽腹水放入無菌三角燒瓶內，放置于冰盒上。另取少量腹水進行細胞計數(shù)用生理鹽水稀釋IOO倍，取稀釋液0.9mL加臺盼蘭(O.2%臺盼蘭生理鹽水溶液)0.1mL，混勻，用細胞計數(shù)法分析腫瘤細胞總數(shù)及死細胞數(shù)(紫或藍色，活細胞數(shù)應>95%)。腹水用生理鹽水稀釋，調整瘤細胞濃度為1xi07/mL(整個操作在冰盒上進行，以此來保持腫瘤細胞的活性)。昆明種小鼠移植S180肉瘤模型的建立取體重20g左右的昆明種小鼠，每鼠Q.2mL(腫瘤細胞數(shù)約為2x106個)接種于右前肢腋窩皮下，24h后稱重，隨機分成3組，分組情況為荷瘤對照組，環(huán)磷酰胺(CTX)組，山茶種子皂苷組組。計算瘤重及其他相關指標。荷瘤對照組移植腫瘤后，每日灌服O.4mL生理鹽水。環(huán)磷酰胺(CTX)組每天]次，100mg/kg體重，腹腔注射，連續(xù)3d。山茶種子總皂苷劑量組每天按100mg/kg體重灌服1次，連續(xù)10d。指標的檢測給藥10d后停止給藥,停藥次曰處死小鼠，稱取小鼠體重，解剖瘤體，稱重。實驗結果:見表1表1山茶種子總皂苷對S180荷瘤小鼠腫瘤生長的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施(列4釆用MTT法和SRB法，對單體茶皂苷體外抗腫瘤活性進行測試實驗方法如下細胞培養(yǎng)取對數(shù)生長期的人體腫瘤細胞，以內含10%(v/v)胎牛血清(fetalbovineserum)的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋為5x104個/L的細胞懸浮液，接種于96孔板中，100mL/孔，置于37°C、飽和濕度、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。添加試藥用少量DMS0溶解樣品后，用含10%(v/v)胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋為10,20，30,40,50pm/L濃度梯度的樣品溶液，將上述含藥培養(yǎng)液加入96孔板中，放置于與細胞培養(yǎng)相同條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。結果測定采用MTT法測定MCF-7和HepG2瘤株實驗結果。釆用SRB法測定K562和HL-60瘤株實驗結果。實驗結果見表2表2單體茶皂苷體外抗腫瘤活性測試結果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例5.考察山茶種總皂苷對糖負荷大鼠血糖的影響實驗動物雄性Wistar大鼠，體重130~150g,購自日本KiwaLaboratoryAnimalCo.Ltd.(Wakayama)。動物恒溫(23±2°C)飼養(yǎng)，詞料購自曰本MF.OrientalYeastCo.Ltd.(Tokyo)。實驗前動物禁食2024小時，自由取水。實驗方法取130~150g的雄性Wistar大鼠，禁食2024小時后，灌胃給與山茶種總皂苷，0.5小時后，灌胃給蔗糖(1.0g/kg),0.5小時后,眼底取血，離心分離血漿后采用葡萄糖氧化酶法測定血糖水平。實驗結果表3中給出了山茶種總皂苷對糖負荷大鼠血糖水平的影響,山茶種總皂苷在100400mg/kg劑量能顯著降低糖負荷大鼠血糖水平。表3山茶種總皂苦對糖負荷大鼠血糖的影響^入，劑量血糖水平(mg/dL)實驗組--n-(mg/kg,;.0.)0.5hr1.0hr2.0hr4.0hr空白組—978.1±3.3**83.4±3.2**85.3±3.6**81.3±4.6**對照組—9195.6±3.4152.8±5.5128.7±3.6120.0±2.725189.7±1.9149.4±6.5127.4±4.3125.9±2.2山茶種子總皂苷組50186.7±5.1153.3±5.7129.5±2.8125.3±4.0100157.8士4.2"139.7±3.6142.5±3.3137.0±4.3*200了140.5±2.1**129.8士3.4"130.2±2.9131.8±4.6■7126.7±4.7**129.0±5.2**126.1±6.0131.4±6.8Valuesrepresentthemeans士S.E.M.Forstatisticalanalysis:one-wayanalysisofvariancefollowedbyDunnett,stestSignificantlydifferentfromthecontrolgroup,<0.05,<0.01.