微量核酸釋放劑提取病毒dna的使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及利用微量核酸釋放劑提取病毒核酸(DNA)的試劑及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]核酸提取是下游核酸檢測(cè)、研宄或產(chǎn)品開發(fā)的起點(diǎn)，所分離的核酸的質(zhì)量和完整性直接影響研宄或診斷結(jié)果，因此核酸抽提是分子生物學(xué)最關(guān)鍵的方法之一，通常成功的核酸分離純化需要四個(gè)重要的步驟:組織或細(xì)胞的破碎和裂解，核蛋白復(fù)合體的變性，核酸酶的滅活以及污染物的去除，理想的提取方法可以獲取高質(zhì)量的靶核酸，同時(shí)沒有蛋白、糖脂和其它核酸污染，目前已有很多專業(yè)化的核酸抽提方法可以從各種生物樣品中抽提DNA或者總核酸。
[0003]目前核酸分離技術(shù)雖然發(fā)展迅速，但是均存在一些缺點(diǎn)，例如:酚氯仿抽提法雖然核酸純度高，但是其主要成分對(duì)人體有害，且容易造成環(huán)境污染，同時(shí)提取過程需要反復(fù)抽提，多次換管，步驟繁瑣，會(huì)造成樣本的丟失與污染；堿裂解法:該法提取的核酸不容易保存；硅膠膜吸附柱法提取的核酸DNA濃度純度低操作復(fù)雜；磁珠法因提取成本較高，從而限制了廣泛應(yīng)用；本試劑用于生物樣本病毒DNA提取，樣本需求量少、操作簡便、無需繁瑣的離心、洗脫等步驟，微量核酸釋放劑在完全釋放核酸的同時(shí)，還具有封閉樣本中對(duì)PCR擴(kuò)增具有干擾作用的蛋白質(zhì)、藥物及溶血等各種因素物質(zhì)的功能，避免反復(fù)離心、洗脫開蓋所引起的污染和核酸丟失；實(shí)現(xiàn)PCR提取的“一步法”和“一室化”操作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明是提供一種微量核酸釋放劑，它采用一步法操作完成血清、血漿中DNA的快速釋放，獲得的核酸適用于熒光定量PCR等下游檢測(cè)，具有操作簡便、使用安全、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，適合在臨床基因檢測(cè)中推廣應(yīng)用。
[0005]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，試劑組分如下:微量核酸釋放劑、促釋放劑、封閉劑；微量核酸釋放劑含有5?500mM的KCl、0.5?20% Triton X-100、1?10mg/ml的蛋白酶K、I?20mM的NaOH ;促釋放劑含有pH值5?8的DMS0、終濃度0.5?10%的BSA0
[0006]在優(yōu)選的情況下，微量核酸釋放劑配制方法為:在滅菌去離子水中加入KCl終濃度為5?500mM，終濃度0.5?20% Triton X-100、終濃度I?100mg/ml的蛋白酶K、終濃度I?20mM的NaOH ;促釋放劑:在滅菌去離子水中加入終濃度10%，pH值5?8的DMS0、終濃度0.5?10%的BSA ;質(zhì)量或體積百分比以提取試劑體積為計(jì)算基準(zhǔn)；配制的試劑長期保存需-20 °C凍存。
[0007]具體的，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述方法包括如下步驟:
O取微量核酸釋放劑5 μ I加入等體積的血清或血漿樣本，用移液器吹打混勻10次；
2)每管加入30 μ I的封閉劑; 3)蓋好管蓋置于普通PCR儀中反應(yīng)，具體參數(shù)如下:第一步:95°C，10分鐘；第二步:4°C，2分鐘；
4)將經(jīng)過裂解處理的PCR反應(yīng)管從普通PCR儀中取出，小心打開管蓋，每管加入2.5 μ I促釋放劑并用移液器反復(fù)吹打混勻10次。
[0008]本發(fā)明的微量核酸釋放劑采用蛋白變性劑，能快速破壞病毒顆粒外殼蛋白結(jié)構(gòu)釋放DNA，與傳統(tǒng)的熱裂解方式結(jié)合同步進(jìn)行，更有效的保證樣本中核酸裂解效率，微量核酸釋放劑在完全釋放核酸的同時(shí)，還具有封閉樣本中對(duì)PCR擴(kuò)增具有干擾作用的蛋白質(zhì)、藥物及溶血等各種因素物質(zhì)的功能，避免檢測(cè)過程的假陰性；且微量核酸釋放劑中含有抑制核酸酶的組分，對(duì)PCR后續(xù)實(shí)驗(yàn)不會(huì)產(chǎn)生影響。
【附圖說明】
[0009]圖1為采用本發(fā)明的試劑提取的HBV血漿梯度稀釋擴(kuò)增結(jié)果。
