專利名稱：用于防止線粒體通透性改變的方法
本申請(qǐng)要求于2003年2月4日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60/444,777號(hào)和于2004年1月8日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60/535,690號(hào)的優(yōu)先權(quán)。將美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60/444,777號(hào)和第60/535,690號(hào)的內(nèi)容以引用的方式結(jié)合于本文中，作為參考。
本發(fā)明是在由國(guó)家藥物濫用研究所提供的批準(zhǔn)號(hào)為PO1DA08924-08的政府資助下完成的。在本發(fā)明中美國(guó)政府擁有一定的權(quán)利。
背景技術(shù)：
線粒體幾乎存在于所有的真核細(xì)胞中，并且通過氧化磷酸化作用產(chǎn)生三磷酸腺苷(ATP)，因而對(duì)于細(xì)胞生存是必需的。阻斷這一重要的功能可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
線粒體還通過積聚鈣(Ca2+)而在細(xì)胞內(nèi)的鈣調(diào)節(jié)方面扮演重要的角色。通過膜電位驅(qū)動(dòng)的單向轉(zhuǎn)運(yùn)體在線粒體基質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生鈣的積聚。
鈣的攝入激活了線粒體脫氫酶，而這在維持能量生成和氧化磷酸化方面可能是重要的。另外，線粒體可以作為過量胞漿Ca2+的儲(chǔ)槽，從而保護(hù)細(xì)胞免受Ca2+過載和壞死。
局部缺血或低血糖癥可以導(dǎo)致線粒體功能失常，包括ATP水解和Ca2+過載。該功能失常引起線粒體通透性改變(線粒體滲透性轉(zhuǎn)變，MPT)。MPT的特征有氧化磷酸化解偶聯(lián)，線粒體膜電位喪失，內(nèi)膜通透性增加以及腫脹。
另外，線粒體膜間間隙是凋亡基因蛋白(apoptogenic proteins)的儲(chǔ)庫(kù)。因此，線粒體電位的喪失和MPT可以導(dǎo)致將凋亡基因蛋白釋放到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。越來越多的證據(jù)表明MPT與壞死性和細(xì)胞凋亡性細(xì)胞死亡有關(guān)(Crompton，Biochem J.341233-249，1999)，這并不令人奇怪。細(xì)胞的輕微損傷可能導(dǎo)致凋亡而不是壞死。
環(huán)胞菌素可以抑制MPT。由環(huán)胞菌素A所致的MPT阻斷可以抑制多種細(xì)胞類型的凋亡，包括經(jīng)歷局部缺血，缺氧，Ca2+過載和氧化應(yīng)激的細(xì)胞(Kroemer et a1.，Annu Rev Physiol.60619-642，1998)。
然而，環(huán)胞菌素A作為抗壞死性和凋亡性細(xì)胞死亡的治療藥物不是最好的。例如，環(huán)胞菌素A不能特異性地靶向線粒體。另外，它很難被遞送到腦部。而且，由于它的免疫抑制活性減少了環(huán)胞菌素A的應(yīng)用范圍。
四肽[Dmt1]DALDA(2’，6’-二甲基酪氨酸-D-精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-NH2；SS-02)分子量為640，并且在生理pH下帶有3個(gè)凈正電荷。[Dmt1]DALDA以非能量依賴的方式很容易穿過許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型的質(zhì)膜(Zhao et a1.，J Pharmacol Exp.Ther.304425-432，2003)并且穿過血腦屏障(Zhao et al.，J Pharmacol Exp.Ther.302188-196，2002)。盡管[Dmt1]DALDA已經(jīng)顯示出是一種潛在的μ-阿片樣物質(zhì)(μ-類鴉片，opioid)受體激動(dòng)劑，但它的應(yīng)用還沒有擴(kuò)展到包括抑制MPT的方面。
