結(jié)合霍亂弧菌YbeY蛋白的核酸適配子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體設(shè)及能特異性高親和力結(jié)合霍亂弧菌孔eY蛋白 的核酸適配子，及其在霍亂弧菌檢測(cè)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】 陽(yáng)00引弧菌屬（Vibrio)中霍亂弧菌（V. cholerae)、引起一種烈性腸道傳染病，發(fā)病急、 傳染性強(qiáng)、病死率高，屬于國(guó)際檢疫傳染病?；魜y（化Olera)是由Ol群和0139群霍亂弧菌 感染引起的一種烈性腸道傳染病，是W發(fā)病急、傳播快、波及范圍廣，能引起大流行為特征 的國(guó)際檢疫傳染病之一。
[0003] 霍亂弧菌包括兩個(gè)生物型：古典生物型（Classicalbiotype)和埃爾托生物型 巧レTorbio-type霍亂弧菌）。運(yùn)兩種型別除個(gè)別生物學(xué)性狀稍有不同外，形態(tài)和免疫學(xué) 性基本相同，在臨床病理及流行病學(xué)特征上沒(méi)有本質(zhì)的差別。自1817年W來(lái)，全球共發(fā)生 了屯次世界性大流行，前六次病原是古典型霍亂弧菌，第屯次病原是埃爾托型所致。
[0004] 1992年10月在印度東南部又發(fā)現(xiàn)了一個(gè)引起霍亂流行的新血清型菌株（0139)， 它引起的霍亂在臨床表現(xiàn)及傳播方式上與古典型霍亂完全相同，但不能被Ol群霍亂弧菌 診斷血清所凝集，抗Ol群的抗血清對(duì)0139菌株無(wú)保護(hù)性免疫。在水中的存活時(shí)間較Ol群 霍亂弧菌長(zhǎng)，因而有可能成為引起世界性霍亂流行的新菌株。 陽(yáng)0化]人類在自然情況下是霍亂弧菌的唯一易感者，主要通過(guò)污染的水源或飲食物經(jīng)口 傳染。在一定條件下，霍亂弧菌進(jìn)入小腸后，依靠鞭毛的運(yùn)動(dòng)，穿過(guò)粘膜表面的粘液層，可能 藉菌毛作用粘附于腸壁上皮細(xì)胞上，在腸粘膜表面迅速繁殖，經(jīng)過(guò)短暫的潛伏期后便急驟 發(fā)病。該菌不侵入腸上皮細(xì)胞和腸腺，也不侵入血流，僅在局部繁殖和產(chǎn)生霍亂腸毒素，此 毒素作用于粘膜上皮細(xì)胞與腸腺使腸液過(guò)度分泌，從而患者出現(xiàn)上吐下瀉，瀉出物呈"米巧 水樣"并含大量弧菌，此為本病典型的特征。
[0006] 我國(guó)把霍亂列為甲類法定傳染病，是國(guó)境口岸重點(diǎn)檢疫的傳染病。因此，檢測(cè)霍亂 弧菌是本領(lǐng)域一直致力研究的對(duì)象。傳統(tǒng)的霍亂弧菌檢測(cè)方法需要先分離再培養(yǎng)，然后用 經(jīng)典的方法鑒定，耗時(shí)、不靈敏是運(yùn)些方法普遍存在的問(wèn)題。免疫學(xué)方法簡(jiǎn)單、方便、迅速、 特異性較好，但是仍有交叉反應(yīng)比較嚴(yán)重、假陽(yáng)性多、靈敏度偏低等不足之處。聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)（PCR)技術(shù)雖具有準(zhǔn)確、靈敏、快速的特點(diǎn)，但其在檢測(cè)數(shù)目較多的樣品時(shí)操作比較繁 雜，因此在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)技術(shù)的基礎(chǔ)上又衍生出很多新型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR) 技術(shù)，如多重PCR技術(shù)，然而多重PCR雖簡(jiǎn)化了PCR實(shí)驗(yàn)的操作，但是由于該技術(shù)需數(shù)對(duì)引 物同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，很容易產(chǎn)生非特異性條帶或假陽(yáng)性，影響檢測(cè)結(jié)果。而目前尚未有專口針 對(duì)霍亂腸毒素檢測(cè)的報(bào)道。
[0007] 核酸適配子（aptamer)指能與蛋白分子W高親和力結(jié)合的配基，是通過(guò)一種組 合化學(xué)技術(shù)一指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematicevolutionofligandsby exponentialenrichment,SELEX)，從人工合成的大容量的單鏈隨機(jī)寡核巧酸文庫(kù)中通過(guò) 反復(fù)與祀分子作用-篩選、富集過(guò)程，篩選出的對(duì)祀分子結(jié)合具有高特異性和高結(jié)合性的 寡核巧酸分子，又可稱為適配體。由于核酸適配子在功能上與傳統(tǒng)抗體類似，與祀物質(zhì)結(jié)合 的特異性和親和力甚至優(yōu)于抗體，加上其祀分子廣、穩(wěn)定性高、攻擊祀分子的效率高、易改 造修飾等特點(diǎn)，已成為分子識(shí)別的有力工具，可在基礎(chǔ)研究、臨床快速診斷、藥物研發(fā)等方 面得W廣泛開(kāi)發(fā)應(yīng)用。
[0008] 孔eY是許多細(xì)菌機(jī)體中存在的一種保守蛋白，孔eY蛋白質(zhì)的功能，發(fā)現(xiàn)其可W作 為一種RNA酶對(duì)RNA分子進(jìn)行特殊剪切，從而調(diào)節(jié)RNA分子的可利用性和活性；而在運(yùn)項(xiàng)研 究中研究者在霍亂弧菌中檢測(cè)了該蛋白質(zhì)的功能，研究者表示，蛋白質(zhì)YbeY對(duì)于致病菌的 細(xì)胞適應(yīng)性和應(yīng)激耐受力，W及不同類別的RNA的調(diào)節(jié)非常關(guān)鍵。就像在高等有機(jī)體中一 樣，DNA遺傳信息可W轉(zhuǎn)錄成RNA分子，其中有些RNA分子可W作為蛋白質(zhì)翻譯的模板，而 有些RNA分子則可W形成細(xì)菌的蛋白質(zhì)工廠（即核糖體），其它的RNA組分就會(huì)包含調(diào)節(jié)性 的RNAs,其可W調(diào)節(jié)細(xì)菌和宿主的細(xì)胞功能。