實施例6考察山茶種總皂苷對油負荷小鼠血漿中甘油三酯水平的影響.實驗動物雄性DDY小鼠，體重2530g,購自日本KiwaLaboratoryAnimalCo.Ltd.(Wakayama)。動物恒溫(23±2°C)飼養(yǎng)，飼料購自曰iMF.OrientalYeastCo.Ltd.(Tokyo)。實驗前動物禁食20~24小時，自由取水。實驗方法取2530g的雄性DDY小鼠，禁食2024小時后，灌胃給與山茶種總皂苷，0.5小時后，灌胃給橄欖油(5mL/kg)，2小時后，眼底取血，離心分離血漿后釆用WAKO試劑盒測定血漿中甘油三酯水平。實驗結果表4中給出了山茶種總皂苷對油負荷小鼠血漿中甘油三酯水平的影響，山茶種總皂苷在400mg/kg劑量能顯著降低油負荷小鼠血漿中甘油三酯水平。表4山茶種總皂苷對;由負荷小鼠血漿中甘油三酯水平的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>Valuerrepresentthemeans土S.E.M.Forstatisticalanalysis:one-wayanalysisofvariancefollowedbyDunnett，stestSignificantlydifferentfromthecontrolgroup,*/<0.05，<0.01.實施例7考察山茶種總皂苷對乙醇誘導的胃粘膜損傷的影響實驗動物雄性SD大鼠，體重230250g,購自日本KiwaLaboratoryAnimalCo.Ltd.(Wakay纖)。動物恒溫(23±2°C)飼養(yǎng)，飼料購自曰iMF.OrientalYeastCo.Ltd.(Tokyo)。實驗前動物禁食24~26小時，自由取水。實驗方法取230~250g的雄性SD大鼠，禁食2426小時后，灌胃給與茶種總皂苷(5°/。的阿拉伯膠混懸)，1小時后，灌胃給99.5%的乙醇(1.5mL)致胃粘膜損傷，1小時后，乙醚麻醉處死。取出大鼠胃部，抽出內容物后，注射10mL1.5y。的福爾馬林溶液固定胃壁，反復用清水沖洗后展平，計算機掃描計算胃粘膜損傷率。實驗結果結果如表5所示，山茶種總皂苷在2.520mg/kg劑量能顯著減少乙醉引起的胃粘膜損傷。表5山茶種總皂苷對乙醇誘導的胃粘膜損傷的影響劑量胃粘膜損傷程度<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>Valuesrepresentthemeans±S.E.M.Forstatisticalanalysis:one-wayanalysisofvariancefollowedbyDunnett，stestSignificantlydifferentfromthecontrolgroup,*p<0.05，**p<0.01.實施例8考察山茶種總皂苷對吲哚美辛誘導的胃粘膜損傷的影響實驗動物雄性SD大鼠，體重230250g，購自日本KiwaLaboratoryAnimalCo.Ltd.(Wakayama)。動物恒溫(23±2°C)飼養(yǎng)，飼料購自曰本MF.OrientalYeastCo.Ltd.(Tokyo)。實驗前動物禁食24~26小時，自由取水。實驗方法取230250g的雄性SD大鼠，禁食2426小時后，灌胃給與山茶種總皂苷(5%的阿拉伯膠混懸)，1小時后，灌胃給吲哚美辛(20mg/kgP引哚美辛溶于5y。碳酸氫鈉溶液，蒸餾水稀釋后，加O.2M鹽酸中和，1.5ml/rat)致胃粘膜損傷，4小時后，乙醚麻醉處死。取出大鼠胃部，抽出內容物后，注射10mL1.5"/。的福爾馬林溶液固定胃壁，反復用清水沖洗后展平，掃描計算胃粘膜損傷率。實驗結果實驗結果如表6中所示，山茶種總皂苷在50~200mg/kg劑量能顯著減少吲哚美辛引起的胃粘膜損傷。表6山茶種總皂苷對吲哚美辛誘導的胃粘膜損傷的影響劑量胃粘膜損傷水平<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實施洌9考察分離得到的單體茶皂苷對乙醇誘導的胃粘膜損傷的保護作用。實驗動物和試驗方法同實施例7.實驗結果如表7中所示，部分單體茶皂苷在劑量為5mg/kg水平，能顯著抑制乙醇誘導的胃粘膜損傷，其效果好于陽性對照藥奧美拉唑和曲丙酸酯鹽酸鹽。