因此，在如局部缺血-再灌注、缺氧癥、低血糖癥以及由于線粒體膜通透性改變(線粒體滲透性轉(zhuǎn)變)所導(dǎo)致的病理改變的其它的疾病和病癥的情況下，需要抑制MPT。這樣的疾病和病癥包括多種常見的神經(jīng)退行性疾病或病癥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種用于在有需要的任何哺乳動(dòng)物中減少經(jīng)歷線粒體通透性改變(MPT)的線粒體數(shù)量或防止線粒體通透性改變的方法，這些目的和其它目的可以通過本發(fā)明來實(shí)現(xiàn)。該方法包括給予該哺乳動(dòng)物有效量的具有以下特征的芳香族陽(yáng)離子肽(a)至少一個(gè)凈正電荷；(b)最少3個(gè)氨基酸；(c)最多約20個(gè)氨基酸；(d)凈正電荷的最小數(shù)目(pm)和氨基酸殘基的總數(shù)(r)之間的關(guān)系為其中3pm是小于或等于r+1的最大數(shù)；以及(e)芳香基的最小數(shù)目(a)和凈正電荷的總數(shù)(pt)之間的關(guān)系為其中2a是小于或等于pt+1的最大數(shù)，除非當(dāng)a是1時(shí)，pt也可以是1。
在另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種在哺乳動(dòng)物的離體器官中減少經(jīng)歷線粒體通透性改變(MPT)的線粒體數(shù)量或防止線粒體通透性改變的方法。該方法包括給予該離體器官有效量的具有以下特征的芳香族陽(yáng)離子肽(a)至少一個(gè)凈正電荷；(b)最少3個(gè)氨基酸；
(c)最多約20個(gè)氨基酸；(d)凈正電荷最小數(shù)目(pm)和氨基酸殘基總數(shù)(r)之間的關(guān)系為其中3pm是小于或等于r+1的最大數(shù)；以及(e)芳香基的最小數(shù)目(a)和凈正電荷的總數(shù)(pt)之間的關(guān)系為其中，2a是小于或等于pt+1的最大數(shù)，除非當(dāng)a是1時(shí)，pt也可以是1。
在又一具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種在有需要的哺乳動(dòng)物中減少經(jīng)歷線粒體通透性改變(MPT)的線粒體數(shù)量或防止線粒體通透性改變的方法。該方法包括給予該哺乳動(dòng)物有效量的具有以下特征的芳香族陽(yáng)離子肽(a)至少一個(gè)凈正電荷；(b)最少3個(gè)氨基酸；(c)最多約20個(gè)氨基酸；(d)凈正電荷的最小數(shù)目(pm)和氨基酸殘基的總數(shù)(r)之間的關(guān)系為其中3pm是小于或等于r+1的最大數(shù)；以及(e)芳香基的最小數(shù)目(a)和凈正電荷的總數(shù)(pt)之間的關(guān)系為其中3a是小于或等于pt+1的最大數(shù)，除非當(dāng)a是1時(shí)，pt也可以是1。
在更進(jìn)一步的具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種在哺乳動(dòng)物的離體器官中減少經(jīng)歷線粒體通透性改變(MPT)的線粒體數(shù)量或防止線粒體通透性改變的方法。該方法包括給予該離體器官有效量的具有以下特征的芳香族陽(yáng)離子肽
(a)至少一個(gè)凈正電荷；(b)最少3個(gè)氨基酸；(c)最多約20個(gè)氨基酸；(d)凈正電荷的最小數(shù)目(pm)和氨基酸殘基的總數(shù)(r)之間的關(guān)系為其中3pm是小于或等于r+1的最大數(shù)；以及(e)芳香基的最小數(shù)目(a)和凈正電荷的總數(shù)(pt)之間的關(guān)系為其中，3a是小于或等于pt+1的最大數(shù)，除非當(dāng)a是1時(shí)，pt也可以是1。


圖1線粒體中[Dmt1]DALDA(SS-02)的細(xì)胞內(nèi)化和聚集。(A)用熒光分光光度計(jì)測(cè)量SS-19的線粒體攝入(ex/em＝320/420)。加入經(jīng)分離的小鼠肝臟線粒體(0.35mg/ml)導(dǎo)致SS-19熒光強(qiáng)度快速淬滅(灰線)。用FCCP(1.5μM)預(yù)處理的線粒體減少淬滅＜20％(黑線)。(B)經(jīng)分離的線粒體用[3H]SS-02于37℃孵育(溫育)2分鐘。于4℃離心(16000×g)5分鐘中止攝入，測(cè)定沉淀中的放射性。用FCCP預(yù)處理的線粒體抑制[3H]SS-02攝入～20％。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示；n＝3，*，采用Student’s t-檢驗(yàn)的P＜0.05。(C)由丙甲甘肽誘導(dǎo)的線粒體腫脹使經(jīng)分離的線粒體攝入的TMRM丟失，而攝入的SS-19則保持在高濃度。黑線為TMRM；紅線為SS-19。(D)如通過TMRM熒光測(cè)定的，在經(jīng)分離的線粒體中加入SS-02(200μM)不改變線粒體電位。加入FCCP(1.5μM)引起快速去極化，而Ca2+(150μM)導(dǎo)致去極化和MPT漸進(jìn)開始。
