專利名稱：使用電催化嵌入劑測(cè)定核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)一般地涉及用電催化嵌入劑(intercalator)檢測(cè)核酸的生物傳感器。
背景技術(shù)：
基于核酸的生物傳感器具有從基因分型到分子診斷范圍的潛在應(yīng)用?；跓晒獾募夹g(shù)提供高密度核酸陣列用于分析特異性核酸序列和基因表達(dá)。雖然被廣泛應(yīng)用，但是這些陣列需要標(biāo)記靶核酸樣品。因此，已經(jīng)建議將電化學(xué)傳導(dǎo)法用于核酸雜交事件的超靈敏檢測(cè)。使用電化學(xué)技術(shù)代替熒光可以允許檢測(cè)器更簡(jiǎn)易更小。選擇性地并靈敏性地直接檢測(cè)核酸的能力已經(jīng)成為電化學(xué)研究的重要目標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明人成功地設(shè)計(jì)了用于檢測(cè)樣品中核酸的生物傳感器的新策略。這種策略基于用于超靈敏核酸檢測(cè)的新的核酸嵌入劑的合成和分析應(yīng)用。
在多種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供式I的核心化合物L(fēng)1-D-L2(I)其中D是二價(jià)環(huán)狀基團(tuán)。L1和L2各自獨(dú)立地是連接基團(tuán)，所述連接基團(tuán)包含具有約3到約20個(gè)非氫原子的有機(jī)胺、脂肪族氨基和含氮部分。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供包含式I的核心化合物的電催化嵌入劑，所述式I的核心化合物與式II的過(guò)渡金屬化合物相結(jié)合
其中M是可以與氮形成配位鍵的金屬元素。R和R’是在其氮原子上與M配位的含氮有機(jī)部分。Z是鹵素原子和m是+1、+2、+3、+4、+5或+6。X是平衡m的陰離子或陰離子組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，金屬元素是釕。
在多種進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供用于制備上述電催化嵌入劑的方法。所述方法包括使式I的核心化合物與式II的過(guò)渡金屬化合物相接觸以在核心化合物和過(guò)渡金屬化合物之間形成金屬-氮配位鍵。
本發(fā)明還提供利用上述電催化嵌入劑進(jìn)行核酸電催化檢測(cè)的方法。在多個(gè)實(shí)施方案中，所述電催化嵌入劑與包含靶核酸的復(fù)合物相接觸以將所述電催化嵌入劑嵌入該復(fù)合物中。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及包含電催化嵌入劑的試劑盒，以及利用這種電催化嵌入劑進(jìn)行核酸電催化檢測(cè)的生物傳感器。


技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解下述附圖僅僅是為了舉例說(shuō)明的目的。所述附圖不希望以任何方式限制本發(fā)明教導(dǎo)的范圍。
圖1舉例說(shuō)明PIND在CDCl3中的質(zhì)子核磁共振(1H NMR)譜(300MHz)。
圖2舉例說(shuō)明用電噴霧離子化模式對(duì)PIND進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。
圖3舉例說(shuō)明Ru(bpy)2Cl2(跡線1)、PIND在乙二醇中回流30分鐘后的Ru(bpy)2Cl2(跡線2)、和純化的PIND-Ru(跡線3)的循環(huán)伏安圖，其中(跡線3)的支持電介質(zhì)是PBS并且電勢(shì)掃描速率是100mV/s。
圖4舉例說(shuō)明純化的PIND-Ru在PBS中的循環(huán)伏安圖，其中從伏安圖最內(nèi)部到最外部的電勢(shì)掃描速率是100(跡線1)、200(跡線2)、300(跡線3)、400(跡線4)和500(跡線5)mV/s。
圖5舉例說(shuō)明(A)作為0(跡線1)、25(跡線2)、50(跡線3)和100(跡線4)μM的增加濃度的鮭精DNA(堿基對(duì))的函數(shù)，25μMPIND-Ru的紫外-可見光譜；(B)PIND-Ru對(duì)包含序列5′-AATTT-CCCCC-AAATT的發(fā)夾寡核苷酸的熒光嵌入劑置換滴定曲線。
圖6舉例說(shuō)明(A)200nM聚(T)40(跡線1)、和分別與其互補(bǔ)CP包被電極雜交的200nM聚(AT)20(跡線2)、聚(AG)20(跡線3)和聚(G)40(跡線4)的循環(huán)伏安圖；(B)p53核酸雜交的生物傳感器在PBS中的第一(跡線1)和第五(跡線2)電勢(shì)循環(huán)，其中電勢(shì)掃描速率是100mV/s。
具體實(shí)施例方式
根據(jù)本發(fā)明，申請(qǐng)人已發(fā)現(xiàn)新的電催化嵌入劑，其插入核酸的堿基對(duì)之間并在加電化學(xué)勢(shì)差之后催化核苷酸的氧化。本發(fā)明的嵌入劑包含有助于嵌入劑電催化性質(zhì)的多種部分。申請(qǐng)人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的電催化嵌入劑選擇性摻入雙鏈核酸中并且高效電催化作用提供靈敏的非標(biāo)記測(cè)定或檢測(cè)靶核酸的通用平臺(tái)。
例如，穿線型(threading)嵌入劑是一組與雙鏈核酸可逆性相互作用的重要化合物。穿線型嵌入劑具有共同的結(jié)構(gòu)特征，例如，存在平面多芳香體系，其結(jié)合插入雙鏈DNA的堿基對(duì)之間。不受任何具體理論約束，在本發(fā)明的電催化嵌入劑嵌入雙鏈核酸中之后，在電極處檢測(cè)到電子流，其中所述電催化嵌入劑氧化核苷酸并且電子從核苷酸轉(zhuǎn)移到生物傳感器/電極。不限制本發(fā)明的應(yīng)用、功能或組合物，所述電催化嵌入劑在電化學(xué)勢(shì)差現(xiàn)象后氧化核苷酸。在催化循環(huán)中，嵌入劑被電極氧化，其能從核苷酸移除電子而形成自由基陽(yáng)離子，所述自由基陽(yáng)離子脫質(zhì)子并經(jīng)歷進(jìn)一步反應(yīng)。因此該反應(yīng)是催化性的并通過(guò)一系列反應(yīng)消耗核酸，這些反應(yīng)直接從核酸移除電子并將它們轉(zhuǎn)移到電極，產(chǎn)生可檢測(cè)的電流。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有對(duì)應(yīng)于式(I)的結(jié)構(gòu)的核心化合物L(fēng)1-D-L2(I)式(I)中，D代表可具有一個(gè)或多個(gè)取代基的二價(jià)環(huán)狀基團(tuán)。該二價(jià)環(huán)狀基團(tuán)優(yōu)選包含平面環(huán)狀基團(tuán)。二價(jià)環(huán)狀基團(tuán)的非限定性實(shí)例包括在其兩個(gè)氮原子上具有兩個(gè)鍵合位點(diǎn)的萘二酰亞胺基、在2-和6-位或1-和5-位(優(yōu)選2-和6-位)具有兩個(gè)鍵合位點(diǎn)的蒽基、以與蒽基中相同方式具有兩個(gè)鍵合位點(diǎn)的蒽醌基、在2-和6-位具有兩個(gè)鍵合位點(diǎn)的芴基、在2-和6-位具有兩個(gè)鍵合位點(diǎn)的亞聯(lián)苯基、在2-和7-位具有兩個(gè)鍵合位點(diǎn)的菲(phenantholene)基、和在2-和7-位具有兩個(gè)鍵合位點(diǎn)的芘基。優(yōu)選的環(huán)狀基團(tuán)是在其兩個(gè)氮原子上具有兩個(gè)鍵合位點(diǎn)的萘二酰亞胺基。二價(jià)環(huán)狀基團(tuán)的取代基的非限定性實(shí)例包括鹵原子(例如氯(Cl)或溴(Br)，或具有1到6個(gè)碳原子的烷基如甲基、乙基或正丙基)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，D是核酸嵌入劑。嵌入劑是可以在雙鏈核酸例如DNA/DNA或DNA/RNA雜合體的堿基對(duì)之間滑動(dòng)的分子。優(yōu)選地，所述嵌入劑包含萘二酰亞胺基。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述嵌入劑包含1，4，5，8-萘四羧酸二酐。