表7單體茶皂苷對乙醇誘導的胃粘膜損傷的保護作用<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>茶皂苷l5茶皂苷254華皂苷3茶皂苷4茶皂苷54築皂苷6茶皂苷7華皂苷8茶皂苷9茶皂苷10茶皂苷114茶皂苷12茶皂苷135茶皂苷145茶皂苷155、5對照組—6106奧美拉唑1562066對照組—6756曲丙酸酯鹽酸±卜15063006102.4±12.237.073.6±21.5*54.784.8±9.9*47.946.4±16.7**71.436.4±11.8**77.6112.4士21.230.988.8±24.9*45.498.1±18.739.757.8±21.7**64.494.2±24.142.163.3±20.1**61.0104.8±10.235.576.4±8.7*53.069.1±21.6**57.5123.4±24.324.1159.2±21.0—卯.6±21.2**43.128.6±13.4**82.016.9±6.1**89.4148.4±9.8—87.2±7.4**41.251.0±4.0"65.530.5±8.3**79.4Valuesrepresentthemeans±S.E.M.Forstatisticalanalysis:one-wayanalysisofvariancefollowedbyDunnett，stestSignificantlydifferentfromthecontrolgroup,*p<0.05，**p<0.01.實施洌10單體茶皂苷T1的結構確證白色針晶(甲醇),mp219220°C，Lieb函ann陽Burchard反應陽性，Molish反應陽性。堿水解，檢出有當歸酸存在；酸水解，檢測有葡萄糖醛酸，半乳糖，阿拉伯糖和木糖存在。IR(KBrpellet)vmax3453(OH)，1718(C=0),1649(C=0),1078(C-O)cm-l。[a]2D0=+6.5(c2.5,MeOH)。Pos.FAB隱MSm/z:1213[M+Na]+,Neg.FAB-MSm/z:1189[M-町，1057[M-H-132r，925[M-H陽2xl32]-,895[M畫H-132-162]-。HRFABMSm/z:1213.5627(calcd.1213.5618forC57H9()026Na)。^畫NMR,13C-NMR數(shù)據見表1，表2。H-NMR,"C-NMR見說明書附圖l，圖2。實施閱11單體茶皂苷T10的結構確證白色針晶(甲醇),mp220~221°C，Liebermann-Burchard反應陽性，Molish反應陽性。堿水解，檢出有當歸酸和乙酸存在；酸水解，檢測有葡萄糖醛酸，半乳糖，阿拉伯糖和木糖存在。IR(KBrpellet)v麗3453(OH),1731(C=(〕)，1647(CO)，1080(C-O)cm"[ot]2D0=-10.0(c2.4,MeOH)。Pos.FAB誦MSw/z:1281[M+Na]+,Neg.FAB-MSw/z:1257[M-町，1125[M-H-132r,963[M-H-132-162]-。HRFABMS:1281.5886(calcd.1281.5880forC61H94027Na)。'H-NMR，13C-NMR數(shù)據見表1,表2。H-NMR,13C-NMR,見說明書附圖3，圖4。實施測12單體茶皂苷T12的結構確證白色針晶(甲醇)，mp223224°C,Liebermann-Burchard反應陽性，Molish反應陽性。堿水解，檢出有當歸酸存在；酸水解，檢測有葡萄糖醛酸，半乳搪，阿拉伯糖和木糖存在。IR(KBrpellet)vmax3453(OH),1741(C=0),1085(C-O)cm"。[a]2D0=+7.9(c2.0，MeOH)。Pos.FAB畫MSw/z:1197[M+Na]+,Neg.FAB-MSm/z:、1173[M誦H]-,1041[M-H-132]-。HRFABMS:1197.5657(calcd.1197.5669forC57H90O25Na)。^-NMR,"C漏NMR數(shù)據見表1,表2。^-NMR，"C-NMR見也明書附圖5，圖6。