圖2.[Dmt1]DALDA(SS-02)保護(hù)線粒體免受Ca2+過載和3-硝基丙酸(3NP)誘導(dǎo)的線粒體通透性改變(MPT)。(A)經(jīng)分離的線粒體用10μM的SS-02預(yù)處理(用下箭頭表示加入)阻止了由Ca2+過載誘導(dǎo)的MPT的發(fā)生(上箭頭)。黑線為緩沖液；紅線為SS-02。(B)經(jīng)分離的線粒體用SS-02預(yù)處理增加了在MPT發(fā)生前成倍加入Ca2+的線粒體耐受性。箭頭指示加入緩沖液或SS-02。線1為緩沖液；線2為50μM的SS-02；線3為100μM的SS-02。(C)SS-02劑量依賴性地延緩由1mM 3NP誘導(dǎo)的MPT的發(fā)生。箭頭表示加入緩沖液或SS-02。線1為緩沖液，線2為0.5μM的SS-02；線3為5μM的SS-02；線4為50μM的SS-02。
圖3.[Dmt1]DALDA(SS-02)抑制線粒體腫脹和細(xì)胞色素C釋放。(A)將經(jīng)分離的線粒體用SS-02預(yù)處理，其劑量依賴性地抑制了由200μM的Ca2+以劑量依賴方式誘導(dǎo)的線粒體腫脹。通過在540nm處的吸光度來測(cè)量腫脹。(B)SS-02抑制經(jīng)分離的線粒體中由Ca2+誘導(dǎo)的細(xì)胞色素C的釋放。細(xì)胞色素C的釋放量用線粒體中總細(xì)胞色素C的百分?jǐn)?shù)表示。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，n＝3。(C)SS-02也能抑制由MPP+(300μM)誘導(dǎo)的線粒體腫脹。
圖4.D-精氨酸-Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2(SS-31)抑制線粒體腫脹和細(xì)胞色素C釋放。(A)經(jīng)分離的線粒體用SS-31(10μM)預(yù)處理阻止了由Ca2+誘導(dǎo)的MPT的發(fā)生?；揖€為緩沖液；紅線為SS-31。(B)線粒體用SS-31(50μM)預(yù)處理抑制了由200mM的Ca2+誘導(dǎo)的線粒體腫脹。通過測(cè)量在570nm處的光散射來測(cè)量腫脹。(C)SS-02和SS-31與環(huán)胞菌素(CsA)在抑制由Ca2+誘導(dǎo)的線粒體腫脹和細(xì)胞色素C釋放的比較。細(xì)胞色素C釋放量用線粒體中總細(xì)胞色素C的百分?jǐn)?shù)表示。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，n＝3。
圖5.[Dmt1]DALDA(SS-02)和D-精氨酸-Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2(SS-31)在經(jīng)灌注的離體豚鼠心臟的局部缺血-再灌注過程中保護(hù)心肌收縮力。心臟用緩沖液或含有SS-02(100nM)或SS-31(1nM)的緩沖液灌注30分鐘，然后經(jīng)受30分鐘的全心(global)缺血。用同樣的灌注溶液進(jìn)行再灌注。發(fā)現(xiàn)在3個(gè)治療組中存在顯著的差異(雙因素方差分析，P＜0.001)。
圖6.向心臟停搏液中加入[Dmt1]DALDA顯著增強(qiáng)了經(jīng)灌注的離體豚鼠心臟在延長(zhǎng)的缺血之后的收縮功能。穩(wěn)定30分鐘后，心臟用St.Thomas心臟停搏液(CPS)或含有100nM的[Dmt1]DALDA的CPS灌注3分鐘。通過完全阻斷冠狀動(dòng)脈灌注90分鐘來引發(fā)全心失血。隨后用氧化的Krebs-Henseleit溶液進(jìn)行60分鐘再灌注。在接受[Dmt1]DALDA的組中缺血后收縮力被顯著提高(P＜0.001)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明是基于發(fā)明人的驚人發(fā)現(xiàn)某些芳香族陽(yáng)離子肽顯著地減少了經(jīng)歷線粒體通透性改變(MPT)的線粒體數(shù)量，甚至完全阻止了MPT。減少經(jīng)歷MPT的線粒體數(shù)量以及阻止MPT是很重要的，因?yàn)镸PT與哺乳動(dòng)物中多種常見的疾病和病癥相關(guān)。另外，哺乳動(dòng)物的離體器官容易發(fā)生MPT。這些疾病和病癥具有特殊的臨床意義，因?yàn)樵谏哪承╇A段它們影響很大比例的人群。
