專(zhuān)利名稱(chēng)：前列腺素還原酶的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2005年3月22日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/664,473的優(yōu)先權(quán)，而No.60/664,473要求2004年6月10日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/651,469的優(yōu)先權(quán)。上述兩個(gè)臨時(shí)申請(qǐng)以其全部在此并入作為參考。
背景技術(shù)：
過(guò)氧化物酶體增殖因子活化的受體(Peroxisome proliferator-activatedreceptor，PPAR)屬于調(diào)節(jié)脂質(zhì)和葡萄糖代謝的核受體家族。已經(jīng)鑒定了三種哺乳動(dòng)物的PPAR，即PPAR-α、PPAR-γ和PPAR-δ。當(dāng)被膳食中的脂肪酸或其代謝衍生物激活后，PPAR觸發(fā)一連串的轉(zhuǎn)錄事件，導(dǎo)致脂質(zhì)和葡萄糖的代謝改變。例如，被激活后，PPAR-γ，其在脂肪組織中高表達(dá)，促進(jìn)葡萄糖攝取并降低血糖水平。
除了其在脂質(zhì)和葡萄糖代謝中的作用，PPAR也是一些疾病的有前途的治療靶位，這些疾病例如為II型糖尿病、肥胖癥、血脂異常、冠心病、炎癥性疾病和癌癥。一種合成的PPAR-γ激動(dòng)劑AVANDIA已經(jīng)用于治療II型糖尿病。另一種合成的PPAR-α激動(dòng)劑Fibrates已經(jīng)用于治療血脂異常。見(jiàn)Lehmann等，J Biol Chem，(1995)27012953-12956；Fruchart等，Curr.Opin.Lipdol.(1999)10245-257。不過(guò)，大多數(shù)PPAR治療劑的功效很有限且具有明顯的不良反應(yīng)。
因此需要開(kāi)發(fā)更加有效的用于通過(guò)調(diào)節(jié)PPAR活性而調(diào)控脂質(zhì)和葡萄糖代謝的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及用于通過(guò)調(diào)節(jié)對(duì)象的PPAR活性而治療PPAR相關(guān)性疾病的方法。
在一方面，本發(fā)明公開(kāi)了一種分離的多肽，所述多肽還原15-酮前列腺素而不還原白三烯B4。前列腺素(PG)是一類(lèi)生理學(xué)介質(zhì)，其特征為具有中心環(huán)和不同不飽和程度的側(cè)鏈。15-酮前列腺素的實(shí)例包括但不限于15-酮PGE2、15-酮PGE1、15-酮PGF2α和15-酮PGF1α。白三烯是另一類(lèi)生理學(xué)介質(zhì)，其與前列腺素的部分不同之處在于不具有中心環(huán)。
在另一方面，本發(fā)明公開(kāi)了一種特異性地結(jié)合到上述多肽上的抗體。該抗體，或是多克隆抗體或是單克隆抗體，可以結(jié)合到該多肽的一個(gè)片段上。
在另一方面，本發(fā)明公開(kāi)了一種雙鏈核糖核酸(dsRNA)，以及編碼它的DNA載體，以抑制具有15-酮前列腺素-Δ13-還原酶活性的多肽的表達(dá)。15-酮前列腺素-Δ13-還原酶是指一種通過(guò)還原前列腺素的Δ13雙鍵來(lái)催化15-酮前列腺素轉(zhuǎn)化為13，14-二氫-15-酮前列腺素的酶。15-酮前列腺素-Δ13-還原酶的例子包括15-酮前列腺素-Δ13-還原酶/白三烯B4 12-羥基脫氫酶(PGR/LTB4DH)和鋅結(jié)合醇脫氫酶1(PGR2/ZADH1)。dsRNA包含兩條多聚核糖核苷酸鏈。第一鏈等同于編碼15-酮前列腺素-Δ13-還原酶的核酸的19至49個(gè)連續(xù)的核苷酸。第二鏈與第一鏈互補(bǔ)。優(yōu)選地，至少該dsRNA的一端具有一1至4個(gè)核苷酸的突出端。15-酮前列腺素-Δ13-還原酶可以是PGR/LTB4DH或PGR2/ZADH1。
本發(fā)明還公開(kāi)了一種治療PPAR相關(guān)性疾病的方法，這些疾病例如為II型糖尿病、肥胖癥、血脂異常、冠心病、炎癥性疾病和癌癥。該方法包括給對(duì)象施用有效量的15-酮前列腺素-Δ13-還原酶調(diào)節(jié)物。15-酮前列腺素-Δ13-還原酶調(diào)節(jié)物是指影響15-酮前列腺素-Δ13-還原酶的活性或表達(dá)的一種分子或者一種分子復(fù)合體。調(diào)節(jié)物可以是15-酮前列腺素。它也可以是一種抑制15-酮前列腺素-Δ13-還原酶的活性或表達(dá)的抑制劑，例如，上述dsRNA。