[0009] 研究表明孔eY蛋白對(duì)于產(chǎn)生功能性核糖體的必要組分非常關(guān)鍵，而且對(duì)于核糖 體的組裝W及質(zhì)量控制也非常重要。另外研究者還發(fā)現(xiàn)YbeY可WW致病菌毒力相關(guān)的調(diào) 節(jié)性小RNA分子為作用祀點(diǎn)進(jìn)行作用，在感染霍亂的小鼠體內(nèi)降低YbeY的水平可使得霍亂 弧菌的致病力下降；孔eY屬于一系列保守的RNA酶類，其對(duì)于許多不同類別的致病菌，包括 肺炎鏈球菌和結(jié)核分枝桿菌都很重要。研究表明可WW孔eY作為一種新型祀點(diǎn)，運(yùn)為開(kāi)發(fā) 新型抗生素研發(fā)平臺(tái)提供了新的研究思路；該蛋白質(zhì)在許多致病菌中天然存在，對(duì)該蛋白 進(jìn)行控制可W通過(guò)干擾細(xì)菌的應(yīng)激耐受力和毒力來(lái)使得病毒對(duì)藥物敏感，因此開(kāi)發(fā)W該蛋 白質(zhì)為祀點(diǎn)的抗生素將很有可能達(dá)到廣譜的抗菌作用。
[0010] 本發(fā)明W霍亂弧菌為孔eY祀蛋白，利用SELEX技術(shù)篩選獲得能與祀蛋白特異結(jié)合 的適配子，可用于檢測(cè)霍亂弧菌。由于W單鏈DNA形式存的核酸適配子可采用化學(xué)方法在 體外合成，成本低廉，性質(zhì)穩(wěn)定，與祀蛋白親和力高，可W在檢測(cè)方法中直接應(yīng)用，具有操作 簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的是提供一種DNA適配子，能夠特異性結(jié)合孔eY蛋白，可W來(lái)實(shí)現(xiàn)霍 亂弧菌的特異性檢測(cè)W及相應(yīng)的治療藥物運(yùn)送的祀向性，可用于霍亂的診斷與治療。
[0012] 本發(fā)明采用W下技術(shù)方案： 陽(yáng)01引體外合成一個(gè)含有40個(gè)隨機(jī)序列的單鏈DNA文庫(kù)，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄構(gòu)建出單鏈RNA適配子隨機(jī)文庫(kù)；采用大腸桿菌表達(dá)的方法體外表達(dá)孔eY，W其為祀蛋白，采用SELEX技 術(shù)篩選具有高親和力的表面抗原特異性RNA適配子；通過(guò)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件RNAStruc化re Program分析預(yù)測(cè)適配子的二級(jí)結(jié)構(gòu)；通過(guò)膜結(jié)合測(cè)定實(shí)驗(yàn)、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)鑒定篩選適配 子對(duì)祀蛋白的特異性和親和力，得到了一系列的與表面抗原親和力高、特異性強(qiáng)的適配子。 所述的適配子都能形成各自的特異莖環(huán)結(jié)構(gòu)。所述適配子能特異性、高親和力地結(jié)合YbeY 蛋白。所述適配子序列如下：
[0014] HLyb-003;TTCTTTATCTACCCCAACACCTTTCCACTTCCAGCCA
[0015] HLyb-003,；ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0016] TTCTTTATCTACCCCAACACCTTTCCACTTCCAGCCACACATGTGAGATTAACTGGACA
[0017] HLyb-004;ACTAGCTATCGATACTCGAAC 陽(yáng)O化]ATCTACCCCAACACCTTTCCACTTCACCCAAGAAAAA CACATGTGAGATTAACTGGACA ;
[0019] HLyb-006 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0020] AACACTCCAACTTATCCCTACAATTCTACTTTCATA CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0021] HLyb-009 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0022] ACACCTTTCCACTTCCACCAAAAGAAATTCACATCAC CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0023] HLyb-Oll ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0024] TTCCACTTCCACCAAAGAAAATTCACATCACACATCA CACATGTGAGATTAACTGGACA 陽(yáng)0巧]HLyb-013 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0026] TTCCCTACAATATCTACTGTTCATATATTCCTCACTT CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0027] HLyb-O15 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0028] ATCACACATCATCACACCACCGCCCTTCCAACTACCC CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0029] HLyb-016 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0030] ATTCCTCACTTAATCAACATTTCTTCATTGTTTCTCC CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0031] HLyb-O17 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0032] TCAAACAATTATCAGAATTTCTATAACACTTCAATTC CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0033] HLyb-O19 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC 陽(yáng)的4] ACCCCGCCTTCTCAAACAATTTCAAATTATCTATAAC CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0035] HLyb-020 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0036] CCATACACATTAACCCGACCCTTCTCAAACAATTTCA CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0037] HLyb-021 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC 陽(yáng)的8] TTATAATTTGTTCATTACCTAAATATCCAACCCATCA CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0039] HLyb-023 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0040] CACACCCACCATTGTTAACACAACCTACCTTTTTCCT CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0041] HLyb-024 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0042] TCACATTACAAAATACATTCATCCGCCAACACACCAA CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0043] HLyb-026 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0044] CCACATACCTGTTTATATCAAAATATAAAAACCCAAC CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0045] HLyb-028 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0046] CACCCTTATCTACACTAAAGAAATTTCCTCACCACCC CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0047] HLyb-030 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0048] CAATCCTCAAACTCTACCTAAGAATAACACTTACCTC CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0049] HLyb-033 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC 陽(yáng)0加]AAATAACAGAATCCTCCACACACACCCACTTATAAAA CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0051] HLyb-036 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0052] ACCGCCTACAACTACATCACACTCCTATTCCTATATC CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0053] HLyb-039 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0054] ATCGCTACCTTAATACCTATAACTTTACTCCTAAAAC CACATGTGAGATTAACTGGACA 陽(yáng)化5] HLyb-040 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC 陽(yáng)化6] CAAACAACACACACAACCACGCTCCATAACCCCACAA CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0057] HLyb-042 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0058] TACCCAAATTCTATCCAACGCTTACCTTCCAAACATC CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0059] HLyb-061 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0060] ATACCTTCCTATACCGCTTCACTCTACTTACCTCTCC CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0061] HLyb-063 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0062] CATCCCTAATAACTACTGTTA