專利名稱：新型硅膠負(fù)載染料親和基質(zhì)的制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種染料親和基質(zhì)，特別是一種新型硅膠負(fù)載染料親和基質(zhì)的制備及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
親和層析是一種具有高度選擇性的生物分子純化方法，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)和多肽等生物分子的分離純化。將對目標(biāo)分子具有特異性和選擇性的配基偶聯(lián)到載體材料上可制得親和層析基質(zhì)?？贵w等生物大分子配基特異性高，但本身需分離純化，制備復(fù)雜、價格較高，且在載體上不易保持其生物活性。仿生染料親和配基易于合成、價格低廉、物理化學(xué)性能穩(wěn)定、不易被生物降解，已成為目前使用最為廣泛的一類配基。染料親和層析已成功用于蛋白質(zhì)和酶的分離純化中。
三嗪染料活性藍(lán)Cibacron blue F3GA是一種重要的仿生染料?；钚运{(lán)具有的平面環(huán)狀結(jié)構(gòu)和帶負(fù)電荷的基團(tuán)與天然生物配基NAD+極其相似，是一種分離核苷酸識別蛋白質(zhì)的理想配基?；钚运{(lán)已被固載于瓊脂糖、葡聚糖、纖維素和聚丙烯酰胺等軟質(zhì)載體及改性硅膠、多孔玻璃等硬質(zhì)載體上，用于核苷酸識別蛋白質(zhì)和酶的分離純化。軟凝膠介質(zhì)機械強度差、承受壓力小，不能進(jìn)行快速淋洗，且分離時間長，易造成生物分子的變性。而硬質(zhì)載體有一定的非特異性吸附。
殼聚糖(Chitosan)是天然類多糖甲殼素脫乙酰化得到的生物大分子。殼聚糖對水和絕大多數(shù)有機溶劑不溶解，分子中存在豐富的氨基具有良好的化學(xué)反應(yīng)特性，適于作為親和基質(zhì)的載體材料。交聯(lián)殼聚糖克服了殼聚糖酸溶性的缺點，具有溶漲性小、性質(zhì)較穩(wěn)定、低的非特異性吸附和強的親水性。一般采用微乳液聚合法制備交聯(lián)殼聚糖微珠。此方法通常需使用大量的液體石蠟等有機溶劑，制得的微珠中包含大量的表面活性劑抽提較為困難。除此之外，所得殼聚糖微珠通常機械強度較差。
本發(fā)明的目的是提供一種制備性能優(yōu)良、適用于親和層析的染料親和基質(zhì)的新方法。本發(fā)明的另一目的是考察制備的染料親和基質(zhì)的應(yīng)用。本發(fā)明將活性藍(lán)共價固載在采用致孔劑聚乙二醇20000制備的硅膠負(fù)載多孔交聯(lián)殼聚糖微珠上，致孔劑的抽提與活性藍(lán)的共價固載同時進(jìn)行。本發(fā)明將殼聚糖負(fù)載在硅膠上，以硅膠作為殼聚糖微珠的核，無需殼聚糖造粒過程，且殼聚糖的負(fù)載克服了硅膠的非特異性吸附，所得載體機械強度高。本發(fā)明采用的交聯(lián)試劑為含有環(huán)氧基團(tuán)、水溶性的無機硅烷試劑γ-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷，殼聚糖的交聯(lián)在水溶液中進(jìn)行，無需任何有機溶劑，所得材料性質(zhì)穩(wěn)定。本發(fā)明的染料親和基質(zhì)具有表面多孔結(jié)構(gòu)，親和配基密度大，且有利于生物分子構(gòu)像和活性的保持。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種制備性能優(yōu)良的染料親和基質(zhì)的新方法，并以過氧化氫酶為例考察其應(yīng)用。本發(fā)明染料親和基質(zhì)制備方法包括以下步驟——a在1mol/L 100mL醋酸溶液中加入殼聚糖4g，致孔劑聚乙二醇15g，磁力攪拌30min，過濾；——b在濾液中加入無機硅烷試劑γ-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷4mL，磁力攪拌30min；——c向溶液中加入60-80目硅膠50g，攪拌均勻，超聲40min，將溶液傾倒到培養(yǎng)皿中，攪拌均勻，室溫靜置至固體干燥；——d將所得固體置于50倍體積的蒸餾水中，然后加入2g活性藍(lán)，60℃密封攪拌30min后加入24g氯化鈉，反應(yīng)2h后升溫至80℃，加入碳酸鈉使pH值約為10，繼續(xù)反應(yīng)30min后冷卻，用去離子水將所得固體洗滌至無色，然后依次用甲醇、2mol/L氯化鈉、6mol/L尿素清洗，去離子水洗滌后，40℃烘干，即得活性藍(lán)偶聯(lián)的硅膠負(fù)載多孔染料親和基質(zhì)。