在以下說(shuō)明書(shū)中記載了本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式的詳細(xì)描述。本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)根據(jù)說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)的內(nèi)容將是顯而易見(jiàn)的。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)了15-酮前列腺素-Δ13-還原酶家族的一個(gè)成員，15-酮前列腺素-Δ13-還原酶2(PGR-2)。本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，PPAR活性可以通過(guò)其底物和抑制劑來(lái)控制。這些底物和抑制劑對(duì)于治療PPAR相關(guān)性疾病是有用的，這些疾病例如為II型糖尿病、肥胖癥、血脂異常、冠心病、炎癥性疾病和癌癥。
預(yù)期屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的是一種如SEQ ID NO1所示的分離的多肽或其功能性等價(jià)物，該多肽還原15-酮前列腺素但不還原白三烯B4。如下所示是其氨基酸序列(SEQ ID NO1)及其編碼核苷酸序列(即SEQ IDNO2)。
1 - ATGATCATACAAAGAGTGGTATTGAATTCCCGACCTGGGAAAAATGGAAATCCAGTCGCA -60- M I I Q R V V L N S R P G K N G N P V A61 - GAGAACTTCAGGGTGGAAGAGTTCAGTTTACCGGATGCTCTCAATGAAGGTCAAGTTCAA -120- E N F R V E E F S L P D A L N E G Q V Q121 - GTGAGGACTCTTTATCTCTCGGTGGATCCTTACATGCGCTGTAAGATGAACGAGGACACT -180- V R T L Y L S V D P Y M R C K M N E D T181 - GGCACTGACTACTTGGCACCGTGGCAGCTGGCGCAGGTGGCTGATGGTGGAGGAATTGGA -240- G T D Y L A P W Q L A Q V A D G G G I G241 - GTTGTAGAGGAGAGCAAGCACCAGAAGTTGACTAAAGGCGATTTTGTGACTTCGTTTTAC -300- V V E E S K H Q K L T K G D F V T SF Y301 - TGGCCCTGGCAAACTAAGGCAATTCTAGATGGGAATGGCCTTGAAAAGGTAGACCCACAA -360- W P W Q T K A I L D G N G L E K V D P Q361 - CTTGTAGATGGACACCTTTCATATTTTCTTGGGGCTATAGGTATGCCTGGCTTGACTTCC -420
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15-酮前列腺素-Δ13-還原酶活性是指將15-酮前列腺素經(jīng)酶促轉(zhuǎn)化為13，14-二氫-15-酮前列腺素。該特異性活性如下測(cè)定在37℃條件下，于含有0.1M Tris-HCl(pH 7.4)、0.5mM NADPH和0.57mM 15-酮PGE2的反應(yīng)緩沖液中對(duì)10μg待分析蛋白質(zhì)制備物進(jìn)行孵育。該反應(yīng)在黑暗中于37℃進(jìn)行10分鐘，并通過(guò)添加700μl含有50mM，pH3.0的鄰苯二甲酸氫鉀和1％Tween 20的緩沖液來(lái)終止反應(yīng)。以200μl含有790μM氯化吲哚硝基四氮唑(indonitrotetrazolium chloride)、60μM吩嗪硫酸甲酯和1％Tween 20的顯色劑氧化任何未反應(yīng)的NADPH。在490nm處的吸光度用ELISA分析儀進(jìn)行測(cè)量。用含有NADPH的連續(xù)稀釋量的反應(yīng)緩沖液產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。至少90nmole/min/mg蛋白的特異性活性表明該多肽具有15-酮前列腺素-Δ13-還原酶活性。
上述核苷酸序列，即SEQ ID NO2，能被用于表達(dá)本發(fā)明的多肽。核苷酸序列是指DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)、RNA分子(例如mRNA)或者DNA或RNA類(lèi)似物。DNA或RNA類(lèi)似物可以自核苷類(lèi)似物合成。該核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，但優(yōu)選為雙鏈的。為了表達(dá)蛋白，可以將該核酸可操作地連接到適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列上以制得表達(dá)載體。載體是指一核酸分子，它能轉(zhuǎn)運(yùn)已被連接于其上的另一核酸。載體能夠自我復(fù)制或被整合到宿主DNA中。載體的例子包括質(zhì)粒、粘粒或病毒載體。該載體可以包括以適于宿主細(xì)胞中的核酸表達(dá)的形式存在的核苷酸序列。優(yōu)選地，載體包括一個(gè)或多個(gè)被可操作地連接到待表達(dá)的核酸序列上的調(diào)控序列?！