專利名稱：含達瑪烷型四環(huán)三萜類皂苷的中藥提取物及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬中藥提取物，涉及從中藥三七中提取的達瑪烷型四環(huán)三萜類皂苷提取物，該提取物與蒽環(huán)類抗腫瘤藥物聯(lián)合使用時，能夠減輕其心臟毒性，并且不會降低后者的抗腫瘤療效。
背景技術(shù)：
自1957年分離出第一個蒽環(huán)類抗癌藥柔紅霉素(Daunorubicin)以來，蒽環(huán)類抗癌藥已經(jīng)成為臨床上廣泛使用的一類化療藥物。阿霉素(Doxorubicin.DXR，Adriamycin，ADM)自70年代進入臨床試驗以后，因具有抗瘤譜廣、臨床療效好等顯著特點、尤其對乏氧腫瘤細胞有效，已成為蒽環(huán)類抗癌藥的代表藥物。ADM對多種腫瘤有效，包括血液系統(tǒng)腫瘤、惡性淋巴瘤、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌、睪丸癌、頭頸部腫瘤和骨軟組織腫瘤等。ADM價格低廉，療效-費用比較高，是當前臨床上常用的抗腫瘤藥物之一。但由于其主要毒副反應(yīng)心臟毒性的限制，尤其是劑量累積性心臟毒性，嚴重限制了其在臨床上的廣泛和長期使用。
為了解決蒽環(huán)類抗癌藥的心臟毒性問題，各國學者提出了不同的對策，包括尋找高效低毒的結(jié)構(gòu)類似物和使用心肌保護性藥物。
目前，已發(fā)現(xiàn)了多種阿霉素結(jié)構(gòu)類似物。在臨床上已得到廣泛使用的二個結(jié)構(gòu)類似物是吡柔比星[吡喃阿霉素，Pirarubicin，(2R)-4-O-Tetrahydropyranyladriamycin，THP]和表阿霉素(Epirubicin，EPI)。THP于1979年由日本學者Umezawa等發(fā)現(xiàn)，是ADM的一個四氫吡喃派生物，在ADM的4立體位加上了四氫吡喃基。EPI為ADM的異構(gòu)體。這2種藥物的心臟毒性要低于阿霉素。但是吡喃阿霉素的骨髓毒性比阿霉素高得多，表阿霉素仍然有心臟毒性，同時具有一定的骨髓毒性，且價格較高，因此并不能完全代替阿霉素。
常用的心肌保護藥物對阿霉素造成的心臟毒性沒有顯著療效。最近，F(xiàn)DA批準了右雷佐生(dexrazoxane)作為化學保護劑能有效地預(yù)防蒽環(huán)類抗腫瘤藥物如阿霉素等誘發(fā)的心臟毒性，且不影響化療藥物的抗腫瘤活性。它通過在細胞內(nèi)水解成螯合劑，與鐵離子結(jié)合，干擾Fe3+-蒽環(huán)類藥螯合物的形成，進而降低了氧自由基產(chǎn)生。此外，右雷佐生也抑制了這類螯合物對心脂質(zhì)的過氧化，因而對心臟具有獨特的保護作用。該藥現(xiàn)已在北美和歐洲國家上市，主要用于晚期乳腺癌患者。該品作為唯一上市的對蒽環(huán)類抗腫瘤化學藥品心臟毒性有預(yù)防作用的保護劑，已在臨床上取得了顯著的療效。但是，右雷佐生的用藥劑量很大，通常是阿霉素的10倍，而且有一定的腎毒性。來自臨床的信息顯示，如果采用右雷佐生與阿霉素合并給藥的方案，病人的經(jīng)濟負擔將提高5-10倍。因此，開發(fā)新的抗阿霉素心臟毒性藥物具有現(xiàn)實意義。
阿霉素致心臟毒性的機制仍未完全明確。但已有幾種假說得到實驗證據(jù)的支持1)阿霉素誘導(dǎo)產(chǎn)生大量氧自由基，過量的氧自由基引起細胞功能的損傷和死亡(或凋亡)；2)阿霉素蓄積在線粒體中，導(dǎo)致電子傳遞鏈脫偶聯(lián)，細胞能量代謝障礙并因此壞死；3)阿霉素引起細胞內(nèi)鈣離子超載，導(dǎo)致細胞凋亡；4)阿霉素引起NO過量分泌以及超氧陰離子自由基的大量釋放，造成蛋白質(zhì)的硝基化修飾，導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能破壞。