上述的式(I)中，L1和L2各自獨(dú)立地是連接基團(tuán)，所述連接基團(tuán)包含具有約3到約20個(gè)非氫原子的有機(jī)胺、脂肪族氨基，還包含可提供金屬-氮配位鍵的含氮部分。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，含氮部分是含有至少一個(gè)氮原子的雜環(huán)。適宜的含氮部分的非限定性實(shí)例包括咪唑、苯并咪唑、吡咯、吡唑、三唑、苯并三唑、吡啶、噠嗪、吡嗪、嘧啶和三嗪。所述雜環(huán)的一個(gè)氮可以與金屬形成配位鍵。優(yōu)選的含氮部分是咪唑。當(dāng)含氮部分是雜環(huán)時(shí)，所述脂肪族氨基優(yōu)選在附著至所述環(huán)的烷基上。所述烷基可以是直鏈或支鏈的并通常含有約1到約20個(gè)碳原子，優(yōu)選約2到約12個(gè)碳原子，更優(yōu)選約3到約6個(gè)碳原子。優(yōu)選的連接基是3-氨基丙基咪唑。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，具有對(duì)應(yīng)于上述式(I)的結(jié)構(gòu)的化合物是電催化嵌入劑的一部分。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述電催化嵌入劑包含鍵合到式(II)的過(guò)渡金屬化合物的式(I)的化合物 其中M是與氮形成配位鍵的金屬元素。R和R’是在其氮原子上與M配位的含氮有機(jī)部分。Z是鹵原子和m是+1、+2、+3、+4、+5或+6。X是平衡m的陰離子或陰離子組合。
式II中，適于用作M的金屬元素包括，例如釕(Ru)、鋨(Os)、鋅(Zn)、鐵(Fe)、銠(Rh)、錸(Re)、鉑(Pt)、鈧(Sc)、鈦(Ti)、釩(V)、鎘(Cd)、鎂(Mg)、銅(Cu)、鈷(Co)、鈀(Pd)、鉻(Cr)、錳(Mn)、鎳(Ni)、鉬(Mo)、鎢(W)、銥(Ir)及其混合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，金屬元素M是過(guò)渡金屬釕(Ru)。
式II的R和R’可以相同或不同，并且在其氮原子上與金屬元素配位。R、R’或兩者同時(shí)可以是例如2，2’-聯(lián)吡啶基；用一或多個(gè)取代基取代的2，2’-聯(lián)吡啶基，所述取代基選自C1-C4烷基、苯基和用一或多個(gè)C1-C4烷基取代的苯基；1，10-菲咯啉基和用一或多個(gè)取代基取代的1，10-菲咯啉基，所述取代基選自C1-C4烷基、苯基和用一或多個(gè)C1-C4烷基取代的苯基。優(yōu)選地，R和R’中至少一個(gè)是2，2’-聯(lián)吡啶基。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，R和R’中至少一個(gè)并優(yōu)選都是2，2’-聯(lián)吡啶基或1，10-菲咯啉基，其中任一個(gè)任選地可以被取代。當(dāng)聯(lián)吡啶基或菲咯啉基被取代時(shí)，取代基優(yōu)選地選自C1至C4烷基、苯基和進(jìn)一步用C1-C4烷基取代的苯基，更優(yōu)選C1-C2烷基。取代的聯(lián)吡啶基或菲咯啉基配基可以是單取代的、二取代的或更高取代的。在多個(gè)實(shí)施方案中，可以使用二取代的配基，包括例如4，4’-二取代-2，2’-聯(lián)吡啶基、5，5’-二取代-2，2’-聯(lián)吡啶基、1，10-菲咯啉基、4，7-二取代-1，10-菲咯啉基和5，6-二取代-1，10-菲咯啉基。
當(dāng)R和R’中僅一個(gè)是聯(lián)吡啶基或菲咯啉基、或者以上討論的任選取代基團(tuán)之一時(shí)，另一個(gè)優(yōu)選地選自含有兩個(gè)能與金屬M(fèi)形成配位鍵的氮原子的脂肪族配基。非限定性實(shí)例包括1，3-丙二胺、1，4-丁二胺及其衍生物，其中所述衍生物基于1，3-丙二胺或1，4-丁二胺骨架，所述骨架任選地用烷基、芳基或其它基團(tuán)取代，這些基團(tuán)不干擾氮元素與金屬M(fèi)的配位鍵合或者不干擾所述配合物的電化學(xué)活性。
式II中，Z是鹵原子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，Z是氯或溴，并且更優(yōu)選氯。上標(biāo)m是+1、+2、+3、+4、+5或+6，取決于M的氧化態(tài)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，例如，當(dāng)M是+4氧化態(tài)的釕時(shí)，Z是氯并且m是+3。X是平衡所述陽(yáng)離子的形式電荷m的陰離子或陰離子組合。例如，X可以是，但不限于，氯、溴、碘、氟、四氟硼酸、高氯酸、硝酸、硫酸、碳酸或亞硫酸。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的電催化嵌入劑包含鍵合到式(II)化合物的式(I)化合物，其中D是1，4，5，8-萘四羧酸二酐，L1和L2各自是3-氨基丙基咪唑，M是釕，R和R’各自是2，2’-聯(lián)吡啶基，并且Z是氯。更優(yōu)選地本發(fā)明的電催化嵌入劑包含式
本發(fā)明還提供制備上述電催化嵌入劑的方法。在本發(fā)明的一種優(yōu)選方法中，通過(guò)通式(I)的核心化合物與通式(II)的過(guò)渡金屬化合物之間的配基交換來(lái)制備所述電催化嵌入劑。本文描述的過(guò)渡金屬化合物包含填充配基Z，在配基交換條件下，所述填充配基Z幫助形成與金屬的穩(wěn)定配合物并且可被所述連接基置換。優(yōu)選的連接基包含提供與金屬的金屬-氮配位鍵的含氮部分。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，金屬是釕，Z是氯，并且連接基是3-氨基丙基咪唑。
本發(fā)明的電催化嵌入劑可以用于檢測(cè)樣品中的靶核酸。在非限定性實(shí)例中，在固相載體如電極的表面形成包含核酸和電催化嵌入劑的配合物并檢測(cè)電子轉(zhuǎn)移。根據(jù)本發(fā)明，電催化嵌入劑插入到包含與互補(bǔ)探針?lè)肿与s交的靶核酸的雙鏈核酸的堿基對(duì)之間。不限制本發(fā)明的機(jī)理、功能或應(yīng)用，這些方法利用核苷酸的電化學(xué)氧化。在插入雙鏈核酸中并在適當(dāng)?shù)碾娀瘜W(xué)勢(shì)差時(shí)，所述電催化嵌入劑可以氧化核苷酸，優(yōu)選鳥嘌呤。不受特定的理論約束，在催化循環(huán)中，嵌入劑被電極氧化，其能從核苷酸移除電子以形成自由基陽(yáng)離子，所述自由基陽(yáng)離子脫質(zhì)子并經(jīng)歷進(jìn)一步反應(yīng)。該反應(yīng)是催化性的并通過(guò)一系列反應(yīng)導(dǎo)致核酸的消耗，所述反應(yīng)直接從核酸移除電子并將它們轉(zhuǎn)移到電極，從而產(chǎn)生可檢測(cè)的電流。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)靶核酸與探針雜交，其中所述探針或被固定在電極表面或能結(jié)合到電極表面，在所述電極表面形成包含靶核酸和電催化嵌入劑的配合物。適宜的探針可以包含核酸，所述核酸包含與靶核酸的特定序列互補(bǔ)的單鏈區(qū)。待檢測(cè)的靶核酸可以包含核酸，如所指出，其可以是單鏈或雙鏈核酸，或含有雙鏈或單鏈序列的部分。如果靶核酸僅包含雙鏈核酸，應(yīng)當(dāng)理解在靶核酸與互補(bǔ)探針雜交之前需要變性。
靶核酸可以是DNA(或基因組或eDNA)、RNA或雜合體，其中核酸含有脫氧核糖-和核糖-核苷酸的任意組合和堿基的任意組合，包括例如，尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、肌苷(inosine)、黃嘌呤(xathanine)、次黃嘌呤(hypoxathanine)等等。靶核酸與探針例如可以通過(guò)雜交結(jié)合。