罢{(diào)控序列”包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、和其它表達(dá)控制元件(例如多聚腺苷酸化信號(hào))。調(diào)控序列包括那些負(fù)責(zé)核苷酸序列的組成性表達(dá)的序列，以及組織特異性調(diào)控和/或誘導(dǎo)序列。該表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可依賴(lài)于待轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的選擇、所期望蛋白質(zhì)的表達(dá)水平等這樣的因素。該表達(dá)載體能被導(dǎo)入宿主細(xì)胞以生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。同樣，含有上述核酸的宿主細(xì)胞也落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。例子包括有E.coli細(xì)胞、Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞(例如，利用桿狀病毒表達(dá)載體)、酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。參見(jiàn)，例如，Goeddel，(1990)Gene ExpressionTechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA。為制備本發(fā)明的多肽，可以在允許由本發(fā)明的核酸編碼的多肽表達(dá)的條件下，于培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞，并純化獲自培養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)基的多肽?；蛘撸摵塑账嵝蛄锌梢栽隗w外被轉(zhuǎn)錄和翻譯，例如，使用T7啟動(dòng)子調(diào)控序列和T7聚合酶。
上面所描述的多肽能被用于在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗體。能夠理解抗體也能自該多肽的片段產(chǎn)生。在動(dòng)物體中制備單克隆和多克隆抗體及其片段的方法在本領(lǐng)域中是已知的。參見(jiàn)，例如，Harlow和Lane，(1988)AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork。術(shù)語(yǔ)“抗體”包括完整的分子及其片段，這些片段有例如Fab、F(ab′)2、Fv、scFv(單鏈抗體)和dAb(結(jié)構(gòu)域抗體；Ward等，(1989)Nature，341，544)。
一般地，本發(fā)明的多肽可以與載體蛋白例如KLH偶聯(lián)，可以與佐劑混合并可注射入宿主動(dòng)物體內(nèi)。然后在該動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生的抗體可以通過(guò)肽親和層析法純化。通常使用的宿主動(dòng)物包括兔、小鼠、豚鼠和大鼠?？捎糜谠黾用庖叻磻?yīng)的各種佐劑取決于宿主的物種，所述佐劑包括弗氏佐劑(完全和不完全)、礦物凝膠如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、復(fù)合多元醇、聚陰離子、肽、油化乳化液、鑰孔血藍(lán)蛋白(keyholelimpet hemocyanin)和二硝基酚。有用的人類(lèi)佐劑包括BCG(卡介苗)和小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。
多克隆抗體即抗體分子的異質(zhì)性群體存在于免疫對(duì)象的血清中。單克隆抗體，抗本發(fā)明多肽的抗體的均質(zhì)性群體，可以使用標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤技術(shù)制備(參見(jiàn)例如Kohler等，(1975)Nature 256，495；Kohler等，(1976)Eur J Immunol 6，511；Kohler等，(1976)Eur J Immunol 6，292；以及Hammerling等，(1981)Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.)。具體地，利用通過(guò)連續(xù)的細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)抗體分子的任何技術(shù)可以獲得單克隆抗體，如Kohler等，(1975)Nature 256，495和美國(guó)專(zhuān)利No.4,376,110；人類(lèi)B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等，(1983)Immunol Today 4，72)；Cole等，(1983)Proc.Natl.Acad Sci.USA 80，2026；和EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等，(1983)Monoclonal Antibodies andCancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，第77-96頁(yè))所述的技術(shù)。