表l茶皂苷Tl,T10，T12的13C-NMR數(shù)據<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>Ac=acetyl,Ang=angeloyl;Xyl:y5-Z)-xylose;Ara:ot國丄-arabinose;GlcA:》墨Z)-glucuronicacid;Glc:"-D-glucose;Gal:々-Z)-galactose;表2茶皂苷Tl，T10,T12的^-NMR數(shù)據No.TlT10T1234.15Cm)3.20(dd-like)4.14(t-like)125.37(br.s)'5.39(br.s)5.38(br.s)164.84(br.s)5.61(br.s)4.61(br.s)182.92(dd-like)3.00(dd-like)3.04(dd-like)216.46(d,J=10.1)5.87(d,J=10.4)2.80,2.85(eachm)224.80(d，J=10.1)6.13(d，J=10.4)6.21(dd,J=5.5,12.6)233.77(d,J=10.4)，4.42(m)1.28(s)3.76(dd-like),4.39(m)241.07(s)U2(s)1.08(s)25O.卯(s)0.77(s)0.90(s)260.89(s)0.75(s)O.卯(s)271.80(s)1.49(s)1.83(s)283.68,3.96(eachd，J=10.4)3.46,3.59(eachd,J=10,4)3.55，3.70(eachd,J=l1.0)291.10(s)1,07(s)1.03(s)301.32(s)1.26(s)1.29(s)A21-Ang21-Ang22-Ang35.卯(dq-like)5.99(dq-like)5.92(dq-like)42.06(d，J=7.3)、2.06(d,J=7.3)2.09(d,J=7.0)1.98(s)1.98(s)1.96(s)16-Ac2.51(s)22-Ac2.04(s)GlcA:l'5.06(d，J=7.7)4.91(d，J=7.4)5.05(d，J=6.7)Gal-i"5.88(d,J=8.0)5.76(d,J=8,0)5.88(d,J=7.4)1681.678.341.7Ara73.173.373.0r"101.7101.7101.764.827,964.82",82.382.182.313.616.713.63,"73.373.873.416.215.616.24霄"68.368.368.316.916.7、16.9V"66.066,066.027.426.927.6Xyl66.063.763.6107.1106.9107.129.829.333.52""75.975.775.920.419.725.23，"i78.378.278.321-Ang21-Ang22-Ang4'"，70.870.770.8168.7167.8168.067.567.567.5129.6128.4129.5136.0138.1136.615.916.015.921.120.921.0222222223i"12345<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實施(列13單體茶皂苷T20的結構確證白色粉末(甲醇)，mp196~198°C,Liebermann-Burchard反應陽性，Molish反應陽性。堿水解，檢出有惕鉻酸和乙酸存在；酸水解，檢測有葡萄糖醛酸，半乳糖，阿拉伯糖和木糖存在。IR(KBrpellet)vmax3453(OH),1743(C=())，1085(C-O)cm"。[oc]2D0=+10.9(c3.0,MeOH)。Pos.FAB-MSw/二1253[M+Na]+,Neg.FAB-MS附/二1229[M國町，1097[M-H-132]-，1067[M-H-162]-，965[M畫H國2x132]-,803[M國H-2xl32-162]國。HRFABMS:1253.557(calcd.1253.5567forC59H9Q027Na)。1H-NMR，"C-NMR數(shù)據見表3,表4,H-NMR，t-NMR見也明書附圖7，圖8。實施例14單體茶皂苷T33的結構確證白色粉末(甲醇)，mp217218°C,Liebermann-Burchard反應陽性,Molish反應陽性。堿水解，檢出有當歸酸和乙酸存在；酸水解，檢測有葡萄糖醛酸，半乳糖，阿拉伯糖和木糖存在。IR(KBrpellet)vmax3453(OH),1718(C=0),1650(C=0),1080(C-O)cm"。[a]2D0=+25.1(c2.0,MeOH)。Pos.FAB-MS附/z:1283[M+Na]+,Neg.FAB-MS附/z:1259[M-H]-,1127[M-H-132]-，1097[M-H-162]-,995[M-H-2xl32]-，965[M-H-132誦162]-。