三七皂苷來源于五加科植物三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)，具有廣泛的藥理活性。大量的實驗研究和臨床實踐表明，三七皂苷本身沒有或者僅有微弱的抗氧化活性，但是對氧應(yīng)激引起的心臟損傷具有保護作用，尤其是對缺血性心臟病、心臟的再灌注損傷等具有確切療效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種主要活性成分是含達瑪烷型四環(huán)三萜類皂苷類化合物的中藥提取物，來源于五加科植物三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen)，至少含有三七皂苷R1、人參皂苷Rg1，Rb1，Re和Rd，其含量(HPLC法測定)為45～95％(w/w)。這些成分也可以從其他植物提取獲得，或者通過化學合成或生物轉(zhuǎn)化的途徑獲得。
本發(fā)明提供的中藥提取物，可以添加到其它藥物中，組合成新的放化療輔助藥物。
本發(fā)明的另一個目的是提供含達瑪烷型四環(huán)三萜類皂苷類化合物的中藥提取物在制備減輕蒽環(huán)類抗腫瘤藥物心臟毒性的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明應(yīng)用中藥提取物的對抗蒽環(huán)類抗腫瘤藥物心臟毒性進行了體內(nèi)、體外實驗研究證明，三七皂苷對阿霉素誘導(dǎo)的心臟損傷也有顯著的保護效果，但并不減弱蒽環(huán)類抗腫瘤藥物(如阿霉素)的抗腫瘤效果。可以作為預(yù)防、減輕蒽環(huán)類藥物心臟毒性新型天然制劑。
本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于1.三七皂苷類化合物，屬于達瑪烷型四環(huán)三萜類皂苷，沒有明顯的抗氧化或清除自由基的活性，也沒有明顯的鈣離子絡(luò)合作用，但是能夠發(fā)揮抗阿霉素心臟毒性的效果，意味著其作用機理是新穎的；2.本發(fā)明首次報道了一種中藥植物提取物能減輕阿霉素的心臟毒性，并且不影響阿霉素的抗腫瘤活性，此前尚無任何中藥提取物被報道具有相關(guān)活性；3.盡管三七皂苷的生理活性已經(jīng)得到廣泛的研究，但尚未有人報道三七皂苷在抗阿霉素心臟毒性方面的活性，本發(fā)明將進一步擴大三七的臨床應(yīng)用。鑒于三七及其提取物長期的人用歷史，其安全性已經(jīng)得到廣泛認同，這意味著本發(fā)明具有光明的臨床應(yīng)用前景。


圖1為三七皂苷對阿霉素致心肌細胞損傷的影響。
圖2為三七皂苷對阿霉素抑制人乳腺癌細胞作用的影響具體實施方式
為了更好地理解本發(fā)明，以下結(jié)合實施例作進一步的說明。
實施例1取三七藥材顆粒(3mm-8mm)500g，50℃干燥6小時，加10倍量70％乙醇微沸狀態(tài)加熱回流提取2次，每次2小時，提取液過濾，合并，減壓濃縮至0.5g/mL(生藥量)，上D101大孔樹脂。用4倍量柱體積去離子水沖洗，棄去，再用4BV 0.05％氨水沖洗，棄去，然后用去離子水沖洗至流出液pH＝7，繼續(xù)用4BV 30％乙醇溶液沖洗，棄去，最后用5BV 70％乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至無醇，冷凍干燥，即得三七總皂苷。經(jīng)HPLC外標法測定，精制物中三七皂苷R18％、人參皂苷Rg144％、人參皂苷Rb128％、人參皂苷Rd10％、人參皂苷Re 5％，總皂苷含量達95％以上。