這些抗體可以是包括IgG，IgM，IgE，IgA，IgD的免疫球蛋白類(lèi)及其任何亞類(lèi)。產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤可以在體外和在體內(nèi)培養(yǎng)。體內(nèi)生產(chǎn)高滴度單克隆抗體的能力使其成為特別有用的生產(chǎn)方法。
另外，可以使用用于生產(chǎn)“嵌合抗體”的技術(shù)。參見(jiàn)例如Morrison等，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，6851；Neuberger等，(1984)Nature 312，604；以及Takeda等，(1984)Nature 314452。嵌合抗體是一種該分子中的不同部分來(lái)源于不同動(dòng)物種的分子，例如具有來(lái)源于鼠單克隆抗體的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的分子?；蛘撸梢圆捎蒙a(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專(zhuān)利No.4,946,778和4,704,692)來(lái)生產(chǎn)單鏈Fv抗體的噬菌體文庫(kù)。通過(guò)經(jīng)氨基酸橋?qū)v區(qū)的重鏈片段和輕鏈片段連接形成單鏈抗體。此外，可以通過(guò)已知的技術(shù)產(chǎn)生抗體片段。例如，這些片段包括但不限于F(ab′)2和Fab片段，F(xiàn)(ab′)2片段可通過(guò)抗體分子的胃蛋白酶消化來(lái)生產(chǎn)，F(xiàn)ab片段可以通過(guò)還原F(ab′)2片段的二硫鍵產(chǎn)生。通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法還可以將抗體人源化。例如，具有所需結(jié)合特異性的單克隆抗體可以通過(guò)商業(yè)途徑人源化(Scotgene，Scotland；和OxfordMolecular，Palo Alto，Calif.)。完全人抗體如在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中表達(dá)的抗體也是本發(fā)明的特征(參見(jiàn)，例如Green等(1994)Nature Genetics 7，13；以及美國(guó)專(zhuān)利No.5,545,806和5,569,825)。
雙鏈核糖核酸(dsRNA)也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這種dsRNA可用于抑制15-酮前列腺素-Δ13-還原酶的表達(dá)。因此通過(guò)給對(duì)象施用dsRNA可治療PPAR相關(guān)性疾病。術(shù)語(yǔ)“dsRNA”指通過(guò)靶RNA序列的降解沉默基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸，這一過(guò)程被稱(chēng)作RNA干擾(RNAi)。RNAi已用于在多種動(dòng)物模型中(包括秀麗線(xiàn)蟲(chóng)，斑馬魚(yú)和鼠胚胎)以及在其它生物系統(tǒng)中(包括外植的雞神經(jīng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng))沉默基因表達(dá)。參見(jiàn)WO99/32619，WO00/44914，WO00/44914，WO00/44895，WO00/63364和WO01/36646A1。
本發(fā)明的RNA可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的技術(shù)合成。參見(jiàn)，例如Caruthers等，1992，Methods in Enzymology 211，3-19，Wincott等，1995，Nucleic Acids Res.23，2677-2684，Wincott等，1997，Methods Mol.Bio.74，59，Brennan等，1998，Biotechnol Bioeng.，61，33-45，以及Brennan，美國(guó)專(zhuān)利No.6,001,311。RNA也能從表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄和使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離。使用同樣是本領(lǐng)域熟知的方法可以將本發(fā)明的RNA或載體輸送到靶細(xì)胞。參見(jiàn)，例如Akhtar等，1992，Trends Cell Bio.2，139。例如，可以使用脂質(zhì)體、水凝膠、環(huán)糊精、可生物降解的納米囊或生物粘著微球?qū)⑵湟爰?xì)胞?；蛘撸ㄟ^(guò)直接注射或使用輸注泵可以局部輸送RNA或載體。其它的方法包括各種轉(zhuǎn)運(yùn)和載體系統(tǒng)的使用，例如使用綴合物和可生物降解的聚合物。