肽本發(fā)明中有用的芳香族陽(yáng)離子肽是水溶性和高極性的。盡管有這些性質(zhì)，但這些肽能夠很容易穿過細(xì)胞膜。
本發(fā)明中有用的芳香族陽(yáng)離子肽包括最少3個(gè)通過肽鍵共價(jià)連接的氨基酸，并且優(yōu)選包括最少4個(gè)通過肽鍵共價(jià)連接的氨基酸。
本發(fā)明的芳香族陽(yáng)離子肽中的氨基酸最大數(shù)目為通過肽鍵共價(jià)連接的約20個(gè)氨基酸。優(yōu)選的氨基酸的最大數(shù)目為約12個(gè)，更優(yōu)選為約9個(gè)，并且最優(yōu)選為約6個(gè)。最佳的狀況是，存在于該肽中的氨基酸數(shù)目為4。
本發(fā)明中有用的芳香族陽(yáng)離子肽中的氨基酸可以是任何氨基酸。術(shù)語“氨基酸”在本文中是指含有至少一個(gè)氨基和至少一個(gè)羧基的任何有機(jī)分子。優(yōu)選地，至少一個(gè)氨基位于相對(duì)于羧基的α位。
這些氨基酸可以是天然存在的。天然存在的氨基酸包括，例如在哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)中自然發(fā)現(xiàn)的20種最常見的左旋(L)氨基酸，即丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、異亮氨酸(Ileu)、亮氨酸(Leu)、賴氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和纈氨酸(Val)。
其它天然存在的氨基酸包括例如在與蛋白質(zhì)合成無關(guān)的代謝過程中合成的氨基酸。例如，在產(chǎn)生尿的過程中哺乳動(dòng)物代謝合成的鳥氨酸和瓜氨酸這些氨基酸。
本發(fā)明中可用的肽可以含有一個(gè)或多個(gè)非天然存在的氨基酸。這些非天然存在的氨基酸可以是左旋(L)、右旋(D)或它們的混合物。最佳的狀況是該肽不含有天然存在的氨基酸。
非天然存在的氨基酸是那些通常不是在生物體正常代謝過程中合成，并且不是在蛋白質(zhì)中天然存在的氨基酸。另外，本發(fā)明中優(yōu)選的可用的非天然存在的氨基酸也不被普通的蛋白酶識(shí)別。
非天然存在的氨基酸可以出現(xiàn)在該肽的任何位置。例如，該非天然存在的氨基酸可以位于N-末端，C-末端或在N-末端和C-末端之間的任何位置。
例如，該非天然存在的氨基酸可以包括烷基、芳基或烷芳基這些基團(tuán)。烷基氨基酸的一些例子包括α-氨基丁酸、β-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、δ-氨基戊酸和ε-氨基己酸。芳基氨基酸的一些例子包括鄰、間和對(duì)氨基苯甲酸。烷芳基氨基酸的一些例子包括鄰、間和對(duì)氨基苯乙酸，和γ-苯基-β-氨基丁酸。
非天然存在的氨基酸也包括天然存在的氨基酸的衍生物。天然存在的氨基酸的衍生物可以包括如向天然存在的氨基酸上添加一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)。
例如，一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)可以被添加到苯丙氨酸或酪氨酸殘基的芳香環(huán)的2’、3’、4’、5’或6’位中的一個(gè)或多個(gè)位置上，或色氨酸殘基的苯并環(huán)的4’、5’、6’或7’位中的一個(gè)或多個(gè)位置上。該基團(tuán)是可以添加到芳香環(huán)上的任何化學(xué)基團(tuán)。這些基團(tuán)的一些例子包括支鏈或直鏈的C1-C4烷基，如甲基、乙基、正丙基、異丙基、丁基、異丁基或叔丁基，C1-C4烴氧基(即烷氧基)，氨基，C1-C4烷基胺和C1-C4二烷基胺(例如甲胺、二甲胺)，硝基，羥基，鹵素(即氟基、氯基、溴基或碘基)。天然存在的氨基酸的非天然存在的衍生物的一些特殊例子包括正纈氨酸(Nva)，正亮氨酸(Nle)和羥脯氨酸(Hyp)。