通常，探針可以包含，例如，寡核苷酸，包括DNA、mRNA、rRNA、tRNA、肽核酸(PNAs)或表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)?？梢詮腄NA或其片段得到探針，可以通過(guò)從活體提取、限制酶切割、電泳分離和熱處理或堿處理變性得到所述DNA或其片段。所述探針也可以化學(xué)合成。還可以用替代性堿基合成所述探針，所述替代性堿基取代探針鏈中的鳥嘌呤(即，如鳥嘌呤一樣，與核酸雙鏈中胞嘧啶的親和力大于與其它堿基的親和力的堿基)，但在合適反應(yīng)條件下不被所述電催化嵌入劑氧化。替代性堿基的實(shí)例是肌苷(inosine)和7-去氮雜-鳥嘌呤。
適于制備所述探針的堿基可選自天然或非天然或“合成”核苷酸堿基。天然核苷酸堿基可以是，例如，腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶和胸腺嘧啶。探針還可以從非天然或“合成”核苷酸堿基制備，例如7-去氮雜-鳥嘌呤、8-氧-鳥嘌呤、6-巰基鳥嘌呤、4-乙酰胞苷、5-(羧基羥乙基)尿苷、2’-O-甲基胞苷、5-羧甲基氨基-甲基-2-硫代尿苷(thioridine)、5-羧甲基氨甲基尿苷、二氫尿苷、2’-O-甲基假尿苷、β，D-半乳糖Q核苷(queosine)、2’-O-甲基鳥苷、肌苷、N6-異戊烯基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鳥苷、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥苷、2-甲基腺苷、2-甲基鳥苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鳥苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿苷(thioridine)、β，D-甘露糖Q核苷(queosine)、5-甲氧羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-甲基硫代-N6-異戊烯基腺苷、N-((9-β-D-呋喃核糖基-2-甲基硫代嘌呤-6-基)氨基甲酰)蘇氨酸、N-((9-β-D-呋喃核糖嘌呤-6-基)N-甲基氨基甲酰)蘇氨酸、尿苷-5-氧乙酸甲酯、尿苷-5-氧乙酸、wybutoxosine、假尿苷、Q核苷(queosine)、2-硫代胞苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-β-D-呋喃核糖嘌呤-6-基)氨基甲酰)蘇氨酸、2’-O-甲基-5-甲基尿苷、2’-O-甲基尿苷、wybutosine和3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷。可以利用任意寡核苷酸骨架，包括DNA、RNA、修飾糖如碳環(huán)、和含有2’取代例如氟和甲氧基的糖。所述寡核苷酸可以是這樣的寡核苷酸，其中至少一個(gè)或全部核苷酸間橋連磷酸殘基是修飾磷酸酯，如甲基膦酸酯、甲基硫代膦酸酯、嗎啉代磷酸酯(phosphoromorpholidates)、哌嗪代磷酸酯(phosphoropiperazidates)和氨基磷酸酯(例如，每隔一個(gè)核苷酸間橋連磷酸酯殘基可以是所述修飾殘基)。所述寡核苷酸可以是“肽核酸”如P.Nielsen et al.，Science 254，1497-1500(1991)中描述，其內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。唯一的要求是寡核苷酸探針應(yīng)該具有這種序列，其至少一部分能結(jié)合到DNA樣品序列的已知部分上。在一些應(yīng)用中，可能需要將靶核酸樣品與許多具有不同堿基序列的寡核苷酸探針相接觸(例如，樣品中有兩種或多種靶核酸，或者在“三明治”測(cè)試中單一靶核酸雜交到兩個(gè)或多個(gè)探針上)探針?lè)肿涌梢怨潭ㄔ陔姌O上。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，探針附著在金電極上。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解可以通過(guò)許多本領(lǐng)域公知的技術(shù)將探針固定在電極上。使用文獻(xiàn)方法，有多種技術(shù)可以應(yīng)用并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，用于將探針固定在根據(jù)本發(fā)明使用的電極表面上。
在非限定性實(shí)例中，可以將巰基附著到探針?lè)肿永绻押塑账峄蚨嗑酆塑账岬?’-或3’-末端(優(yōu)選5’-末端)，并且附著的巰基與電極的金原子配位。M.Maeda et al.，Chem.Lett.，1805-1806(1994)和A.Connolly，Nucleic Acids Res.，13，4484(1985)描述了將巰基結(jié)合至DNA的方法，其內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。在所述固定方法中，將具有巰基末端的探針?lè)肿拥蔚浇痣姌O上，然后使之在低溫放置幾小時(shí)以后期望的探針?lè)肿泳捅还潭ㄔ陔姌O上。
在另一個(gè)非限定性實(shí)例中，例如使用玻璃碳電極，電極被高錳酸鉀氧化而在電極表面產(chǎn)生羧基。在具有羧基的表面上滴加含巰基末端的探針?lè)肿樱沟眯纬甚０锋I以將探針?lè)肿庸潭ㄔ诓Ａ茧姌O的表面上。K.M.Millan et al.，Analytical Chemistry，65，2317-2323(1993)中描述了這種方法的細(xì)節(jié)，其內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。
還可以使用識(shí)別對(duì)將探針結(jié)合到電極上。在此方面，探針可以被修飾以包含識(shí)別對(duì)的第一成員而電極表面包被第二成員。因此，通過(guò)識(shí)別對(duì)的第一和第二成員的相互作用可以在電極表面形成包含探針/靶核酸雜合體的雙鏈核酸。識(shí)別對(duì)及其對(duì)多種分子的附著是本領(lǐng)域中已知的。在非限定性實(shí)例中，識(shí)別對(duì)由生物素和親合素組成。
可以在添加嵌入劑之前或嵌入劑存在下進(jìn)行靶核酸與探針的雜交，優(yōu)選使用嵌入劑的濃度是幾nM到幾mM?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適的方式使靶核酸樣品與探針相接觸。例如，靶樣品可以溶解在溶液中，并通過(guò)在允許雜交的條件下將探針溶解在含有靶樣品的溶液中來(lái)與探針相接觸。適宜的條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并且包括多種鹽濃度條件。作為替代，可以將靶樣品溶解在溶液中，而探針固定在在固相載體上，由此通過(guò)將具有固定于其上的寡核苷酸探針的固相載體浸在含有靶樣品的溶液中，而可以使得靶樣品與探針相接觸。通過(guò)向電極施加電勢(shì)并檢測(cè)電流來(lái)測(cè)定靶核酸與探針的雜交。
本發(fā)明的電催化嵌入劑還可以用于檢測(cè)與探針?lè)肿硬糠值鼗パa(bǔ)的靶核酸片段樣品。這種片段樣品通常稱為“錯(cuò)配片段”。通過(guò)比較可能錯(cuò)配的靶核酸片段的檢測(cè)中得到的峰電流強(qiáng)度與完全互補(bǔ)的靶核酸片段(即完全匹配的片段)的檢測(cè)中得到的相應(yīng)峰電流強(qiáng)度，可進(jìn)行錯(cuò)配片段的檢測(cè)。
可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適方法檢測(cè)包括氧化和還原的催化循環(huán)。檢測(cè)與氧化和還原反應(yīng)相關(guān)的電信號(hào)允許確定是否存在雜交的探針/靶核酸?？梢酝ㄟ^(guò)任意適宜的方法進(jìn)行反應(yīng)速率測(cè)量的步驟。例如，通過(guò)比較作為掃描速率、探針濃度、靶濃度、介質(zhì)、緩沖劑、溫度和/或電化學(xué)方法的函數(shù)的電流來(lái)測(cè)定相對(duì)反應(yīng)速率。