可通過(guò)調(diào)節(jié)15-酮前列腺素-Δ13-還原酶的活性或表達(dá)來(lái)治療PPAR相關(guān)性疾病。術(shù)語(yǔ)“治療”指將上述15-酮前列腺素-Δ13-還原酶調(diào)節(jié)物的一種或幾種，即15-酮前列腺素-Δ13-還原酶底物和抑制劑，施用給患有PPAR相關(guān)性疾病、此類(lèi)疾病的癥狀或具有患這種疾病的傾向的對(duì)象，其目的是產(chǎn)生一種治療效果例如治愈、緩解、改變、影響、好轉(zhuǎn)或預(yù)防PPAR相關(guān)性疾病、它的癥狀或?qū)λ囊谆夹??！坝行Я俊敝笇?duì)治療對(duì)象產(chǎn)生一種治療效果所需的量。15-酮前列腺素-Δ13-還原酶的底物包括15-酮PGE2、15-酮PGE1、15-酮PGF2α、15-酮PGF1α及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物。
PPAR相關(guān)性疾病(失調(diào)或病況)的例子包括，但不限于II型糖尿病、高血糖、糖耐量降低、X綜合癥、胰島素抵抗、肥胖癥、血脂異常、高脂血癥、高血糖、高甘油三脂血癥、高膽固醇血癥、低HDL水平、高LDL水平、動(dòng)脈粥樣硬化(及其引起的病癥如心絞痛、跛行、心臟病發(fā)作或中風(fēng))、血管狹窄、腸激惹綜合癥、炎癥性疾病(例如炎癥性腸病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克隆氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、骨關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、哮喘、脈管炎、缺血/再灌注損傷、凍傷或成人呼吸窘迫綜合癥)、胰腺炎、神經(jīng)變性性疾病、視網(wǎng)膜病、致瘤性病變、癌癥(例如前列腺、胃、乳房、膀胱、肺或結(jié)腸的癌癥或脂肪細(xì)胞癌如脂肪肉瘤)、血管發(fā)生、阿耳茨海默病、皮膚疾患(例如痤瘡、牛皮癬、濕疹或角化癥)、高血壓、卵巢雄激素過(guò)多癥、骨質(zhì)疏松癥以及骨質(zhì)減少。
為治療PPAR相關(guān)性疾病，可以將含有15-酮前列腺素-Δ13-還原酶調(diào)節(jié)物和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物施用給需要的對(duì)象?？梢钥诜蜢o脈輸注，或皮下、肌內(nèi)、鞘內(nèi)、腹膜內(nèi)、直腸內(nèi)、陰道內(nèi)、鼻內(nèi)、胃內(nèi)、氣管內(nèi)和肺內(nèi)注射或植入。
藥物組合物可以是無(wú)毒的可接受的稀釋劑或溶劑的溶液或懸浮液，例如1，3-丁二醇溶液。可以使用的可接受的載體和溶劑為甘露醇、水、林格氏液和等張氯化鈉溶液。另外，可以將不揮發(fā)性油類(lèi)常規(guī)用作溶劑或懸浮介質(zhì)(如甘油單酯或甘油二酯)。脂肪酸如油酸及其甘油酯衍生物在制備血管注射劑是有用的，如天然藥學(xué)上可接受的油例如橄欖油或蓖麻油，尤其是它們的聚氧乙烯化形式。這些油溶液或懸浮液也可含長(zhǎng)鏈醇稀釋劑或分散劑、羧甲基纖維素或類(lèi)似的分散溶劑。根據(jù)配方的目的，也可使用其它通常使用的表面活性劑例如Tweens或Spans或通常用于藥學(xué)可接受的固體、液體的制備的其它類(lèi)似的乳化劑或生物利用度增強(qiáng)劑，或其它劑型。
所需的劑量取決于給藥途徑的選擇；配方的性質(zhì)；對(duì)象疾病的性質(zhì)；對(duì)象的大小、體重、表面積、年齡和性別；施用的其它藥物；以及主治醫(yī)師的判斷。合適的劑量可以是0.01-100.0mg/kg范圍內(nèi)。鑒于可獲得多種組合物以及多種給藥途徑的不同效能，可以預(yù)期所需的劑量有一個(gè)寬的變異。使用本領(lǐng)域熟知的對(duì)優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)驗(yàn)常規(guī)可以調(diào)整這些劑量水平的變異。組合物包囊化在合適的輸送載體中(例如聚合微?；蚩芍踩胙b置)可以增加輸送的效率，尤其是對(duì)于口服輸送。
利用常規(guī)的方法可以將上述藥物組合物配制成用于不同給藥途徑的劑型。例如，可以配制成口服給藥的膠囊、凝膠密封劑或片劑。膠囊可含有任何標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)可接受材料如明膠或纖維素。按照常規(guī)的程序通過(guò)壓縮所述組合物與固體載體和潤(rùn)滑劑組成的混合物而配制片劑。固體載體的例子包括淀粉和糖膨潤(rùn)土。組合物還可以以含有粘合劑如乳糖或甘露醇、常規(guī)填充劑和壓片劑的硬殼片劑或膠囊形式給藥。藥物組合物還可以通過(guò)胃腸外途徑給藥。胃腸外劑型的例子包括活性藥物或其它熟知的藥學(xué)可接受的賦形劑的水溶液，等張鹽水或5％葡萄糖。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的環(huán)糊精或其它增溶劑可用作治療藥物輸送的藥學(xué)賦形劑。
