一種蛋白制品中的核酸去除方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種蛋白制品中的核酸去除方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 采用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的蛋白藥品需要嚴(yán)格控制殘留的宿主核酸類物質(zhì)（DNA) 含量，特別是抗體類蛋白藥物臨床應(yīng)用劑量大，因此核酸類物質(zhì)含量需要控制在很低的限 度內(nèi)。
[0003] 目前通用子交換層析法可以去除大量的核酸類物質(zhì)，但處理后成品的核酸殘留量 往往大于lpg/mg蛋白，有時(shí)甚至高達(dá)數(shù)十皮克/毫克蛋白，難以滿足抗體類藥物的需要。
[0004] 需要提供一種新的核酸去除方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的核酸去除方法以及該方法制備得到的 蛋白制品。
[0006] 本發(fā)明蛋白制品的核酸去除方法，它是采用膜層析方法去除核酸，具體步驟如 下：
[0007] a、用平衡液平衡膜層析柱；
[0008] b、取待處理樣品，調(diào)節(jié)pH以及電導(dǎo)率與平衡液一致；
[0009] c、上樣，收集280nm紫外吸收峰處的流出液；
[0010] d、用平衡液沖洗，收集280nm紫外吸收峰處的流出液；
[0011] e、合并步驟c和步驟d的流出液，即可。
[0012] 步驟a中，所述膜層析柱的填料為Mustang Q膜層析填料。
[0013] 步驟b中，調(diào)節(jié)pH以及電導(dǎo)率的方法是：采用超濾的方法，將待處理樣品的緩沖體 系交換為平衡液。
[0014] 步驟a和步驟d中，所述平衡液是含有NaCl的檸檬酸鹽緩沖液，其pH為6~8,電 導(dǎo)率為7. 8~25. 5mS/cm，NaCl濃度為50~150mmol/L，梓檬酸鹽濃度5~30mmol/L。優(yōu) 選地，所述檸檬酸鹽是檸檬酸鈉。
[0015] 本發(fā)明還提供了前述任意一項(xiàng)方法制備得到的蛋白制品。優(yōu)選地，所述蛋白制品 的核酸含量低于〇. lpg/mg蛋白。優(yōu)選地，所述蛋白制品是單克隆抗體。
[0016] 本發(fā)明方法可以有效去除核酸，蛋白回收率高，處理方法簡單，工藝穩(wěn)定性好，采 用本發(fā)明方法處理后的蛋白制品的核酸含量小于〇. lpg/mg蛋白，安全性好，臨床應(yīng)用前景 良好。
[0017] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0018] 以下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 實(shí)施例1本發(fā)明核酸去除方法
[0020] 1、試驗(yàn)材料
[0021] 抗體蛋白樣品的獲得：
[0022] 步驟1、一種可表達(dá)抗⑶20單克隆抗體的CHO細(xì)胞的制備：
[0023] 制備表達(dá)抗⑶20單克隆抗體的CHO細(xì)胞：采用PCR技術(shù)和DNA重組技術(shù)將 pSV2-dhfr載體（ATCC產(chǎn)品）中的dhfr (二氫葉酸還原酶）表達(dá)單元克隆到pCDNA3. 1 (+) 載體（Invitrogen公司產(chǎn)品）中，構(gòu)建可表達(dá)DHFR的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pBR)l。
[0024]根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道（US Patent, US6399061)，采用化學(xué)合成技術(shù)合成重組抗CD20單克 隆抗體的輕鏈和重鏈基因片段；采用DNA重組技術(shù)將合成的基因片段分別克隆到pBFOl載 體中，分別構(gòu)建可表達(dá)抗⑶20單克隆抗體的輕鏈和重鏈多肽的重組表達(dá)載體pBR)l-⑶20L 和 PBF01-CD20H。
[0025] 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將構(gòu)建的重組表達(dá)載體pBR)l-CD20L和pBR)l-CD20H共轉(zhuǎn)染 Invitrogen公司的CH0-DG44細(xì)胞，然后經(jīng)G418抗性篩選陽性克隆，然后再通過ELISA法篩 選高表達(dá)抗體的克隆，然后再用MTX(甲氨蝶呤）逐步加壓、篩選、克隆，最終獲得一株高表 達(dá)抗CD20單克隆抗體的CH0細(xì)胞株CH0-CD20。
[0026] 步驟2、細(xì)胞培養(yǎng)
[0027] 采用批次流加培養(yǎng)，得到細(xì)胞培養(yǎng)液。
[0028] 步驟3、細(xì)胞培養(yǎng)上清的分離
[0029] 采用深層過濾的方法獲得細(xì)胞培養(yǎng)上清：采用Millipore公司的D0HC和B1HC深 層濾器按順序過濾步驟2中的細(xì)胞培養(yǎng)液，收集濾過液。
[0030] 步驟4、Protein A親和層析
[0031] 層析填料：采用GE公司的MabselectSuRe層析填料（一種耐堿的Protein A填 料）。
[0032]層析流速：50~300cm/h。
[0033] 填料清洗：用清洗液0? lmol/L NaOH+1. 0m〇l/L NaCl清洗層析柱。
[0034] 平衡：用平衡液20mmol/L PB (磷酸緩沖液）+50mmol/L NaCl、pH7. 2平衡層析柱。
[0035] 20mmol/L PB :是指緩沖液中，磷酸根的濃度為20mmol/L。
[0036] 上樣：步驟3收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清調(diào)節(jié)pH7. 2后上樣；上完樣后用平衡液沖洗層 析柱直至流出液280nm紫外吸收回到基線。
[0037] 中間沖洗：采用緩沖液20mmol/L PB、lmol/L NaCl、pH7. 2沖洗層析柱，直至流出液 280nm紫外吸收回到基線。然后用平衡液沖洗層析柱1.5CV(柱床體積）以上。