可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意適宜的方法檢測(cè)氧化-還原反應(yīng)速率。典型地，通過(guò)檢測(cè)與發(fā)生氧化-還原反應(yīng)相關(guān)的電信號(hào)來(lái)檢測(cè)氧化-還原反應(yīng)速率。例如，可以通過(guò)提供與檢測(cè)電極電子通訊的合適設(shè)備來(lái)檢測(cè)與氧化和還原反應(yīng)相關(guān)的電信號(hào)。合適的設(shè)備可以檢測(cè)所產(chǎn)生的電信號(hào)，從而提供雜交的探針/靶核酸與電催化嵌入劑反應(yīng)的氧化-還原反應(yīng)速率的測(cè)量。所述電信號(hào)可以具有任意電化學(xué)方法的特征，包括循環(huán)伏安法、常規(guī)脈沖伏安法、計(jì)時(shí)電流法和方波伏安法，其中循環(huán)伏安法是目前優(yōu)選的形式。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法用于遺傳診斷。例如，寡核苷酸探針可以用于測(cè)定靶分析物序列，例如與多種癌癥相關(guān)的p53基因。另一些非限定性實(shí)例包括非息肉性結(jié)腸癌基因、BRCAl乳癌基因、ApoE4基因(該基因指示阿爾茨海默病的較大風(fēng)險(xiǎn)，允許容易的癥狀前篩查患者)、囊性纖維化基因的突變或本領(lǐng)域公知的任意其它基因。
在多個(gè)另外的實(shí)施方案中，可以用本發(fā)明的電催化嵌入劑進(jìn)行病毒和細(xì)菌檢測(cè)。在該實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)探針以檢測(cè)來(lái)自多種細(xì)菌和病毒的靶序列。本文公開的方法允許直接篩選臨床樣品以檢測(cè)例如HIV核酸序列。此外，作為一種改進(jìn)的評(píng)價(jià)抗病毒治療療效的方法，這允許直接監(jiān)測(cè)患者內(nèi)的循環(huán)中的病毒。相似地，以此方式可以檢測(cè)白血病相關(guān)病毒、HTLV-I和HTLV-II。還可以檢測(cè)細(xì)菌感染例如結(jié)核。
在另一些實(shí)施方案中，在例如水和食物樣品篩選中有毒細(xì)菌的探針。例如，可以處理樣品以裂解細(xì)菌使得細(xì)菌釋放其核酸，然后設(shè)計(jì)探針來(lái)識(shí)別菌株，包括但不限于致病菌株，如沙門氏菌、彎曲桿菌、霍亂弧菌、大腸桿菌的腸毒性株和軍團(tuán)病細(xì)菌。相似地，可以用本發(fā)明組合物評(píng)價(jià)生物治療策略。
在另一些實(shí)施方案中，所述探針可以用于法醫(yī)學(xué)，其中DNA指紋分析用于匹配犯罪現(xiàn)場(chǎng)的靶核酸如DNA來(lái)對(duì)比從受害者和嫌疑者取得的樣品。
靶核酸的來(lái)源可以包括例如人、動(dòng)物、植物或環(huán)境。
在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及包含電催化嵌入劑的試劑盒。所述試劑盒還可以包含探針，例如本文描述的那些，其可以識(shí)別并結(jié)合待檢測(cè)的靶核酸。
在很多另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及使用本文所述電催化嵌入劑的生物傳感器。所述生物傳感器可包含一種設(shè)備或用于系統(tǒng)中，所述設(shè)備或系統(tǒng)包括必要的組件，用于檢測(cè)和測(cè)量一或多種電催化嵌入劑產(chǎn)生的信號(hào)。設(shè)備可包含包括生物傳感器陣列的集成電路，并與電源和檢測(cè)器相組合。這種集成電路是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。包括所述生物傳感器陣列的系統(tǒng)還可以包括在施加跨工作電極的電勢(shì)之后測(cè)量電化學(xué)信號(hào)的裝置。
本文描述的方法和設(shè)備使用技術(shù)人員公知的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，并可以在實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中發(fā)現(xiàn)，例如Sambrook，J.，et al，Molecular CloningALaboratory Manual，3rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001；Spector，D.L.et al，CellsALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1998；和Harlow，E.，Using AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1999。
本文描述的方法和設(shè)備使用技術(shù)人員公知的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，并可以在實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中發(fā)現(xiàn)，例如Sambrook，J.，et al，Molecular CloningALaboratory Manual，3rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001；Spector，D.L.et al，CellsALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1998；和Harlow，E.，Using AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1999。
本文使用的標(biāo)題(例如“背景技術(shù)”和“發(fā)明內(nèi)容”)僅僅是為了大致組織本發(fā)明公開內(nèi)的主題，而不是為了限制本發(fā)明的公開內(nèi)容或其任何方面。具體而言，“背景技術(shù)”中公開的主題可以包括本發(fā)明范圍內(nèi)的技術(shù)方面但并不構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)?！鞍l(fā)明內(nèi)容”中公開的主題并不是本發(fā)明全部范圍或其任意實(shí)施方案的窮盡的或全部公開。
本文的參考引用不等于承認(rèn)那些參考是現(xiàn)有技術(shù)或與本文公開的發(fā)明的專利性有任何相關(guān)性。因此說(shuō)明書中引用的所有參考以其全部?jī)?nèi)容經(jīng)引用并入本文。
說(shuō)明書和具體實(shí)施例，盡管展示了本發(fā)明的實(shí)施方案，但是僅是為了舉例說(shuō)明的目的，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。然而，具有所列特征的多種實(shí)施方案的敘述不是為了排除具有另外特征的其它實(shí)施方案、或合并所列特征的不同組合的其它實(shí)施方案。具體實(shí)施例是為了舉例說(shuō)明如何制備、使用和實(shí)施本發(fā)明的組合物和方法的目的而提供的；除非另外明確指出，它們不是意圖代表已經(jīng)或未曾實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明的所給實(shí)施方案。
本文所用的單詞“優(yōu)選”是指在某些情況下提供某些利益的本發(fā)明的實(shí)施方案。然而，在相同的或另外的情況下，另外的實(shí)施方案也可以是優(yōu)選的。而且，提到一個(gè)或多個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案并不意味著另外的實(shí)施方案不可用，并且沒(méi)有意圖將另外的實(shí)施方案排除在本發(fā)明范圍以外。
本文所用的單詞“包括”及其變體意思是非限定性的，例如列表中提到的項(xiàng)目并不排除可以其它類似的項(xiàng)目也可用于本發(fā)明的材料、組合物、設(shè)備和方法中。