可以在體外和體內(nèi)評(píng)價(jià)如上所述的藥物組合物的效能。簡(jiǎn)單地說(shuō)，可以測(cè)試本發(fā)明藥物組合物體外抑制15-酮前列腺素-Δ13-還原酶的活性或表達(dá)的能力。對(duì)于體內(nèi)研究，可以將藥物組合物注射進(jìn)動(dòng)物(例如，小鼠模型)體內(nèi)然后評(píng)價(jià)其治療效果。根據(jù)這些結(jié)果，可以確定合適的劑量范圍和給藥途徑。
下面具體的實(shí)施例應(yīng)該理解為僅僅是例證本發(fā)明，而不是以任何形式限制本發(fā)明的其它部分。不需要進(jìn)一步詳細(xì)描述，相信本領(lǐng)域普通技術(shù)人員基于本文的描述，可以最大限定的利用本發(fā)明。本文所引用的全部出版物以其全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考。
實(shí)施例鑒定新的15-酮前列腺素-Δ13-還原酶為鑒定脂肪生成過(guò)程中上調(diào)的基因，使用小鼠3T3-L1細(xì)胞進(jìn)行mRNA差異展示分析。為誘導(dǎo)脂肪生成，用1μM地塞米松處理3T3-L1細(xì)胞并在37℃生長(zhǎng)10天。分離了一個(gè)199個(gè)核苷酸的片段并發(fā)現(xiàn)其在誘導(dǎo)后第10天收獲的3T3-L1細(xì)胞中高表達(dá)。確定這個(gè)片段的序列與兩個(gè)GenBank的序列，即AK021033和AK020666的片段相同。
相應(yīng)于該基因編碼區(qū)的全長(zhǎng)cDNA序列被稱(chēng)為小鼠PGR-2。這個(gè)序列如下分離克隆自3T3-L1脂肪細(xì)胞。PCR擴(kuò)增PGR-2cDNA并通過(guò)T4DNA連接酶(Promega)連接入pGEM-T Easy Vector(Promega)。擴(kuò)增PGR-2cDNA的正向和反向引物序列分別是5’-CGG TAT AGC TTGGGA CGC TA-3’(SEQ ID NO3)和5’-TGC ATG TTA AGA ATC TTTGTG G-3’(SEQ ID NO4)。然后所得構(gòu)建體(pTE-PGR-2)通過(guò)T7和SP6聚合酶測(cè)序。然后將PGR-2開(kāi)放讀框的編碼區(qū)亞克隆入表達(dá)載體pCMV-Tag2B(Stratagene)中。為構(gòu)建pFLAG-PGR-2，進(jìn)行PCR反應(yīng)，使用pTE-PGR-2作為模板，以及兩個(gè)寡核苷酸作為引物，產(chǎn)生PGR-2的HindIII-SalI片段，所述引物為5’-AAC TGA AGC TTC AAG TGATGA TCA TA-3’(SEQ ID NO5)和5’-AGC TCT CCC ATA TGG TCGACC T-3’(SEQ ID NO6)。然后將如此獲得的PCR產(chǎn)物導(dǎo)入pCMV-Tag2B的HindIII-SalI位點(diǎn)，產(chǎn)生pFLAG/PGR-2的融合構(gòu)建體。最后，通過(guò)將pFLAG/PGR-2的HindIII-XhoI片段連接到用SmaI和XhoI(Pharmacia)限制消化的pGEX-4T-3載體制備pGEX-PGR-2構(gòu)建體。
小鼠PGR-2的推導(dǎo)氨基酸序列，即SEQ ID NO1如上所示。發(fā)現(xiàn)小鼠PGR-2與如下兩個(gè)蛋白質(zhì)同源(1)人ZADH1(GenBank登錄號(hào)NM152444)，具有～92％同源性，及(2)PGR/LTB4DH或PGR-1，具有～54％同源性。
在3T3-L1細(xì)胞的脂肪生成過(guò)程中PGR-2表達(dá)增加。在誘導(dǎo)脂肪產(chǎn)生后的第6天觀(guān)測(cè)到最大表達(dá)。在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，觀(guān)測(cè)到脂滴廣泛積聚在脂肪細(xì)胞中。確定了PGR-2的組織分布。其在脂肪組織中高度表達(dá)。與野生型小鼠相比，在純合和雜合db/db小鼠中，PGR-2mRNA在網(wǎng)膜脂肪中的量明顯較高。
按照標(biāo)準(zhǔn)方法，將小鼠PGR-2在大腸桿菌中作為GST融合蛋白重組表達(dá)。如此獲得的重組PGR-2蛋白用于確定底物特異性和酶動(dòng)力學(xué)。