[0038] 洗脫和收集：采用洗脫液20mmol/L梓檬酸鈉+50mmol/L NaCl、pH3. 5進(jìn)行抗體蛋 白洗脫，收集280nm紫外吸收峰；抗體蛋白收集后用TRIS調(diào)節(jié)pH至7. 2。
[0039] 2、本發(fā)明核酸去除方法 [0040] (1)膜層析去除核酸類物質(zhì)
[0041] 膜層析填料：采用Pall公司的Mustang Q膜層析填料
[0042] 層析流速：lOCV/min (注：CV為膜層析填料體積）
[0043] 填料清洗：用清洗液0? 5mol/L NaOH+O. 5mol/L NaCl清洗膜層析填料。
[0044] 填料再生：用再生液25mmol/L檸檬酸鈉+0. 5mol/L NaCl、pH6. 5沖洗層析柱，至流 出液pH為中性（pH6~9)
[0045] 平衡：用平衡液25mmol/L梓檬酸鈉+50mmol/L NaCl、pH6. 5平衡層析柱。
[0046] 上樣：采用超濾的方法，將抗CD20的抗體蛋白樣品緩沖體系交換為25mmol/L檸檬 酸鈉+50mmol/L NaCl、pH6. 5,然后上樣（平衡液的電導(dǎo)率是8.8mS/cm);上完樣后用平衡液 沖洗膜層析柱直至流出液280nm紫外吸收回到基線。
[0047] 樣品收集：上樣和沖洗過程中收集流出液的280nm紫外吸收峰。
[0048] 3、檢測分析
[0049] 采用熒光定量PCR法進(jìn)行檢測。
[0050] (1)按照 PrepSEQ ?殘留 DNA 樣品制備試劑盒（invitrogen, Life Technologies 公司）的說明書定量回收樣品中殘留的DNA;
[0051] (2)根據(jù) resDNASEQ ?定量 CHO DNA 試劑盒（invitrogen, Life Technologies 公 司）說明書，用熒光定量PCR儀（7500Real Time PCR, AB Applied Biosystem公司）對DNA 含量進(jìn)行檢測。其中PCR的反應(yīng)條件是：第一階段：酶激活95°C，lOmin ;第二階段：變性 95°C，15s ;退火/延伸60°C，lmin，共40個(gè)循環(huán)。
[0052] 4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0053] 采用本發(fā)明方法處理前，樣品中DNA含量為2. 5pg/mg蛋白；采用本發(fā)明方法處理 后，樣品中DNA含量小于0. lpg/mg蛋白。
[0054] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，本發(fā)明方法可以有效去除樣品中的核酸。
[0055] 實(shí)施例2本發(fā)明核酸去除方法
[0056] 1、試驗(yàn)材料
[0057] 同實(shí)施例1。
[0058] 2、本發(fā)明核酸去除方法
[0059] 除了平衡液分別變更為下表1中的平衡液，其余條件同實(shí)施例1。
[0060] 表1平衡液的改變
[0061]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種蛋白制品的核酸去除方法，其特征在于：它是采用膜層析方法去除核酸，具體 步驟如下： a、 用平衡液平衡膜層析柱； b、 取待處理樣品，調(diào)節(jié)pH以及電導(dǎo)率與平衡液一致； c、 上樣，收集280nm紫外吸收峰處的流出液； d、 用平衡液沖洗，收集280nm紫外吸收峰處的流出液； e、 合并步驟c和步驟d的流出液，即可。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟a中，所述膜層析柱的填料為 MustangQ膜層析填料。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟b中，調(diào)節(jié)pH以及電導(dǎo)率的方法是： 采用超濾的方法，將待處理樣品的緩沖體系交換為平衡液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于：步驟a、b或d中，所述平衡液是含 有NaCl的檸檬酸鹽緩沖液，其pH為6~8,電導(dǎo)率為7. 8~25. 5mS/cm，NaCl濃度為50~ 150mmol/L，梓檬酸鹽濃度5~30mmol/L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：所述檸檬酸鹽是檸檬酸鈉。
6. 權(quán)利要求1~5任意一項(xiàng)方法制備得到的蛋白制品。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的蛋白制品，其特征在于：所述蛋白制品的核酸含量低于 0?lpg/mg蛋白。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的蛋白制品，其特征在于：所述蛋白制品是單克隆抗體。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種蛋白制品的核酸去除方法，它是采用膜層析方法去除核酸，具體步驟如下：a、用平衡液平衡膜層析柱；b、取待處理樣品，調(diào)節(jié)pH以及電導(dǎo)率與平衡液一致；c、上樣，收集280nm紫外吸收峰處的流出液；d、用平衡液沖洗，收集280nm紫外吸收峰處的流出液；e、合并步驟c和步驟d的流出液，即可。本發(fā)明方法可以有效去除核酸，蛋白回收率高，處理方法簡單，工藝穩(wěn)定性好，采用本發(fā)明方法處理后的蛋白制品的核酸含量小于0.1pg/mg蛋白，安全性好，臨床應(yīng)用前景良好。
【IPC分類】C07K16-00, C07K1-36, C07K1-34, C07K1-16
【公開號(hào)】CN104693303
【申請?zhí)枴緾N201510091558
【發(fā)明人】羅天學(xué), 榮艷珍, 羅培文
【申請人】蘇州金盟生物技術(shù)有限公司
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年2月28日