以下描述中，術(shù)語(yǔ)“測(cè)定”或“檢測(cè)”將用于表示定性和定量地測(cè)定或檢測(cè)樣品中核酸。例如，當(dāng)以下定義的方法和系統(tǒng)用于測(cè)定或檢測(cè)介質(zhì)中核酸時(shí)，這意味著表示確定介質(zhì)中核酸的存在和任選地其濃度。因此，短語(yǔ)“確定是否存在”意思包括定性測(cè)定和定量測(cè)定是否存在所檢測(cè)事件(例如，DNA雜交、RNA雜交、檢測(cè)靶核酸等)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“嵌入劑”是指能插入和/或堆疊在核酸堿基對(duì)之間的平面芳香或雜芳基結(jié)構(gòu)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“穿線型(threading)嵌入劑”是指具有取代基或側(cè)鏈的嵌入劑。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“電催化嵌入劑”是指可以被電極氧化并且在電化學(xué)勢(shì)差現(xiàn)象之后可以氧化核苷酸的嵌入劑。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“核酸”是指任意核酸，包括DNA和RNA。本發(fā)明的核酸典型地是多聚核苷酸；也就是說(shuō)，是通過(guò)3’，5’磷酸二酯鍵共價(jià)連接的單個(gè)核苷酸的聚合物。盡管本發(fā)明的方法和設(shè)備在本文中有時(shí)用DNA來(lái)解釋，但是這是為了清楚的目的，并且應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的方法和設(shè)備可以用于其它核酸例如RNA。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)核酸”是指特異性結(jié)合另一個(gè)核酸而形成雜交核酸的任意核酸，包括寡核苷酸探針。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“雜交”是指相互結(jié)合的至少兩個(gè)核酸鏈，其可以是或不是全部堿基配對(duì)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“變性”是指一種過(guò)程，通過(guò)所述過(guò)程寡核苷酸雙鏈不再通過(guò)氫鍵堿基配對(duì)而是被分成單鏈分子。變性方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并包括熱變性和堿變性。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“電極”是指?jìng)鲗?dǎo)電流進(jìn)出導(dǎo)電介質(zhì)的電導(dǎo)體。兩個(gè)電極，陽(yáng)極和陰極，分別接受和發(fā)射電子。電極通常用于描述導(dǎo)體。在本發(fā)明中，電極還可以是很多分離可尋址的電極組成的微陣列，或是超微電極。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“核苷”是指連接戊糖如核糖、脫氧核糖或其衍生物或類似物的含氮雜環(huán)堿基。術(shù)語(yǔ)“核苷酸”是指核苷的磷酸酯，包含含氮雜環(huán)堿基、戊糖和一或多個(gè)磷酸酯或其它骨架形成基團(tuán)；它是寡核苷酸的單體單元。核苷酸單元可以包括常見堿基如鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、或其衍生物。戊糖可以是脫氧核糖、核糖或由此取代的基團(tuán)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“核苷酸類似物”、“修飾堿基”、“堿基類似物”或“修飾核苷酸”是指功能與其天然對(duì)應(yīng)物相似但是結(jié)構(gòu)已被改變的部分。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”或“核苷酸序列”是指從天然雜環(huán)堿基和呋喃戊糖等價(jià)基團(tuán)通過(guò)磷酸二酯鍵或其它骨架形成基團(tuán)連接、并以特定序列形成的多個(gè)相連的核苷酸單元。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸類似物”或“修飾寡核苷酸”是指功能與天然寡核苷酸相似但具有非天然部分的組合物。寡核苷酸類似物或修飾寡核苷酸可以具有改變的糖部分、改變的堿基、同時(shí)具有改變的糖和堿基或者改變的糖間連接，這些已知用于本領(lǐng)域中。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“生物傳感器”是指包含檢測(cè)或測(cè)量在氧化或還原反應(yīng)中所產(chǎn)生電子遷移而產(chǎn)生的信號(hào)的必要組件的設(shè)備或系統(tǒng)。術(shù)語(yǔ)“生物傳感器”包括用于測(cè)定物質(zhì)濃度和生物學(xué)感興趣的其它參數(shù)的設(shè)備，即使并不直接利用生物學(xué)系統(tǒng)。
實(shí)施例以下實(shí)施例是為了舉例說(shuō)明而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1該實(shí)施例舉例說(shuō)明電催化嵌入劑的合成(用Ru(bpy)2Cl2接枝的N，N’-雙[1(3-丙基)-咪唑]-1，4，5，8-萘二酰亞胺(PIND)(“PIND-Ru”))。
PIND-Ru的合成如下所述
按1，4，5，8-萘四羧酸二酐(ND)合成的一般步驟制備PIND。將0.30g1，4，5，8-萘四羧酸二酐緩慢加入到3.0ml 3-氨丙基咪唑(AI)和3.0ml四氫呋喃的磁力攪拌的混合物中。控制添加速率使得很少結(jié)渣。回流反應(yīng)混合物24h，然后冷卻至室溫。接下來(lái)，將該反應(yīng)分散在10ml丙酮/水(3/1)混合物中，然后倒入500ml快速攪拌的無(wú)水醚中沉淀所述化合物。通過(guò)精細(xì)燒結(jié)漏斗抽濾來(lái)收集沉淀，并用乙醇簡(jiǎn)單洗滌。從氯仿/乙醇(1/1體積)中結(jié)晶進(jìn)行純化并在真空和40℃過(guò)夜干燥得到0.46g黃色結(jié)晶(收率85％)。
通過(guò)一步配基交換反應(yīng)合成PIND-Ru。向Ru(bpy)2Cl2(0.52mmol)在8.0ml新鮮蒸餾的乙二醇溶液中在10分鐘時(shí)間以小份添加PIND(0.25mmol)，回流所得混合物30到40分鐘。通過(guò)循環(huán)伏安法監(jiān)測(cè)配基交換反應(yīng)的完成。然后將紫色反應(yīng)混合物緩慢倒入100ml快速攪拌的KCl飽和的乙醇中。通過(guò)精細(xì)燒結(jié)漏斗抽濾來(lái)收集沉淀，并用乙醇簡(jiǎn)單洗滌。粗產(chǎn)物用PBS洗滌，溶解在3.0-5.0ml乙醇中并再次從KCl飽和的乙醇中沉淀。通過(guò)乙醇重結(jié)晶進(jìn)一步純化沉淀得到78％收率的純產(chǎn)物。該產(chǎn)物在PBS中在E1/2為0.63V的金電極上顯示單對(duì)可逆氧化還原波。為了保證在PIND的兩個(gè)咪唑末端的徹底的雙配基交換，需要稍過(guò)量的Ru(bpy)2(10-15％)。
用Finnigan/MAT LCQ質(zhì)譜儀(ThermoFinnigan，San Jose，CA)進(jìn)行質(zhì)譜試驗(yàn)。除非另外指出，所有譜圖在室溫下記錄。
質(zhì)子核磁共振(1H NMR)譜(300MHz CDCl3)δ8.76(4H)，7.54(2H)，7.26(2H)，4.27(4H)，4.12(4H)，2.31(4H)和1.83 9(2H)(圖1)。
使用電噴霧離子化質(zhì)譜(ESI-MS)對(duì)PIND進(jìn)行的質(zhì)譜試驗(yàn)顯示在m/z 483.3和242.3的主峰，對(duì)應(yīng)于PIND+H+，(和(PIND+2H+)/2(圖2)，其與期望化合物的分子量具有良好一致性。由于在ESI-MS譜中沒(méi)有觀察到單接枝的PIND，因此我們可以排除任何不完全接枝的PIND。
實(shí)施例2該實(shí)施例舉例說(shuō)明電活性PIND-Ru嵌入劑的形成和使用循環(huán)伏安法的其電化學(xué)性質(zhì)。