如下確定酶活性將10μg重組小鼠PGR-2蛋白在37℃在含有0.1M Tris-HCl(pH7.4)，0.5mM NADPH，及0.57mM 15-酮PGE2的反應(yīng)緩沖液中溫育。在37℃避光進(jìn)行反應(yīng)10分鐘，加入700μl含有50mM鄰苯二甲酸氫鉀，pH3.0和1％Tween 20的緩沖液終止反應(yīng)。加入200μl含有790μM氯化吲哚硝基四氮唑，60μM吩嗪硫酸甲酯(phenazenemethosulfate)及1％Tween 20的顯色劑以氧化任何未反應(yīng)的NADPH。用ELISA平板讀數(shù)器在490nm測(cè)定吸光度。使用含有系列稀釋的NADPH的反應(yīng)緩沖液生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
使用如上述方法確定PGR-2的底物特異性，不同之處在于將15-酮PGE2用6個(gè)前列腺素底物的每一個(gè)、3個(gè)下游代謝物的每一個(gè)、或者白細(xì)胞三烯B4替代。15-酮PGE1、15-酮PGF1α和15-酮PGF2α與PGR-2特異反應(yīng)。相反，6-酮PGF1α、PGF2α、11b-PGF2α、13，14-二氫-15-酮PGF2α、13，14-二氫-15-酮PGD2、13，14-二氫-15-酮PGE2和白細(xì)胞三烯B4沒(méi)有檢測(cè)到特異活性。
動(dòng)力學(xué)研究表明PGR-2催化15-酮PGE2轉(zhuǎn)化為13，14-二氫-15-酮PGE2最有效，然后是15-酮PGF1α、15-酮PGE1和15-酮PGF2α。不同于PGR/LTB4DH，PGR-2使用NADPH作為輔因子比NADH更有效。
在3T3-L1的脂肪生成過(guò)程中PGR-2的蛋白表達(dá)水平上調(diào)。在完全分化的脂肪細(xì)胞中檢測(cè)到最大的PGR-2蛋白水平。在脂肪生成的較早期階段顯著誘導(dǎo)了PPAR-γ。低PGR-2表達(dá)定位在前脂肪細(xì)胞的核中。高PGR-2表達(dá)分布在分化的脂肪細(xì)胞的胞質(zhì)中。
還研究了在人Hep3B細(xì)胞中PGR-2表達(dá)對(duì)調(diào)節(jié)PPAR-γ轉(zhuǎn)錄的作用，Hep3B細(xì)胞表達(dá)內(nèi)源性人PPAR-α及-γ。發(fā)現(xiàn)在Hep3B細(xì)胞中PGR-2的過(guò)表達(dá)抑制PPAR-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活。即使Hep3B細(xì)胞被PPAR-γ激活劑(即BRL49653)刺激，轉(zhuǎn)錄激活也被抑制。在3T3-L1細(xì)胞中獲得了相似的結(jié)果。
前列腺素研究了脂肪細(xì)胞中前列腺素對(duì)PPAR-γ活性的影響。用誘導(dǎo)細(xì)胞分化的培養(yǎng)基處理后，在脂肪生成過(guò)程中，自第2-4天，3T3-L1細(xì)胞用14μM15-酮PGE2、13，14-二氫-15-酮PGE2、15-酮PGF2α、13，14-二氫-15-酮PGF2α、或4.5μM的BRL49653，即一種PPAR-γ激動(dòng)劑，進(jìn)行處理。見(jiàn)Forman等，Cell(1995)83803-812。在第6天，積聚的脂滴用油紅O染色觀(guān)察。15-酮PGE2以與BRL49653相似的水平有效增強(qiáng)了脂肪生成。被誘導(dǎo)分化2天后，3T3-L1細(xì)胞用報(bào)道基因轉(zhuǎn)染。15-酮PGE2和15-酮PGF2α都顯著增強(qiáng)了內(nèi)源性PPAR活性。相反，相應(yīng)的下游代謝物，即13，14-二氫-15-酮PGE2和13，14-二氫-15-酮PGF2α，不能增強(qiáng)PPAR活性。
將螢光素酶報(bào)道基因連同與酵母GAL4 DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合的PPAR-α、PPAR-γ或PPAR-S的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域一起轉(zhuǎn)染入3T3-L1細(xì)胞。15-酮PGE2和15-酮PGF2α激活了PPAR-γ，而PPAR-α程度較低。
還檢測(cè)了15-酮PGE2誘導(dǎo)脂肪生成特異性的PPAR-γ靶基因，即IRS-1和-2的蛋白表達(dá)的能力。當(dāng)用胰島素和地塞米松處理時(shí)，3T3-L1細(xì)胞中檢測(cè)到大量的PPAR-γ1和PPAR-γ2蛋白，而單獨(dú)用甲基異丁基黃嘌呤(methylisobutylxanthine，MIX)處理則沒(méi)有。加入15-酮PGE2和MIX及胰島素和地塞米松顯著增強(qiáng)了PPAR-γ1和PPAR-γ2的表達(dá)。15-酮PGE2和BRL49653即使在沒(méi)有MIX時(shí)也強(qiáng)力誘導(dǎo)了脂肪細(xì)胞特異標(biāo)記aP2的表達(dá)。存在胰島素和地塞米松時(shí)，BRL49653處理顯著增加了IRS-2表達(dá)。15-酮PGE2以與MIX相似的水平增強(qiáng)表達(dá)。胰島素/地塞米松或MIX誘導(dǎo)IRS-1表達(dá)。PPAR-γ配體，包括15-酮PGE2和BRL49653，不增加IRS-1蛋白的量。