HRFABMS:1283.5682(calcd.1283,5673forC60H92O28Na)。！H-NMR,13C-NMR數(shù)據見表3，表4。^-NMR,"C-NMR見i^日為書附圖9,圖10。實施例15單體茶皂苷T34的結構確證白色粉末(甲醇),mp218~219°C,Liebermann-Burchard反應陽性，Molish反應陽性。堿水解，檢出有當歸酸存在；酸水解，檢測有葡萄糖醛酸，半乳糖，阿拉伯糖和木糖存在。IR(KBrpellet)v腿3453(OH)，1717(C=0)，1638(C=0),1080(C-O)cm-1。[a招=+10.0(c0.9,MeOH)。Pos.FAB國MSw/z:1225[M+Na]十，Neg.FAB-MSw/z:1201[M-町，1069[M-H-132],937[M畫H畫2xl32r,907[M-H誦132-162]-。HRFABMS:1225.5613(calcd.125.5618forC58H90O26Na)。'H-NMR，13C-NMR數(shù)據見表3,表4。^-NMR,"C-NMR見說明書附圖11,圖12。實施例16單體茶皂苷T36的結構確證白色粉末(甲醇)，mp225~226°C，Liebermann-Burchard反應陽性，Molish反應陽性。堿水解，檢出有當歸酸存在；酸水解，檢測有葡萄糖醛酸，半乳糖，阿拉伯糖和木糖存在。IR(KBrpellet)v醒3453(OH),1717(C=0),1638(C=0),1080(C-O)cm國1。[a]2D0=-1.3(c1.0,MeOH)。Pos,FAB-MS附/z:1195[M+Na]+,Neg.FAB-MS柳/z:1171[M-H]—,1039[M-H-132]-，907[M誦H-2x132]-,877[M-H-132-162]-。HRFABMS:1195.5520(calcd.1195.5512forC57H88025Na)。^-NMR,〗3C-NMR數(shù)據見表3,表4。'H-NMR，"C-NMR見說明書附圖13，圖14。表3茶皂苷T20,T33,T34,T36的"C-NMR數(shù)據No.T20T33T34T36No.T20T33T34T36Ac=acetyl,Ang=angeloyl;Xyl:"-Z)-xylose;Ara:a--arabinose;GlcA:^-D-glucuronicacid;1234689101112131415161718192021222324252627282930COOCH3Ang/Tig12438.638.638.122-Ac26.126.125.2185,785.684.7253.853.8、55.028-Ac52.252.348.5120.921,020.3232.732.732.3GlcA40.440.340.21,47.047.146.82,36.436.536.03,23.823.823.64'123.8123.1123.15,142.7143.7142.56,41.741.741.6Gal34.635,131.6r67.570.171.02"47.044.844.23"40.240.944.84"47.147.447.35"36.132.131.76"81.241.7、41.5Ara71.173.072,4r'178.1178.1210.3"I12.212.311.216.016.115.84"，16.816.616.6V，27.327.527.0Xyl66.063.769.31，"129.733.533.42"，，20.225.225.23，'，'52.252.24""21-Ang21-Ang16-Ang5""168.5168,0167.2129.5129.5128.7136.1136.5138,015.915.815.921.021.021.3171.020.9170.720.7104.2104.7104.7104.378.278.478.578.384.184.384.384.170,870.971.070.877.477.277.277.4171.9172.0172.0171.9103.3103.3103.2103,373.773.673.673.775.475.675.775.470.570.670.770.576.576.476.476.662.061.761.862.1101.7101.6101.6101,782.382.482,482.373.373