實施例2三七藥材粉碎黃豆大小至粗粉，以40％含水醇熱回流提取4次，回收溶劑，以等體積正丁醇萃取3次，合并萃取液，濃縮至干，粉碎后，加石油醚洗滌2次，脫溶劑干燥即得。采用高效液相法(HPLC)對其進行檢測，分析條件是Agilent Extend-C18，流動相H2O-CH3CN，檢測波長203nm，采用外標法測定其含量，五種成分的含量分別為三七皂苷R13％、人參皂苷Rg125％、人參皂苷Rb114％、人參皂苷Rd 4％、人參皂苷Re 1.5％?？偤?7.5％。
實施例3分離獲得乳鼠(Wistar大鼠)心肌細胞，種入96孔板。細胞密度5×105個/孔。以DMEM+20％FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)48小時后，細胞正常貼壁，部分細胞有規(guī)律地搏動。分別設(shè)對照組，模型組(含0.1、1μM鹽酸阿霉素)，以及不同濃度(12.5-100μg/ml)的三七皂苷組(在加入阿霉素前1小時加入)。培養(yǎng)24小時后，以MTT法進行測定，以490nm比色值反映心肌細胞活力。結(jié)果參見圖1(**P＜0.01；*P＜0.05)。
實驗表明，0.1和1μM鹽酸阿霉素能造成顯著的心肌細胞損傷，MTT值顯著下降；而三七皂苷以12.5～100μg/ml的濃度預(yù)先給藥，顯示一定的保護作用。說明三七皂苷在體外實驗中能預(yù)防和減輕阿霉素導(dǎo)致的心肌細胞損傷。
實施例440只ICR雄性小鼠，體重20±2g，共分為四組，每組10只。正常對照組，灌胃給予生理鹽水，連續(xù)五天；三七皂苷對照組，灌胃給藥三七皂苷100mg/Kg，連續(xù)五天；阿霉素造模組，灌胃給予生理鹽水，連續(xù)五天，最后一次灌胃1h后，腹腔注射阿霉素20mg/Kg；三七治療組，灌胃給藥三七皂苷100mg/Kg，連續(xù)五天，最后一次灌胃1h后，腹腔注射阿霉素20mg/Kg。然后繼續(xù)喂養(yǎng)72小時。動物用戊巴比妥麻醉后，固定，打開胸腔，用26號針頭插入左心室，連接壓力傳感器，以生理記錄儀進行監(jiān)控。記錄心率、最大心室內(nèi)壓、最小心室內(nèi)壓、心室內(nèi)壓上升最大速率等數(shù)據(jù)。
腹腔靜脈取血，凝血后，測定生化指標乳酸脫氫酶(LDH)、激酸激酶(CK)和激酸激酶同功酶(CKMB)；并取心臟，分離心室稱重。然后低溫組織勻漿，取5％組織勻漿測定超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽氧化酶(GSH-Px)和過氧化氫酶(CAT)。
實驗結(jié)果見表1，表2，動物給予阿霉素后，血清LDH、CK和CKMB上升了3～10倍，說明心肌損傷嚴重。組織中的GSH-Px和CAT也有顯著下降，說明機體對抗氧應(yīng)激的系統(tǒng)收到嚴重破壞。心臟功能以心室內(nèi)壓上升最大速率為代表，幾乎降低了50％，說明心臟做功能力也嚴重削弱了。三七皂苷在給予正常動物時，對各項生化、生理指標沒有明顯影響。但是在預(yù)防性給藥五天后，對阿霉素造成的各項損傷均顯示一定的恢復(fù)、遲滯和減輕效果。對各種血清酶的活力降低了20～50％，動物心室內(nèi)壓上升最大速率較模型組高30％左右，顯著改善了心功能。在心肌組織中，顯著提高CAT的活力，可能是其發(fā)揮保護作用的主要原因。
表1三七皂苷對阿霉素急性心臟毒性的保護作用(生化指標)