15-酮前列腺素-Δ13-還原酶抑制劑RNA干擾(RNAi)方法用于沉默PGR-2表達(dá)。兩個(gè)小干擾RNA(siRNA)雙鏈體，即gaguucaguuuaccggaug(SEQ ID NO7)和guucaagugaggacucuuu(SEQ ID NO8)，先退火，然后通過(guò)使用Oligofectamine(Invitrogen)的轉(zhuǎn)染方法導(dǎo)入3T3-L1成纖維細(xì)胞或分化的前脂肪細(xì)胞。siRNA雙鏈體的轉(zhuǎn)染降低了PGR-2表達(dá)。另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，siRNA雙鏈體的轉(zhuǎn)染增加了PPAR-γ轉(zhuǎn)錄激活。因此，人們可以通過(guò)RNA干擾沉默PGR-2表達(dá)而調(diào)節(jié)PPAR-γ活性。
其它實(shí)施方案本說(shuō)明書(shū)中的所有揭示的特征可以任何方式組合。本說(shuō)明書(shū)中揭示的每個(gè)特征可以由相同、等價(jià)或相似的其它特征替代。因此，除非特別指出，每個(gè)揭示的特征只是一類(lèi)等價(jià)或相似特征的例子而已。
根據(jù)上述說(shuō)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地知道本發(fā)明的必要特征，并且在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以根據(jù)用途和條件對(duì)本發(fā)明進(jìn)行變化和修改。因此，其它實(shí)施方案也包括在權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種分離的多肽，其包含SEQ ID NO1的序列或其功能性等價(jià)物，其中所述多肽還原15-酮前列腺素但不還原白三烯B4。
2.權(quán)利要求1的分離的多肽，其包含與SEQ ID NO1具有至少90％相同性的序列。
3.權(quán)利要求2的分離的多肽，其包含與SEQ ID NO1具有至少80％相同性的序列。
4.權(quán)利要求1的分離的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO1。
5.權(quán)利要求4的分離的多肽，其中15-酮前列腺素是15-酮PGE2、15-酮PGE1、15-酮PGF2α或15-酮PGF1α。
6.權(quán)利要求5的分離的多肽，其中15-酮前列腺素是15-酮PGE2。
7.權(quán)利要求1的分離的多肽，其中15-酮前列腺素是15-酮PGE2、15-酮PGE1、15-酮PGF2α或15-酮PGF1α。
8.權(quán)利要求7的分離的多肽，其中15-酮前列腺素是15-酮PGE2。
9.權(quán)利要求2的分離的多肽，其中15-酮前列腺素是15-酮PGE2、15-酮PGE1、15-酮PGF2α或15-酮PGF1α。
10.權(quán)利要求9的分離的多肽，其中15-酮前列腺素是15-酮PGE2。
11.權(quán)利要求3的分離的多肽，其中15-酮前列腺素是15-酮PGE2、15-酮PGE1、15-酮PGF2α或15-酮PGF1α。
12.權(quán)利要求11的分離的多肽，其中15-酮前列腺素是15-酮PGE2。
13.一種抗體，所述抗體特異性結(jié)合權(quán)利要求1的多肽。
14.權(quán)利要求13的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
15.權(quán)利要求13的抗體，其中所述多肽是SEQ ID NO1。
16.權(quán)利要求15的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
17.一種用于抑制15-酮前列腺素-Δ13-還原酶的表達(dá)的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其包含一第一鏈多聚核糖核苷酸和一第二鏈多聚核糖核苷酸，其中第一鏈等同于編碼15-酮前列腺素-Δ13-還原酶的核酸的19到49個(gè)連續(xù)的核苷酸，而第二鏈與第一鏈互補(bǔ)。
18.權(quán)利要求17的dsRNA，其中15-酮前列腺素-Δ13-還原酶是PGR/LTB4DH。
19.權(quán)利要求17的dsRNA，其中15-酮前列腺素-Δ13-還原酶是PGR2/ZADH1。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種分離的多肽，其含有SEQ IDNO1的序列或SEQ ID NO1的功能性等價(jià)物，其中所述多肽還原15－酮前列腺素而不還原白三烯B4。本發(fā)明還公開(kāi)了特異性結(jié)合所述多肽的抗體以及一種用于抑制15－酮前列腺素－Δ
文檔編號(hào)C07K16/40GK1837360SQ200510099218
公開(kāi)日2006年9月27日 申請(qǐng)日期2005年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月22日
發(fā)明者莊立民, 常旭芬, 周文嶺 申請(qǐng)人:莊立民