[0010]圖2為采用本發(fā)明的試劑提取的HBV血漿精密度擴(kuò)增結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0011]參照一下實(shí)施例可以對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明；但是，以下實(shí)施例僅僅是例證，本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。
[0012]實(shí)施例1:用本發(fā)明方法對(duì)乙肝病毒核酸血漿樣本(HBV-DNA)梯度稀釋進(jìn)行提??；I)取已知濃度(2X 107IU/ml)HBV陽性樣本，用基質(zhì)血清依次十倍稀釋至200IU/ml備用；2)準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量200 μ I無核酸酶PCR反應(yīng)管，每管加入5 μ I微量核酸釋放劑，加入5 μ I待檢樣本(2X 107IU/ml?200IU/ml六個(gè)濃度)，用移液器反復(fù)吹打10次；
3)加入30μ I封閉劑；
4)蓋好管蓋置于普通PCR儀中反應(yīng)，具體參數(shù)如下:第一步:95°C，10分鐘；第二步:4°C，2分鐘；
5)將經(jīng)過裂解處理的PCR反應(yīng)管從普通PCR儀中取出，小心打開管蓋，每管加入2.5 μ I促釋放劑并用移液器反復(fù)吹打混勻10次；
6)加入HBV反應(yīng)液，設(shè)置HBV程序擴(kuò)增。
[0013]實(shí)施例2:用本發(fā)明方法對(duì)乙肝病毒核酸血漿樣本(HBV-DNA)精密度進(jìn)行提取；
O取已知濃度(2Χ 107IU/ml) HBV陽性樣本，用基質(zhì)血清依次十倍稀釋至2X 103IU/ml
備用;
2)準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量200μ I無核酸酶PCR反應(yīng)管，每管加入5 μ I微量核酸釋放劑，加入5μ I待檢HBV樣本(2X105IU/ml和2X103IU/ml兩個(gè)濃度，每個(gè)濃度樣本8個(gè)復(fù)孔)，用移液器反復(fù)吹打10次；
3)加入30μ I封閉劑；
4)蓋好管蓋置于普通PCR儀中反應(yīng)，具體參數(shù)如下:第一步:95°C，10分鐘；第二步:4°C，2分鐘；
5)將經(jīng)過裂解處理的PCR反應(yīng)管從普通PCR儀中取出，小心打開管蓋，每管加入2.5 μ I促釋放劑并用移液器反復(fù)吹打混勻10次；
6)加入HBV反應(yīng)液，設(shè)置HBV程序擴(kuò)增。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種利用微量核酸釋放劑提取血清或血漿樣本中病毒核酸(DNA)的方法。2.該試劑含有核酸釋放劑、促釋放劑、封閉劑；核酸釋放劑含有KC1、TritonX-100、蛋白酶K、NaOH ;促釋放劑含有DMSO、BSA ;封閉劑中含有等體積的石蠟油和礦物油。3.該技術(shù)采用微量核酸釋放劑(MNRR)，可在一管中進(jìn)行DNA核酸提??；取5μ I的微量核酸釋放劑加入等體積血清或血漿樣本，反復(fù)吹打混勻10次，加入30 μ I封閉劑，置于PCR儀94°C裂解10分鐘，然后迅速降至4°C，小心打開管蓋加入2.5 μ I促釋放劑并混勻，所得的混合液可直接加PCR擴(kuò)增試劑進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用微量核酸釋放劑提取生物樣本中病毒DNA的方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及利用微量核酸釋放劑提取病毒核酸（DNA）的試劑及其使用方法；微量核酸釋放劑裂解生物樣本（血清或血漿）中病毒DNA同時(shí)，佐以促釋放劑能更有效地保證裂解、釋放效率；微量核酸釋放劑在完全釋放核酸的同時(shí)，還具有封閉樣本中對(duì)PCR擴(kuò)增具有干擾作用的蛋白質(zhì)、藥物及溶血等各種因素物質(zhì)的功能，避免檢測(cè)過程的假陰性；樣本提取簡便、靈敏、快速、準(zhǔn)確，避免反復(fù)離心、洗脫開蓋所引起的污染和核酸丟失，實(shí)現(xiàn)PCR提取的“一步法”和“一室化”操作。
【IPC分類】C12N15/10
【公開號(hào)】CN104962553
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510446386
【發(fā)明人】郭冬冬, 遲磊, 呂翔, 張美娜, 楊海俠
【申請(qǐng)人】寶瑞源生物技術(shù)(北京)有限公司
【公開日】2015年10月7日
【申請(qǐng)日】2015年7月28日