本發(fā)明的方法中在有用肽中的氨基酸修飾的另一個(gè)例子是該肽的天冬氨酸或谷氨酸殘基的羧基衍生化。衍生化的一個(gè)例子是用氨或用如甲胺、乙胺、二甲胺或二乙胺這些伯胺或仲胺酰胺化。衍生化的另一個(gè)例子包括用如甲醇或乙醇酯化。
另外一種這樣的修飾包括賴氨酸、精氨酸或組氨酸殘基的氨基衍生化。例如，這些氨基可以被?；?。一些合適的?；?，例如包括任何上述C1-C4烷基的苯甲酰基或烷?；缫阴；虮；?br> 優(yōu)選的是非天然存在的氨基酸對(duì)普通蛋白酶是穩(wěn)定的，更優(yōu)選的是對(duì)其不敏感。對(duì)蛋白酶穩(wěn)定或不敏感的非天然存在的氨基酸的例子包括任何上述天然存在的L-氨基酸的右旋(D-)型，以及L-和/或D-型非天然存在的氨基酸。D-氨基酸不是正常存在于蛋白質(zhì)中的，盡管在某些抗菌肽中發(fā)現(xiàn)過它們，但它們是通過除細(xì)胞正常的核糖體蛋白合成器以外的工具合成的。本文中所使用的這些D-氨基酸可以認(rèn)為是非天然存在的氨基酸。
為了使對(duì)蛋白酶的敏感性降到最低，本發(fā)明的方法中有用的肽應(yīng)該具有少于5個(gè)，優(yōu)選少于4個(gè)，更優(yōu)選少于3個(gè)，且最優(yōu)選少于2個(gè)毗鄰的可以被普通蛋白酶識(shí)別的L-氨基酸，無論這些氨基酸是否是天然存在的或非天然存在的。最佳的情況是，該肽僅含有D-氨基酸，而不含有L-氨基酸。
如果該肽含有蛋白酶敏感的氨基酸序列，則至少這些氨基酸中的一個(gè)優(yōu)選為非天然存在的D-氨基酸(右旋精氨酸)，從而提供蛋白酶抗性。蛋白酶敏感序列的例子包括容易被普通蛋白酶如肽鏈內(nèi)切酶和胰蛋白酶切開的兩個(gè)或多個(gè)毗鄰的堿性氨基酸。堿性氨基酸的例子包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。
在生理pH下該芳香族陽(yáng)離子肽具有相對(duì)于該肽中氨基酸殘基總數(shù)的最小數(shù)目的凈正電荷是很重要的。生理pH下凈正電荷的最小數(shù)目下文中表示為(pm)。該肽中氨基酸殘基總數(shù)下文中表示為(r)。
下文討論的凈正電荷的最小數(shù)目都是在生理pH條件下。術(shù)語“生理pH”在本文中是指哺乳動(dòng)物身體的組織和器官細(xì)胞中的正常pH。例如人的生理pH通常約為7.4，但是哺乳動(dòng)物中正常的生理pH可以是從約7.0到約7.8之間的任意pH。
“凈電荷”本文中是指由存在于該肽中的氨基酸所攜帶的正電荷數(shù)和負(fù)電荷數(shù)的差值。在本說明書中，應(yīng)當(dāng)理解為凈電荷是在生理pH下測(cè)量的。在生理pH下具有正電荷的天然存在的氨基酸包括L-賴氨酸、L-精氨酸和L-組氨酸。在生理pH下具有負(fù)電荷的天然存在的氨基酸包括L-天冬氨酸和L-谷氨酸。
通常，肽具有一個(gè)正電荷的N-末端氨基和一個(gè)負(fù)電荷的C-末端羧基。在生理pH下電荷彼此抵消。作為計(jì)算凈電荷的一個(gè)例子，肽酪氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-谷氨酸-組氨酸-色氨酸-精氨酸(Tyr-Arg-Phe-Lys-Glu-His-Trp-Arg)具有一個(gè)負(fù)電荷氨基酸(即，谷氨酸)和四個(gè)正電荷氨基酸(即，兩個(gè)精氨酸殘基，一個(gè)賴氨酸和一個(gè)組胺酸)。因此上述肽含有3個(gè)凈正電荷。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，該芳香族陽(yáng)離子肽在生理pH下凈正電荷最小數(shù)目(pm)和氨基酸殘基總數(shù)(r)之間的關(guān)系為其中3Pm是小于或等于r+1的最大數(shù)。在該實(shí)施例中，凈正電荷最小數(shù)目(pm)和氨基酸殘基總數(shù)(r)之間的關(guān)系如下

在另一實(shí)施例中，該芳香族陽(yáng)離子肽在凈正電荷最小數(shù)目(pm)和氨基酸殘基總數(shù)(r)之間的關(guān)系為其中2pm是小于或等于r+1的最大數(shù)。在該實(shí)施例中，凈正電荷最小數(shù)目(pm)和氨基酸殘基總數(shù)(r)之間的關(guān)系如下

在一個(gè)實(shí)施例中，凈正電荷最小數(shù)目(pm)和氨基酸殘基總數(shù)(r)相等。在另一實(shí)施例中，該肽含有3或4個(gè)氨基酸殘基并且具有最少一個(gè)凈正電荷，優(yōu)選為最少2個(gè)凈正電荷以及更優(yōu)選為最少3個(gè)凈正電荷。