aa，與正常對照組相比，具有非常顯著差異P＜0.01；a，與正常對照組相比，具有顯著差異P＜0.05；bb，與模型組相比，具有非常顯著差異P＜0.01；b，與模型照組相比，具有顯著差異P＜0.05。
表2三七皂苷對阿霉素急性心臟毒性的保護作用(心臟功能)

aa，與正常對照組相比，具有非常顯著差異P＜0.01；a，與正常對照組相比，具有顯著差異P＜0.05；bb，與模型組相比，具有非常顯著差異P＜0.01；b，與模型照組相比，具有顯著差異P＜0.05。
綜上所述，三七皂苷在100mg/Kg的給藥劑量下，預(yù)先連續(xù)灌胃給予5天，能顯著減輕大劑量阿霉素造成的心肌損傷，且能在一定程度上抑制心功能的減弱。
實施例5人乳腺癌腫瘤細胞MCF-7接種至96孔板，每孔5000細胞。培養(yǎng)24h后，分別設(shè)對照組，模型組(含0、0.1、1μM鹽酸阿霉素)，以及不同濃度(12.5～200μg/ml)的三七皂苷組(在加入阿霉素前1小時加入)。培養(yǎng)24h后，以MTT法進行測定，以490nm比色值反映細胞數(shù)量和活力。結(jié)果參見圖2。
實驗表明，阿霉素對乳腺癌腫瘤細胞MCF-7活力具有明顯的抑制作用，而預(yù)先給予100～12.5μg/ml的三七皂苷對抑制率沒有顯著影響。三七皂苷在高濃度(200μg/ml)下本身就有抑制腫瘤細胞活力的效果。說明三七皂苷并不削弱阿霉素對腫瘤細胞生長的抑制作用。
實施例640只ICR雄性小鼠，體重20±2g，腋下接種小鼠肉瘤S180。飼養(yǎng)48h后，分為四組，每組10只。荷瘤對照組，每日灌胃給予生理鹽水；三七對照組，灌胃給藥三七皂苷100mg/Kg；阿霉素治療組，每日灌胃給予生理鹽水，每日腹腔注射1mg/Kg鹽酸阿霉素；阿霉素和三七合并治療組，每日灌胃給藥三七皂苷100mg/Kg，每日腹腔注射1mg/Kg鹽酸阿霉素。連續(xù)給藥11天，脫頸處死動物，解剖動物，分離取腋下肉瘤，稱重。
表3三七皂苷對阿霉素抑制移植性腫瘤作用的影響

*與荷瘤對照組相比，P＜0.01實驗表明，鹽酸阿霉素在1mg/Kg連續(xù)11天給藥的情況下，對移植性腫瘤S180具有顯著的抑制作用，抑制率達到51.9％。三七皂苷沒有抑制腫瘤生長的效果，但與阿霉素合并用藥沒有降低抑制率。說明三七皂苷并不降低阿霉素的抗腫瘤藥效。
權(quán)利要求
1.一種含達瑪烷型四環(huán)三萜類皂苷的中藥提取物，來自五加科植物三七，其特征是有效成分是瑪烷型四環(huán)三萜類皂苷，其中至少含有三七皂苷R1、人參皂苷Rg1，Rb1，Re和Rd，其重量百分含量為45～95％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含達瑪烷型四環(huán)三萜類皂苷的中藥提取物，其特征是所述的中藥提取物添加到其它藥物中，組合成新的放化療輔助藥物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含達瑪烷型四環(huán)三萜類皂苷的中藥提取物在制備減輕蒽環(huán)類抗腫瘤藥物心臟毒性的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種含達瑪烷型四環(huán)三萜類皂苷的中藥提取物，來源于五加科植物三七，至少含有三七皂苷R
文檔編號A61P35/00GK101040885SQ20071006824
公開日2007年9月26日 申請日期2007年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月26日
發(fā)明者劉靂, 賀慶, 程翼宇, 瞿海斌, 師潤, 史強, 霍楊, 竇靜 申請人:浙江大學