本發(fā)明染料親和基質(zhì)制備方法中，直接將活性藍(lán)Cibacron blue F3G-A共價偶聯(lián)固載在殼聚糖載體上。染料的固載是通過活性藍(lán)活潑的三嗪基氯與殼聚糖上的氨基的親核取代反應(yīng)進(jìn)行的，如圖1所示。
本發(fā)明是將殼聚糖負(fù)載在硅膠表面制備載體材料，無需殼聚糖造粒過程，殼聚糖微珠的粒徑可以通過改變硅膠粒徑實現(xiàn)。硅膠具有大的比表面積和優(yōu)良的機械強度，因此制備的載體材料機械強度高。同時，殼聚糖的涂覆可以克服硅膠對蛋白質(zhì)的非特異性吸附。
本發(fā)明殼聚糖的交聯(lián)是通過交聯(lián)試劑實現(xiàn)的。水溶性的γ-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷交聯(lián)劑含有雙官能團(tuán)硅甲氧基和環(huán)氧基團(tuán)。殼聚糖的交聯(lián)通過氨基與環(huán)氧基團(tuán)的反應(yīng)及硅甲氧基的水解、縮合實現(xiàn)。殼聚糖的交聯(lián)在水溶液中進(jìn)行，無需任何有機溶劑，所得材料性質(zhì)穩(wěn)定。
本發(fā)明染料親和基質(zhì)的制備，采用一種高分子聚合物-聚乙二醇20000作為致孔劑。聚乙二醇分子中豐富的醚鍵使其具有優(yōu)良的水溶性，能與殼聚糖、硅膠及交聯(lián)劑形成大量氫鍵，具有良好的相容性。溫度的升高可導(dǎo)致氫鍵的斷裂導(dǎo)致聚乙二醇的溶解，從而使載體材料具有表面多孔結(jié)構(gòu)。本發(fā)明活性藍(lán)的共價偶聯(lián)在水溶液中進(jìn)行且需較高的溫度。因此，本發(fā)明染料親和基質(zhì)的制備，致孔劑的抽提與活性藍(lán)的共價固載同時進(jìn)行。所得染料親和基質(zhì)紅外光譜譜圖中無聚乙二醇的特征吸收峰，表明聚乙二醇已被完全抽提。SIRION掃描電子顯微鏡(FEI，USA)用于檢測本專利制得的染料親和基質(zhì)的表面形貌，固體均經(jīng)鍍金后進(jìn)行測試。圖2為本專利制得的染料親和基質(zhì)的掃描電子顯微鏡圖。基質(zhì)材料具有明顯的大孔結(jié)構(gòu)。
本專利制得的染料親和基質(zhì)染料偶聯(lián)量為25.8mg/g，染料樹脂泄漏率實驗表明，分別在0.1、0.5mol/L NaOH；0.1、0.5mol/L HCl、50mmol/L pH7.0的磷酸緩沖液中振蕩3天，染料的泄漏率為零，表明染料在交聯(lián)殼聚糖微珠上的鍵合是非常牢固的。
過氧化氫酶是一種核苷酸識別蛋白，因而活性藍(lán)可用于該酶的親和層析分離。以對過氧化氫酶(Catalase)的親和吸附為例，考察本專利硅膠負(fù)載活性藍(lán)染料親和基質(zhì)的應(yīng)用。
在過氧化氫酶的初始濃度為2mg/mL時，在不同的pH下測定本專利硅膠負(fù)載活性藍(lán)染料親和基質(zhì)對過氧化氫酶的吸附能力。在pH為7時，本專利硅膠負(fù)載活性藍(lán)染料親和基質(zhì)對過氧化氫酶的吸附能力最大。
采用靜態(tài)吸附法測定本專利硅膠負(fù)載活性藍(lán)染料親和基質(zhì)對過氧化氫酶的吸附容量。稱取0.1g染料親和基質(zhì)，加入到4mL不同濃度的過氧化氫酶溶液中，25℃下振蕩吸附2h。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，考馬斯亮蘭法測定上清液中過氧化氫酶。