該芳香族陽(yáng)離子肽具有相對(duì)于凈正電荷總數(shù)(pt)最少量的芳香基團(tuán)也很重要。芳香基的最小數(shù)目在下文中表示為(a)。
具有芳香基的天然存在的氨基酸包括組氨酸、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸這些氨基酸。例如，六肽賴氨酸-谷胺酰胺-酪氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-色氨酸含有2個(gè)凈正電荷(由賴氨酸和精氨酸殘基貢獻(xiàn))和3個(gè)芳香基(由酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基貢獻(xiàn))。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法中有用的芳香族陽(yáng)離子肽在芳香基最小數(shù)目(a)和生理pH下凈正電荷總數(shù)(pt)之間的關(guān)系為其中3a是小于或等于pt+1的最大數(shù)，除非當(dāng)pt是1，a也可以是1。在該實(shí)施例中，芳香基的最小數(shù)目(a)和凈正電荷總數(shù)(pt)之間的關(guān)系如下

在另一個(gè)實(shí)施例中，該芳香族陽(yáng)離子肽在芳香基最小數(shù)目(a)和凈正電荷總數(shù)(pt)之間的關(guān)系為其中2a是小于或等于pt+1的最大數(shù)。在該實(shí)施例中，芳香族氨基酸殘基的最小數(shù)目(a)和凈正電荷總數(shù)(pt)之間的關(guān)系如下

在另一個(gè)實(shí)施例中，芳香基數(shù)目(a)和凈正電荷總數(shù)(pt)是相等的。
羧基，尤其是C-末端氨基酸的末端羧基，優(yōu)選用例如氨進(jìn)行酰胺化形成C-末端酰胺。另一種可選的方案是，C-末端氨基酸的末端羧基可以用任何伯胺或仲胺酰胺化。該伯胺或仲胺可以是，例如烷基，尤其是支鏈或直鏈C1-C4烷基、或芳基胺。相應(yīng)地，該肽C-末端的氨基酸可以轉(zhuǎn)化成酰胺基、N-甲基酰胺基、N-乙基酰胺基、N，N-二甲基酰胺基、N，N-二乙基酰胺基、N-甲基-N-乙基酰胺基、N-苯基酰胺基或N-苯基-N-乙基酰胺基。
即使天冬酰胺殘基、谷酰胺殘基、天冬氨酸殘基和谷氨酸殘基的自由羧基基團(tuán)不位于本發(fā)明的芳香族陽(yáng)離子肽的C-末端，不論它們位于該肽的任何位置都可以被酰胺化。這些內(nèi)部位置的酰胺化可以用氨或任何上述的伯胺或仲胺進(jìn)行。
在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法中有用的芳香族陽(yáng)離子肽是一種具有兩個(gè)凈正電荷和至少一個(gè)芳香族氨基酸的三肽。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，本發(fā)明的方法中有用的芳香族陽(yáng)離子肽是一種具有兩個(gè)凈正電荷和兩個(gè)芳香族氨基酸的三肽。
本發(fā)明的方法中有用的芳香族陽(yáng)離子肽包括但不限于下述肽的實(shí)例賴氨酸-右旋精氨酸-酪氨酸-NH2(Lys-D-Arg-Tyr-NH2)，苯丙氨酸-右旋精氨酸-組氨酸(Phe-D-Arg-His)，
右旋酪氨酸-色氨酸-賴氨酸-NH2(D-Tyr-Trp-Lys-NH2)，色氨酸-右旋賴氨酸-酪氨酸-精氨酸-NH2(Trp-D-Lys-Tyr-Arg-NH2)，酪氨酸-組氨酸-右旋甘氨酸-蛋氨酸(Tyr-His-D-Gly-Met)，苯丙氨酸-精氨酸-右旋組氨酸-天冬氨酸(Phe-Arg-D-His-Asp)，酪氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-谷氨酸-NH2(Tyr-D-Arg-Phe-Lys-Glu-NH2)，蛋氨酸-酪氨酸-右旋賴氨酸-苯丙氨酸-精氨酸(Met-Tyr-D-Lys-Phe-Arg)，右旋組氨酸-谷氨酸-賴氨酸-酪氨酸-右旋苯丙氨酸-精氨酸(D-His-Glu-Lys-Tyr-D-Phe-Arg)，賴氨酸-右旋谷氨酰胺-酪氨酸-精氨酸-右旋苯丙氨酸-色氨酸-NH2(Lys-D-Gln-Tyr-Arg-D-Phe-Trp-NH2)，苯丙氨酸-右旋精氨酸-賴氨酸-色氨酸-酪氨酸-右旋精氨酸-組氨酸(Phe-D-Arg-Lys-Trp-Tyr-D-Arg-His)，甘氨酸-右旋苯丙氨酸-賴氨酸-酪氨酸-組氨酸-右旋精氨酸-酪氨酸-NH2(Gly-D-Phe-Lys-Tyr-His-D-Arg-Tyr-NH2)，纈氨酸-右旋賴氨酸-組氨酸-酪氨酸-右旋苯丙氨酸-絲氨酸-酪氨酸-精氨酸-NH2(Val-D-Lys-His-Tyr-D-Phe-Ser-Tyr-Arg-NH2)，色氨酸-賴氨酸-苯丙氨酸-右旋天冬氨酸-精氨酸-酪氨酸-右旋組氨酸-賴氨酸(Trp-Lys-Phe-D-Asp-Arg-Tyr-D-His-Lys)，賴氨酸-色氨酸-右旋酪氨酸-精氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-酪氨酸-右旋組氨酸-NH2(Lys-Trp-D-Tyr-Arg-Asn-Phe-Tyr-D-His-NH2)，蘇氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸-右旋組氨酸-苯丙氨酸-色氨酸-右旋組氨酸-賴氨酸(Thr-Gly-Tyr-Arg-D-His-Phe-Trp-D-His-Lys)，
天冬氨酸-右旋色氨酸-賴氨酸-酪氨酸-右旋組氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-右旋甘氨酸-賴氨酸-NH2(Asp-D-Trp-Lys-Tyr-D-His-Phe-Arg-D-Gly-Lys-NH2)，右旋組氨酸-賴氨酸-酪氨酸-右旋苯丙氨酸-谷氨酸-右旋天冬氨酸-右旋組氨酸-右旋賴氨酸-精氨酸-色氨酸-NH2(D-His-Lys-Tyr-D-Phe-Glu-D-Asp-D-His-D-Lys-Arg-Trp-NH2)，丙氨酸-右旋苯丙氨酸-右旋精氨酸-酪氨酸-賴氨酸-右旋色氨酸-組氨酸-右旋酪氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸(Ala-D-Phe-D-Arg-Tyr-Lys-D-Trp-His-D-Tyr-Gly-Phe)，酪氨酸-右旋組氨酸-苯丙氨酸-右旋精氨酸-天冬氨酸-賴氨酸-右旋精氨酸-組氨酸-色氨酸-右旋組氨酸-苯丙氨酸(Tyr-D-His-Phe-D-Arg-Asp-Lys-D-Arg-His-Trp-D-His-Phe)，苯丙氨酸-苯丙氨酸-右旋酪氨酸-精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-右旋賴氨酸-精氨酸-右旋精氨酸-組氨酸-苯丙氨酸-NH2(Phe-Phe-D-Tyr-Arg-Glu-Asp-D-Lys-Arg-D-Arg-His-Phe-NH2)，苯丙氨酸-酪氨酸-賴氨酸-右旋精氨酸-色氨酸-組氨酸-右旋賴氨酸-右旋賴氨酸-谷氨酸-精氨酸-右旋酪氨酸-蘇氨酸(Phe-Try-Lys-D-Arg-Trp-His-D-Lys-D-Lys-Glu-Arg-D-Tyr-Thr)，酪氨酸-天冬氨酸-右旋賴氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸-右旋賴氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-右旋酪氨酸-組氨酸-賴氨酸(Tyr-Asp-D-Lys-Tyr-Phe-D-Lys-D-Arg-Phe-Pro-D-Tyr-His-Lys)，谷氨酸-精氨酸-右旋賴氨酸-酪氨酸-右旋纈氨酸-苯丙氨酸-右旋組氨酸-色氨酸-精氨酸-右旋甘氨酸-酪氨酸-精氨酸-右旋蛋氨酸-NH2(Glu-Arg-D-Lys-Tyr-D-Val-Phe-D-His-Trp-Arg-D-Gly-Tyr-Arg-D-Met-NH2)，精氨酸-右旋亮氨酸-右旋酪氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-谷氨酸-右旋賴氨酸-精氨酸-右旋色氨酸-賴氨酸-右旋苯丙氨酸-酪氨酸-右旋精氨酸-甘氨酸(Arg-D-Leu-D-Tyr-Phe-Lys-Glu-D-Lys-Arg-D-Trp-Lys-D-Phe-Tyr-D-Arg-Gly)，右旋谷氨酸-精氨酸-賴氨酸-右旋精氨酸-右旋組氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-右旋纈氨酸-酪氨酸-精氨酸-酪氨酸-右旋酪氨酸-精氨酸-組氨酸-苯丙氨酸-NH2(D-Glu-Asp-Lys-D-Arg-D-His-Phe-Phe-D-Val-Tyr-Arg-Tyr-D-Tyr-Arg-His-Phe-NH2)，天冬氨酸-精氨酸-右旋苯丙氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