在乙二醇中回流期間，每5分鐘進(jìn)行循環(huán)伏安試驗(yàn)。圖3顯示在開始30分鐘得到的兩個(gè)典型的伏安圖。由圖3中跡線1可見，向Ru(bpy)2Cl2中添加PIND之前，獲得中心在0.40V的一對(duì)可逆伏安峰，對(duì)應(yīng)公知的Ru(bpy)2Cl2的氧化還原過(guò)程。添加PIND時(shí)，一對(duì)新的伏安峰出現(xiàn)在0.63V，顯示PIND-Ru的形成(圖3，跡線2)。兩個(gè)電子轉(zhuǎn)移過(guò)程都被清楚地分辨并且具有可逆過(guò)程的所有特征，除了稍大的峰-峰電勢(shì)分離，這主要是由于反應(yīng)介質(zhì)的較高iR降。0.63V的伏安峰強(qiáng)度隨反應(yīng)時(shí)間逐漸增加。同時(shí)，0.40V的峰逐漸變小。回流30到40分鐘后，兩個(gè)氧化還原對(duì)都達(dá)到穩(wěn)態(tài)。0.40V的小伏安峰指示過(guò)量的Ru(bpy)2Cl2。分離并純化后，如此純化的PIND-Ru的伏安試驗(yàn)僅顯示一對(duì)伏安峰，意味著純化過(guò)程是非常有效的(圖3，跡線3)。
如圖3中跡線3舉例說(shuō)明，PIND-Ru如預(yù)期準(zhǔn)確地表現(xiàn)溶液中高度可逆的氧化還原對(duì)。在0.0和+0.90V之間多次重復(fù)電勢(shì)循環(huán)后觀察到的變化很小，顯示PIND-Ru在溶液中的良好穩(wěn)定性。低掃描速率下，＜500mV/s，記錄了典型的擴(kuò)散控制的伏安圖，正如預(yù)期表現(xiàn)理想能斯特行為的單電子交換系統(tǒng)峰電流與電勢(shì)掃描速率的平方根成比例，峰-峰電勢(shì)分離非常接近于59mV的理論值并且不依賴于電勢(shì)掃描速率(圖4)。這些結(jié)果明確了所有釕氧化還原中心都允許到達(dá)電極表面并且進(jìn)行可逆的非均勻電子轉(zhuǎn)移。
實(shí)施例3該實(shí)施例舉例說(shuō)明通過(guò)PIND-Ru的UV-可見分光光度法測(cè)定的PIND-Ru和ds-DNA的相互作用。
研究了在增加量的鮭精DNA存在下，通過(guò)PIND-Ru的UV-可見分光光度法測(cè)定PIND-Ru和ds-DNA的相互作用模式(圖5A)。在Agilent 8453UV-可見分光光度計(jì)上記錄UV-可見光譜。在UV-可見光譜中，當(dāng)穿線型嵌入劑的稠環(huán)平面芳香體系自身插入到ds-DNA的堿基對(duì)之間時(shí)，嵌入結(jié)合的信號(hào)有減色效應(yīng)并紅移。如圖5A所示，以DNA堿基對(duì)/PIND-Ru比4.0向ds-DNA添加PIND-Ru導(dǎo)致366和387nm處ND吸收帶降低40％并紅移2-nm。之前觀察到具有脂肪族叔胺側(cè)鏈的萘二酰亞胺(ND)具有類似現(xiàn)象。在DNA堿基對(duì)/PIND-Ru比大于4.0時(shí)，ND吸收帶減色效應(yīng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)，并且觀察到恒定的減色效應(yīng)，顯示通過(guò)優(yōu)先嵌入ND發(fā)生PIND-Ru和ds-DNA的結(jié)合。
使用與Boger建議相似的短發(fā)夾寡核苷酸，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)估計(jì)嵌入的穩(wěn)定性。PIND-Ru的熒光變化對(duì)比等價(jià)物的分析提供了滴定曲線，從中確定化學(xué)計(jì)量為1∶1(圖5B)。發(fā)現(xiàn)通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)測(cè)定的穩(wěn)定性常數(shù)是3.0×107，對(duì)應(yīng)于與ND相比增強(qiáng)約75-倍。穩(wěn)定性常數(shù)增強(qiáng)的似乎合理的解釋將是ND基團(tuán)嵌入ds-DNA后，PIND-Ru中兩個(gè)陽(yáng)離子Ru(bpy)2Cl基團(tuán)與ds-DNA每側(cè)的磷酸形成離子對(duì)，使得ND更緊緊地固定在ds-DNA的堿基對(duì)之間。
實(shí)施例4
該實(shí)施例舉例說(shuō)明PIND-Ru在DNA生物傳感器中應(yīng)用。
之前Xie et al.，Anal.Chem.761611-1617(2004)、Xie et.al.Nucelic Acids Res.32，el5(2004)、Xie et al.Anal Chem.764023-4029(2004)和Gao et al.Synth.Met.755-10(1995)中描述了金電極的制備和預(yù)處理，所有內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。簡(jiǎn)而言之，捕獲探針(CP)吸附之前，將金電極在氧等離子體中暴露5到10分鐘，然后立即在無(wú)水乙醇中浸20分鐘以還原氧化物層。通過(guò)將金電極在100μg/ml CP的PBS溶液中浸16到24小時(shí)吸附CP單層。吸附之后，用PBS充分漂洗電極并在PBS中浸泡20分鐘，再次漂洗，并用空氣流吹干。根據(jù)steel建議的程序，使用陽(yáng)離子氧化還原探針進(jìn)行電化學(xué)評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)CP的表面密度在1.13-1.30×10-11mol/cm2之間。為了使非-DNA相關(guān)的PIND-Ru吸收最小化并提高CP單層的質(zhì)量和穩(wěn)定性，將CP-包被的金電極在2.0mg/ml 1-巰基十二烷(MD)的乙醇溶液中浸沒(méi)4到6小時(shí)。漂洗掉未反應(yīng)的MD分子，將電極在攪拌的乙醇中浸沒(méi)10分鐘來(lái)洗滌該電極，隨后用乙醇和水徹底漂洗。所述電極經(jīng)空氣干燥后備用。
分三步進(jìn)行靶DNA的雜交及其電化學(xué)檢測(cè)。首先，將2.5μl份的含有靶DNA的雜交溶液均勻鋪展在電極上，并且將該電極在水飽和環(huán)境的室中在60℃(低于鹽調(diào)節(jié)熔鏈溫度27℃的低嚴(yán)謹(jǐn)度)維持30分鐘。然后在60℃用空白雜交溶液徹底漂洗，并與5.0μl份在雜交溶液中的100μg/ml PIND-Ru在35℃下一起孵育10分鐘。PIND-Ru通過(guò)穿線型嵌入附著到雜交的靶DNA上。所述電極經(jīng)空氣冷卻并在室溫下放置10分鐘之后，用含10％乙醇的NaCl-飽和磷酸緩沖液(pH7.4)徹底漂洗。伏安法測(cè)量電催化氧化電流。低DNA濃度下，每次檢測(cè)后進(jìn)行平滑處理以消除隨機(jī)噪音和電磁干擾。
使用配備低電流模塊的CH Instruments model 660A電化學(xué)工作站(CH Instruments，Austin，TX)進(jìn)行電化學(xué)試驗(yàn)。該三電極系統(tǒng)由3.0mm-直徑的金工作電極、無(wú)滲漏-微型Ag/AgCl參比電極(CypressSystems，Lawrence，KS)和鉑絲計(jì)數(shù)電極組成。為了避免樣品小滴鋪展到3.0-mm直徑的工作區(qū)以外，將CP固定后在金電極施加圖案化的疏水膜。參照Ag/AgCl電極，記錄該工作中所有電勢(shì)。
在第一個(gè)雜交試驗(yàn)中，分別將5.0μL份在TE中的200nM聚(AT)20、聚(AG)20和聚(G)40與其對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)CP-包被電極雜交。為了對(duì)比，用5.0μL份的200nM聚(T)40處理相同組的電極。經(jīng)雜交，寡核苷酸選擇性結(jié)合到其互補(bǔ)CP上并固定在電極表面。用雜交緩沖液徹底漂洗，將所有的非雜交相關(guān)的寡核苷酸洗掉。在隨后與5.0μl份的在雜交溶液中的100μg/ml PIND-Ru一起孵育期間PIND-Ru被帶到電極表面。發(fā)現(xiàn)用含10％乙醇的NaCl-飽和磷酸緩沖液(pH7.4)進(jìn)行徹底沖洗除去大多數(shù)非-DNA相關(guān)的PIND-Ru吸收。