染料親和基質(zhì)對過氧化氫酶的吸附容量由下式計算Q＝(C0-Ci)V0/WC0過氧化氫酶的初始濃度；Ci吸附后過氧化氫酶的平衡濃度；V0溶液體積；W染料親和基質(zhì)質(zhì)量。
本專利硅膠負(fù)載活性藍(lán)染料親和基質(zhì)對過氧化氫酶的飽和吸附量為38.41mg/g。無染料的硅膠負(fù)載殼聚糖載體對過氧化氫酶的飽和吸附量為0.41mg/g，表明本專利硅膠負(fù)載活性藍(lán)染料親和基質(zhì)的非特異性吸附很小。
本專利硅膠負(fù)載活性藍(lán)染料親和基質(zhì)在柱富集和分離過氧化氫酶過程如下將本專利硅膠負(fù)載活性藍(lán)染料親和基質(zhì)以勻漿法裝柱(10cm×1.6cm i.d.)，以50mmol/LpH7.0的磷酸鹽溶液作為平衡緩沖液平衡柱子。將10mL過氧化氫酶溶液(2mg/mL)以0.5mL/min的流速上柱，然后用平衡緩沖液以1.0mL/min的流速沖洗柱子至流出液的OD280較低。最后，用1mol/L NaSCN pH8.0溶液以1.0mL/min的流速洗脫。高錳酸鉀滴定法測定洗脫液中過氧化氫酶活性，收集有活性的洗脫液。過氧化氫酶活性回收率為89％，表明本專利硅膠負(fù)載活性藍(lán)染料親和基質(zhì)能有效地用于過氧化氫酶的在柱富集和分離。
本發(fā)明的優(yōu)點及效果1、本發(fā)明將活性藍(lán)共價固載在硅膠負(fù)載多孔交聯(lián)殼聚糖微珠上，鍵合牢固，無染料泄漏。
2、本發(fā)明硅膠負(fù)載活性藍(lán)染料多孔親和基質(zhì)的制備，致孔劑的抽提與活性藍(lán)的共價固載同時進(jìn)行，制備方法簡單。
3、本發(fā)明硅膠負(fù)載活性藍(lán)染料多孔親和基質(zhì)的制備，將殼聚糖負(fù)載在硅膠上，采用水溶性的無機硅烷試劑γ-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷對其進(jìn)行交聯(lián)，交聯(lián)過程簡單，無需任何有機溶劑。且改善了殼聚糖載體質(zhì)軟的缺點，機械強度高。
4、本發(fā)明硅膠負(fù)載活性藍(lán)染料多孔親和基質(zhì)，具有優(yōu)良的表面多孔結(jié)構(gòu)，親和配基密度大，蛋白吸附量大，且有利于生物分子構(gòu)像和活性的保持。
5、殼聚糖的負(fù)載克服了硅膠的非特異性吸附，本發(fā)明硅膠負(fù)載活性藍(lán)染料多孔親和基質(zhì)非特異性吸附小。

圖1、活性藍(lán)(a)與殼聚糖(b)的偶聯(lián)反應(yīng)圖2、硅膠負(fù)載活性藍(lán)染料親和基質(zhì)的掃描電子顯微鏡圖具體實施方式
在1mol/L 100mL醋酸溶液中加入精制殼聚糖4g和致孔劑聚乙二醇15g，磁力攪拌30min，濾布過濾后去除不溶殘渣；向濾液中加入無機硅烷試劑γ-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷4mL，磁力攪拌30min后邊攪拌邊在溶液中加入60-80目硅膠50g，攪拌均勻，超聲40min；將懸浮液傾倒到培養(yǎng)皿中，攪拌均勻，室溫靜置至固體干燥，將所得固體置于50倍體積的蒸餾水中，然后加入2g活性藍(lán)，60℃密封攪拌30min后氯化鈉24g，反應(yīng)2h后升溫至80℃，加入碳酸鈉使pH值約為10，繼續(xù)反應(yīng)30min后冷卻，用去離子水將所得固體洗滌至無色，然后依次用甲醇、2mol/L氯化鈉、6mol/L尿素清洗，去離子水洗滌后，40℃烘干，即得活性藍(lán)偶聯(lián)的硅膠負(fù)載多孔染料親和基質(zhì)。
在柱富集和分離過氧化氫酶將制得的硅膠負(fù)載活性藍(lán)染料親和基質(zhì)以勻漿法裝柱(10cm×1.6cm i.d.)，以50mmol/LpH7.0的磷酸鹽溶液作為平衡緩沖液平衡柱子。將10mL過氧化氫酶溶液(2mg/mL)以0.5mL/min的流速上柱，然后用平衡緩沖液以1.0mL/min的流速沖洗柱子至流出液的OD280較低。最后，用1mol/L NaSCN pH8.0溶液以1.0mL/min的流速洗脫。高錳酸鉀滴定法測定洗脫液中過氧化氫酶活性，收集有活性的洗脫液。