.373.373.368.368.368.368.366.066.466.066.0107.1107.1107.1107.175.976.076.075.978.278.278.278,370.870.870.870.867.567.567,567.5l丄l15.816.827.46;.729.520.232854234:432^32-436444377Glc:yff-D-glucose;Gal:yS-Z)-galactose;表4茶皂苷T20，T33，T34,T36的1H-NMR數(shù)據<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>Ac=acetyl,Ang=angeloyl,Xyl:p畫Z)國xylose;Ara:ot隱丄-arabinose;GlcA:^隱D-glucuronicacid;Gal:^國Z)隱glucose;Glc:/國Z)-galactose;權利要求1、山茶種子中的三萜皂苷，其特征在于其為如下通式(1)中所表示的齊墩果烷衍生物通式(1)乙酰基惕鉻?；敋w?；夤瘐；ㄊ?1)中R1為氫或羥基或酰氧基；R2為氫或酰氧基；R3為氫或酰氧基；R4為氫或酰氧基；R5為甲基或羥甲基或醛基或羧基或羧基甲酯；R6為氫或糖基。2、根據權利要求l所述的山茶種子中的三薛皂苷，其特征在于所述酰氧基中的酰基為乙?；?、'當歸酰基、惕鉻酰基、肉桂酰基中的一種或多種。3、根據權利要求l所述的山茶種子中的三薛皂苷，其特征在于所述糖基為如下糖基中的一種或多種葡萄糖醛酸基、阿拉伯糖基、半乳糖基、葡萄糖基、木糖基及由它們組成的寡糖鏈基。4、一'-種如權利要求l所述的山茶種子中三薛皂苷的制備方法，其特征在于其制備方法如下(1)取干燥山茶種子榨油后所得茶子餅，加入提取溶劑浸泡，藥材與提取溶劑的比例為l:5至1:12，于50~IO(TC條件下加熱0.5~3小時，提取l-4次，合并各次提取液濃縮至藥材量的2~10倍體積；(2)提取液經大孔樹脂(HPD100或D101或AB-8等通用樹脂)吸附，用0~30%的稀醇洗去雜質，再用40%~100%醇液洗脫得山茶種子粗總皂苦.'(3)所得山茶種子粗總皂苷加少量水溶解，經開口ODS柱色譜，用030財希醇洗去茶黃酮雜質，再用40%~90%醇液洗脫得山茶種子總皂苷；(4)所得山茶種子總皂苷經HPLC進一步分離純化反相鍵合硅膠為固定相，以甲醇水或乙腈水為流動相，示差或紫外檢測器檢測，得到通式(1)中所示各種類型三萜皂苷類成分。5、損據權利要求4所述的山茶種子中三萜皂苷的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中的提取溶劑為水、甲醇、乙醇中的一種。6、根據權利要求4所述的山茶種子中三萜皂苷的制備方法，其特征在于所沐步驟(l)中的提取方法為煎煮法或加熱回流提取。7、根據權利要求4所述的山茶種子中三萜皂苷的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中醇液為甲醇或乙醇的溶液。8、楣據權利要求4所述的山茶種子中三萜皂苷的制備方法，其特征在于所述步驟(4)中反相鍵合硅膠為C_30~C4鍵合硅膠中的一種。9、根據權利要求4所述的山茶種子中三萜皂苷的制備方法，其特征在于所述步驟(4)中的流動相為30%~80%甲醇水或乙腈水，并且甲醇水或乙腈^中含0.01~0.5%冰醋酸。10、山茶種子中的三萜皂苷在制備保護胃粘膜、抗腫瘤、降血糖、降血脂的藥楊或保健食品中的應用。全文摘要本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術領域：
，提供了山茶種子中的三萜皂苷、及其制備方法和醫(yī)藥用途，如通式(1)中所示，其中R1為氫或羥基或酰氧基；R2為氫或酰氧基；R3為氫或酰氧基；R4為氫或酰氧基；R5為甲基或羥甲基或醛基或羧基或羧基甲酯；R6為氫或糖基；制備方法經脫脂、醇提取或水煎煮、大孔樹脂脫糖脫色得粗總皂苷，再經開口ODS柱色譜和反復HPLC法分別制得山茶種子總皂苷和單體茶皂苷；本發(fā)明的山茶種子中的三萜皂苷類化合物具有胃粘膜保護、抗腫瘤、降血糖、降血脂等作用；用于制備保護胃粘膜、抗腫瘤、降血糖、降血脂的藥物或保健食品。文檔編號A61P3/06GK101392015SQ200810012419公開日2009年3月25日申請日期2008年7月22日優(yōu)先權日2008年7月22日發(fā)明者鵬張,寧李,銑李,馬忠俊申請人:沈陽藥科大學