圖6A顯示雜交后電極的循環(huán)伏安圖。對(duì)于非互補(bǔ)的聚(T)40，雜交后在PIND-Ru氧化還原電勢(shì)(0.63V)觀察到一對(duì)小伏安峰(圖6A跡線1)，這主要是由于PIND-Ru與電極表面CP的純靜電相互作用。對(duì)于互補(bǔ)性聚(AT)20、聚(AG)20和聚(G)40，觀察到氧化還原電勢(shì)的輕微正向遷移并且峰電流大大增加100倍(圖6A跡線2、3和4)。與200nM聚(AT)20雜交后觀察到的電流0.30μA，因此來(lái)自1.3pmol活性和嵌入的PIND-Ru。該數(shù)值代表包含在測(cè)試小滴內(nèi)的＜0.50％的PIND-Ru。將1.2×10-11mol/cm2(估計(jì)值的中范圍)作為表面CP覆蓋率并且假設(shè)最大PIND-Ru/堿基比率為1/4，則1.3pmol靶DNA被雜交。因此，13％靶DNA和15％的表面結(jié)合CP被實(shí)際上雜交，這與文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)的那些相當(dāng)。有趣地是，當(dāng)聚(AG)20和聚(G)40與其對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)CP包被的電極雜交時(shí)，觀察到陽(yáng)極電流顯著增加而陰極電流稍微降低(圖6A跡線3和4)。并且隨鳥嘌呤含量增加，增加幾乎接近線性，顯示寡核苷酸中的鳥嘌呤被嵌入的PIND-Ru在0.63V催化氧化。這些結(jié)果證明PIND-Ru與ds-DNA選擇性相互作用并且PIND-Ru-ds-DNA加合物具有非常慢的解離速率以及高效電催化鳥嘌呤氧化，這為開發(fā)超敏DNA生物傳感器鋪平了道路。
接下來(lái)，以mRNA中的全長(zhǎng)腫瘤蛋白p53(TP53)基因作為我們的靶基因，評(píng)價(jià)了PIND-Ru作為電活性指示劑用于直接檢測(cè)mRNA中癌癥易感基因。雜交之前，在70℃將mRNA混合物變性10分鐘。具有與TP53互補(bǔ)序列的寡核苷酸被固定在電極表面并作為CP。經(jīng)過(guò)53℃雜交30分鐘，混合物中TP53mRNA選擇性結(jié)合到電極表面。用雜交緩沖液進(jìn)行徹底漂洗，洗掉所有非-雜交相關(guān)的mRNA。
由圖6B可見，施加PIND-Ru后電極的典型循環(huán)伏安圖，在陽(yáng)極法中觀察到相當(dāng)高的峰電流，顯示較多量的電子參與氧化過(guò)程，最可能由于捕獲的長(zhǎng)TP53mRNA分子向電極表面提供了非常大量的鳥氨酸。在接下來(lái)的電勢(shì)循環(huán)期間峰電流顯著下降，并且在0到0.90V之間5個(gè)循環(huán)后得到穩(wěn)態(tài)伏安圖(圖5B跡線2)。對(duì)慢掃描速率≤10mV/s下氧化或還原電流峰進(jìn)行積分，對(duì)于電活性Ru2+/Ru3+位點(diǎn)得到3.8pmol的表面覆蓋。PIND-Ru總量，1.9×10-11摩爾/cm2，相當(dāng)于32％的CP被雜交并完全嵌入。為了更好地理解雜交效率和PIND-Ru負(fù)載水平，對(duì)雜交后以及PIND-Ru嵌入后的TP53進(jìn)行一系列石英晶體微量天平(QCM)測(cè)量。表1總結(jié)了該結(jié)果

表1.與1.0μg mRNA中TP53雜交后、以及PIND-Ru嵌入后，CP包被的石英晶體振蕩器的QCM數(shù)據(jù)。
如表1所示，約40飛摩爾TP53被雜交。該數(shù)值代表約1.6％的表面結(jié)合的CP被實(shí)際雜交，這比文獻(xiàn)中報(bào)道的那些短寡核苷酸(20-50聚體)低得多。雜交效率隨分析基因長(zhǎng)度的增加顯著降低，這并不令人驚奇。此外，QCM試驗(yàn)顯示TP53的每11到14個(gè)堿基嵌入一個(gè)PIND-Ru，提示一些PIND-Ru分子嵌入到TP53的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，這進(jìn)一步提高該方法的靈敏度。發(fā)現(xiàn)PIND-Ru負(fù)載密度在1.5-2.2×10-11摩爾/em2范圍內(nèi)，這與在伏安試驗(yàn)中得到的具有良好一致性。
使用從TP53的mRNA轉(zhuǎn)錄的純化的cDNA，并在使用前用TE緩沖液稀釋成不同濃度，確立TP53基因定量的動(dòng)態(tài)范圍。對(duì)于對(duì)照試驗(yàn)，在電極準(zhǔn)備時(shí)使用非互補(bǔ)性CP。發(fā)現(xiàn)隨cDNA濃度從2.5到350pM，電流呈線性增加，檢測(cè)限是1.5pM，對(duì)應(yīng)0.60ng/ml?？紤]到樣品體積，使用建議的方法能成功地檢測(cè)到甚至少到7.5阿托摩爾的TP53cDNA。對(duì)比先前的直接核酸氧化分析的結(jié)果，通過(guò)使用本發(fā)明的催化性穿線型嵌入劑方案，基因組核酸分析的靈敏度大大提高。非標(biāo)記電化學(xué)方法用于直接檢測(cè)核酸的吸引力在于來(lái)自真實(shí)世界樣品的基因表現(xiàn)出高靈敏度，所述真實(shí)世界樣品包含許多氧化還原活性單元(鳥嘌呤和嵌入的PIND-Ru)。本文描述的PIND-Ru催化體系的優(yōu)點(diǎn)是鳥嘌呤和PIND-Ru都在低至0.63V的電勢(shì)被氧化，此時(shí)存在的背景電流很小。而且，具有越多鳥嘌呤的基因給出越敏感的信號(hào)。兩者的組合實(shí)現(xiàn)了皮摩爾檢測(cè)限并且動(dòng)態(tài)范圍達(dá)到350pM。由于不脫離本教導(dǎo)的范圍對(duì)上述方法和組合物可以進(jìn)行多種改變，其意思是以上描述中包含的所有材料應(yīng)解釋為舉例說(shuō)明而非限制性含義。除非明確聲明敘述已經(jīng)進(jìn)行的活動(dòng)(即使用過(guò)去時(shí)態(tài))，舉例說(shuō)明和實(shí)施例不應(yīng)理解為代表本教導(dǎo)給定的實(shí)施方案已經(jīng)或未曾實(shí)施。
本說(shuō)明書中引用的所有參考的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文。本文對(duì)參考的討論僅僅希望總結(jié)其作者所做的主張，并不是承認(rèn)任何參考構(gòu)成與專利性相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)。申請(qǐng)人保留挑戰(zhàn)所引用參考的準(zhǔn)確性和適當(dāng)性的權(quán)利。
權(quán)利要求
1.下式的化合物L(fēng)1-D-L2其中D是二價(jià)環(huán)狀基團(tuán)；和L1和L2各自獨(dú)立地是連接基團(tuán)，所述連接基團(tuán)包含具有約3到約20個(gè)非氫原子的有機(jī)胺、脂肪族氨基和含氮部分。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中所述二價(jià)環(huán)狀基團(tuán)包含可以嵌入雙鏈核酸中的部分。
3.權(quán)利要求2的化合物，其中所述部分包含1，4，5，8-萘四羧酸二酐。
4.權(quán)利要求1的化合物，其中所述含氮部分提供金屬-氮配位鍵。
5.權(quán)利要求1的化合物，其中所述有機(jī)胺是3-氨丙基咪唑。
6.包含下式的化合物
7.包含下式的核心化合物的電催化嵌入劑L1-D-L2其中D是二價(jià)環(huán)狀基團(tuán)；和L1和L2各自獨(dú)立地是連接基團(tuán)，所述連接基團(tuán)包含具有約3到約20個(gè)非氫原子的有機(jī)胺、脂肪族氨基和含氮部分，所述核心化合物鍵合到下式的過(guò)渡金屬化合物上 其中M是可以與氮形成配位鍵的金屬元素；R和R’是在其氮原子處與M配位的含氮有機(jī)部分，其中R和R’獨(dú)立地選自2，2’-聯(lián)吡啶基；用一個(gè)或多個(gè)取代基取代的2，2’-聯(lián)吡啶基，所述取代基選自C1-C4烷基、苯基和用一個(gè)或多個(gè)C1-C4烷基取代的苯基；1，10-菲咯啉基和用一個(gè)或多個(gè)取代基取代的1，10-菲咯啉基，所述取代基選自C1-C4烷基、苯基和用一個(gè)或多個(gè)C1-C4烷基取代的苯基；Z是鹵原子；m是+1、+2、+3、+4、+5或+6；和X是平衡m的陰離子或陰離子組合。
8.權(quán)利要求7的電催化嵌入劑，其中所述核心化合物通過(guò)金屬-氮配位鍵鍵合到所述過(guò)渡金屬化合物上。
9.權(quán)利要求8的電催化嵌入劑，其中M選自釕、鋨、鋅、鐵、銠、錸、鉑、鈧、鈦、釩、鎘、鎂、銅、鈷、鈀、鉻、錳、鎳、鉬、鎢、和銥、或其混合物。