權(quán)利要求
1.一種新型硅膠負(fù)載染料親和基質(zhì)的制備及應(yīng)用，其特征是該硅膠負(fù)載染料親和基質(zhì)是通過以下步驟制備的——a在1mol/L100mL醋酸溶液中加入殼聚糖4g，致孔劑聚乙二醇15g，磁力攪拌30min，過濾；——b在濾液中加入無機硅烷試劑γ-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷4mL，磁力攪拌30min；——c向溶液中加入60-80目硅膠50g，攪拌均勻，超聲40min，將溶液傾倒到培養(yǎng)皿中，攪拌均勻，室溫靜置至固體干燥；——d將所得固體置于50倍體積的蒸餾水中，然后加入2g活性藍(lán)，60℃密封攪拌30min后加入24g氯化鈉，反應(yīng)2h后升溫至80℃，加入碳酸鈉使pH值約為10，繼續(xù)反應(yīng)30min后冷卻，用去離子水將所得固體洗滌至無色，然后依次用甲醇、2mol/L氯化鈉、6mol/L尿素清洗，去離子水洗滌后，40℃烘干，即得活性藍(lán)偶聯(lián)的硅膠負(fù)載多孔染料親和基質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型硅膠負(fù)載染料親和基質(zhì)的制備，其特征在于殼聚糖的脫乙酰度為98％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型硅膠負(fù)載染料親和基質(zhì)的制備，其特征在于殼聚糖的分子量為3.2×104g/mol。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型硅膠負(fù)載染料親和基質(zhì)的制備，其特征在于致孔劑為聚乙二醇20000。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型硅膠負(fù)載染料親和基質(zhì)的制備，其特征在于交聯(lián)劑為γ-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型硅膠負(fù)載染料親和基質(zhì)的制備，其特征在于所用染料為活性藍(lán)Cibacron blue F3GA。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型硅膠負(fù)載染料親和基質(zhì)的制備及應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用為核苷酸識別蛋白質(zhì)的富集及分離純化。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新型硅膠負(fù)載染料親和基質(zhì)的制備及應(yīng)用。本發(fā)明將活性藍(lán)共價固載在采用致孔劑聚乙二醇20000制備的硅膠負(fù)載多孔交聯(lián)殼聚糖微珠上，致孔劑的抽提與活性藍(lán)的共價固載同時進(jìn)行，制備方法簡單。本發(fā)明采用含有環(huán)氧基團(tuán)、水溶性的無機硅烷試劑γ－環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷作為殼聚糖的交聯(lián)試劑，交聯(lián)在水溶液中進(jìn)行，過程簡單，無需任何有機溶劑。本發(fā)明將殼聚糖負(fù)載在硅膠上，以硅膠作為殼聚糖微珠的核，無需殼聚糖造粒過程，機械強度高。本發(fā)明硅膠負(fù)載活性藍(lán)染料親和基質(zhì)，具有優(yōu)良的表面多孔結(jié)構(gòu)，親和配基密度大，蛋白吸附量大，且有利于生物分子構(gòu)像和活性的保持。本發(fā)明染料配基鍵合牢固，無染料泄漏，非特異性吸附小。
文檔編號C07K1/00GK1817444SQ20061004215
公開日2006年8月16日 申請日期2006年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月6日
發(fā)明者張書圣, 李峰, 李晶 申請人:青島科技大學(xué)