10.權(quán)利要求8的電催化嵌入劑，其中M是釕。
11.權(quán)利要求7的電催化嵌入劑，其中所述有機(jī)胺包含3-氨丙基咪唑。
12.權(quán)利要求8的電催化嵌入劑，其中Z是氯或溴。
13.權(quán)利要求8的電催化嵌入劑，其中所述二價(jià)環(huán)狀基團(tuán)包含可以嵌入雙鏈核酸中的部分。
14.權(quán)利要求13的電催化嵌入劑，其中所述部分包含1，4，5，8-萘四羧酸二酐。
15.權(quán)利要求8的電催化嵌入劑，其中R和R’獨(dú)立地選自2，2’-聯(lián)吡啶基、4，4’-甲基-2，2’-聯(lián)吡啶基、4，4’-乙基-2，2’-聯(lián)吡啶基、4，4’-苯基-2，2’-聯(lián)吡啶基、5，5’-甲基-2，2’-聯(lián)吡啶基、5，5’-乙基-2，2’-聯(lián)吡啶基和5，5’-苯基-2，2’-聯(lián)吡啶基。
16.權(quán)利要求15的電催化嵌入劑，其中M選自釕、鋨、鋅、鐵、銠、錸、鉑、鈧、鈦、釩、鎘、鎂、銅、鈷、鈀、鉻、錳、鎳、鉬、鎢、和銥、或其混合物。
17.權(quán)利要求16的電催化嵌入劑，其中M是釕。
18.權(quán)利要求15的電催化嵌入劑，其中所述有機(jī)胺包含3-氨丙基咪唑。
19.權(quán)利要求15的電催化嵌入劑，其中Z是氯或溴。
20.權(quán)利要求15的電催化嵌入劑，其中所述二價(jià)環(huán)狀基團(tuán)包含可以嵌入雙鏈核酸中的部分。
21.權(quán)利要求20的電催化嵌入劑，其中所述部分包含1，4，5，8-萘四羧酸二酐。
22.權(quán)利要求7的電催化嵌入劑，其中I是1，4，5，8-萘四羧酸二酐，所述有機(jī)胺是3-氨丙基咪唑，R和R’中至少一個(gè)是2，2’-聯(lián)吡啶基，M是釕，和Z是氯。
23.包含下式的電催化嵌入劑
24.一種制備電催化嵌入劑的方法，所述方法包括使下式的核心化合物L(fēng)1-D-L2其中D是二價(jià)環(huán)狀基團(tuán)；和L1和L2各自獨(dú)立地是連接基團(tuán)，所述連接基團(tuán)包含具有約3到約20個(gè)非氫原子的有機(jī)胺、脂肪族氨基和含氮部分，與下式的過(guò)渡金屬化合物相接觸 其中M是可以與氮形成配位鍵的金屬元素；R和R’是在其氮原子上與M配位的含氮有機(jī)部分，其中R和R’獨(dú)立地選自2，2’-聯(lián)吡啶基；用一個(gè)或多個(gè)取代基取代的2，2’-聯(lián)吡啶基，所述取代基選自C1-C4烷基、苯基和用一個(gè)或多個(gè)C1-C4烷基取代的苯基；1，10-菲咯啉基和用一個(gè)或多個(gè)取代基取代的1，10-菲咯啉基，所述取代基選自C1-C4烷基、苯基和用一個(gè)或多個(gè)C1-C4烷基取代的苯基；Z是鹵原子；m是+1、+2、+3、+4、+5或+6；和X是平衡m的陰離子或陰離子組合，以在所述核心化合物和過(guò)渡金屬化合物之間形成金屬-氮配位鍵。
25.權(quán)利要求24的方法，其中M選自釕、鋨、鋅、鐵、銠、錸、鉑、鈧、鈦、釩、鎘、鎂、銅、鈷、鈀、鉻、錳、鎳、鉬、鎢、和銥、或其混合物。
26.權(quán)利要求25的方法，其中M是釕。
27.權(quán)利要求24的方法，其中所述有機(jī)胺包含3-氨丙基咪唑。
28.權(quán)利要求24的方法，其中Z是氯或溴。
29.權(quán)利要求24的方法，其中所述二價(jià)環(huán)狀基團(tuán)包含可以嵌入雙鏈核酸中的部分。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述部分包含1，4，5，8-萘四羧酸二酐。
31.權(quán)利要求24的方法，其中R和R’獨(dú)立地選自2，2’-聯(lián)吡啶基、4，4’-甲基-2，2’-聯(lián)吡啶基、4，4’-乙基-2，2’-聯(lián)吡啶基、4，4’-苯基-2，2’-聯(lián)吡啶基、5，5’-甲基-2，2’-聯(lián)吡啶基、5，5’-乙基-2，2’-聯(lián)吡啶基和5，5’-苯基-2，2’-聯(lián)吡啶基。
32.權(quán)利要求31的方法，其中M選自釕、鋨、鋅、鐵、銠、錸、鉑、鈧、鈦、釩、鎘、鎂、銅、鈷、鈀、鉻、錳、鎳、鉬、鎢、和銥、或其混合物。
33.權(quán)利要求32的方法，其中M是釕。
34.權(quán)利要求31的方法，其中所述有機(jī)胺包含3-氨丙基咪唑。
35.權(quán)利要求31的方法，其中Z是氯或溴。
36.權(quán)利要求31的方法，其中所述二價(jià)環(huán)狀基團(tuán)包含可以嵌入雙鏈核酸中的部分。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述部分包含1，4，5，8-萘四羧酸二酐。
38.權(quán)利要求24的方法，其中I是1，4，5，8-萘四羧酸二酐，所述有機(jī)胺是3-氨丙基咪唑，R和R’中至少一個(gè)是2，2’-聯(lián)吡啶基，M是釕，和Z是氯。
39.一種檢測(cè)核酸的方法，所述方法包括在水性介質(zhì)中使包含下式核心化合物的電催化嵌入劑L1-D-L2其中D是二價(jià)環(huán)狀基團(tuán)；和L1和L2各自獨(dú)立地是連接基團(tuán)，所述連接基團(tuán)包含具有約3到約20個(gè)非氫原子的有機(jī)胺、脂肪族氨基和含氮部分，所述核心化合物鍵合至下式的過(guò)渡金屬化合物 其中M是可以與氮形成配位鍵的金屬元素；R和R’是在其氮原子上與M配位的含氮有機(jī)部分，其中R和R’獨(dú)立地選自2，2’-聯(lián)吡啶基；用一個(gè)或多個(gè)取代基取代的2，2’-聯(lián)吡啶基，所述取代基選自C1-C4烷基、苯基和用一個(gè)或多個(gè)C1-C4烷基取代的苯基；1，10-菲咯啉基和用一個(gè)或多個(gè)取代基取代的1，10-菲咯啉基，所述取代基選自C1-C4烷基、苯基和用一個(gè)或多個(gè)C1-C4烷基取代的苯基；Z是鹵原子；m是+1、+2、+3、+4、+5或+6；和X是平衡m的陰離子或陰離子組合，與包含所述核酸的復(fù)合物相結(jié)合以將所述電催化嵌入劑嵌入所述復(fù)合物中；和檢測(cè)電流，其中所述電催化嵌入劑氧化核苷酸。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述核苷酸是鳥嘌呤。
41.權(quán)利要求39的方法，其中M選自釕、鋨、鋅、鐵、銠、錸、鉑、鈧、鈦、釩、鎘、鎂、銅、鈷、鈀、鉻、錳、鎳、鉬、鎢、和銥、或其混合物。
42.權(quán)利要求41的方法，其中M是釕。
43.權(quán)利要求39的方法，其中所述有機(jī)胺包含3-氨丙基咪唑。
44.權(quán)利要求39的方法，其中Z是氯或溴。
45.權(quán)利要求39的方法，其中所述二價(jià)環(huán)狀基團(tuán)包含可以嵌入雙鏈核酸中的部分。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述部分包含1，4，5，8-萘四羧酸二酐。
47.權(quán)利要求39的方法，其中所述方法還包括將探針固定在所述電極上；和提供溶液中所述核酸與電極相接觸，其中所述探針和核酸互相雜交。
48.權(quán)利要求39的方法，其中所述方法還包括將識(shí)別對(duì)的第一成員固定在所述電極上；用所述識(shí)別對(duì)的第二成員標(biāo)記探針；組合溶液中所述標(biāo)記探針與所述電極相接觸，其中所述探針和核酸雜交形成結(jié)合到電極表面的復(fù)合物。
49.權(quán)利要求39的方法，其中所述電催化嵌入劑是包含下式的化合物
全文摘要
本發(fā)明公開了電化學(xué)檢測(cè)核酸的組合物和方法。所述組合物包含與雙鏈核酸結(jié)合并氧化核酸的電催化嵌入劑。檢測(cè)樣品中核酸的方法包括形成被電催化嵌入劑結(jié)合的雙鏈核酸，其中嵌入劑在電極表面催化核酸的氧化。
文檔編號(hào)C07F15/00GK101068813SQ200580033568
公開日2007年11月7日 申請(qǐng)日期2005年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月2日
發(fā)明者謝虹, 高志強(qiáng), 謝芳 申請(qǐng)人:新加坡科技研究局