-右旋精氨酸-右旋賴氨酸-酪氨酸-精氨酸-右旋酪氨酸-色氨酸-右旋組氨酸-酪氨酸-右旋苯丙氨酸-賴氨酸-苯丙氨酸(Asp-Arg-D-Phe-Cys-Phe-D-Arg-D-Lys-Tyr-Arg-D-Tyr-Trp-D-His-Tyr-D-Phe-Lys-Phe)，組氨酸-酪氨酸-右旋精氨酸-色氨酸-賴氨酸-苯丙氨酸-右旋天冬氨酸-丙氨酸-精氨酸-半胱氨酸-右旋酪氨酸-組氨酸-苯丙氨酸-右旋賴氨酸-酪氨酸-組氨酸-絲氨酸-NH2(His-Tyr-D-Arg-Trp-Lys-Phe-D-Asp-Ala-Arg-Cys-D-Tyr-His-Phe-D-Lys-Tyr-His-Ser-NH2)，甘氨酸-丙氨酸-賴氨酸-苯丙氨酸-右旋賴氨酸-谷氨酸-精氨酸-酪氨酸-組氨酸-右旋精氨酸-右旋精氨酸-天冬氨酸-酪氨酸-色氨酸-右旋組氨酸-色氨酸-組氨酸-右旋賴氨酸-天冬氨酸(Gly-Ala-Lys-Phe-D-Lys-Glu-Arg-Tyr-His-D-Arg-D-Arg-Asp-Tyr-Trp-D-His-Trp-His-D-Lys-Asp)，以及蘇氨酸-酪氨酸-精氨酸-右旋賴氨酸-色氨酸-酪氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-右旋賴氨酸-右旋精氨酸-組氨酸-苯丙氨酸-右旋酪氨酸-甘氨酸-纈氨酸-異亮氨酸-右旋組氨酸-精氨酸-酪氨酸-NH2(Thr-Tyr-Arg-D-Lys-Trp-Tyr-Glu-Asp-D-Lys-D-Arg-His-Phe-D-Tyr-Gly-Val-Ile-D-His-Arg-Tyr-NH2)。
在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法中有用的肽具有μ-阿片樣物質(zhì)受體激動(dòng)劑活性(即，激活μ-阿片樣物質(zhì)受體)。μ-阿片樣物質(zhì)受體的激活通常具有止痛作用。
在一些情況下，優(yōu)選的是具有μ-阿片樣物質(zhì)受體活性的芳香族陽(yáng)離子肽。例如，在如急性疾病和病癥這樣的短期治療過程中，使用可激活μ-阿片樣物質(zhì)受體的芳香族陽(yáng)離子肽是有益的。這些急性疾病和病癥通常與中度或重度疼痛相關(guān)。在這些情況下，該芳香族陽(yáng)離子肽的止痛作用在對(duì)病人或其它哺乳動(dòng)物的治療方案中是有益的，盡管其不能激活μ-阿片樣物質(zhì)受體的芳香族陽(yáng)離子肽，但是也可以根據(jù)臨床需要與或不與止痛劑結(jié)合使用。
在其它情況下，另一種可選方案優(yōu)選的是不具有μ-阿片樣物質(zhì)受體活性的芳香族陽(yáng)離子肽。例如，在如慢性疾病和病癥這樣的長(zhǎng)期治療過程中，使用能激活μ-阿片樣物質(zhì)受體的芳香族陽(yáng)離子肽可能是禁忌的。在這些情況下，該芳香族陽(yáng)離子肽潛在的副作用或成癮作用可能會(huì)妨礙具有μ-阿片樣物質(zhì)受體激活作用的芳香族陽(yáng)離子肽在對(duì)病人或其它哺乳動(dòng)物的治療方案中的使用。
潛在的副作用可以包括鎮(zhèn)靜、便秘和呼吸抑制。在這些情況下，不能激活μ-阿片樣物質(zhì)受體的芳香族陽(yáng)離子肽可能是一種恰當(dāng)?shù)闹委熕幬铩?br> 急性病癥的實(shí)例包括心臟病發(fā)作、中風(fēng)(腦卒中)和外傷。外傷可以包括腦外傷和脊髓外傷。
慢性疾病和病癥的例子包括如下所述的冠狀動(dòng)脈疾病和任何神經(jīng)退行性疾病。
本發(fā)明的方法中有用的具有μ-阿片樣物質(zhì)受體活性的肽通常是的含有酪氨酸殘基或酪氨酸N-末端(即，第一個(gè)氨基酸位置)衍生物的那些肽。優(yōu)選的酪氨酸衍生物包括2’-甲基酪氨酸(Mmt)；2’，6’-二甲基酪氨酸(2’6’Dmt)；3’，5’-二甲基酪氨酸(3’5’Dmt)；N，2’，6’-三甲基酪氨酸(Tmt)；以及2’-羥基-6’-甲基酪氨酸(Hmt)。
在一特別優(yōu)選的實(shí)施例中，具有μ-阿片樣物質(zhì)受體活性的肽具有分子式為酪氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-NH2(Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2)(為了方便以首字母縮寫表示為DALDA，在本文中稱作SS-01)。DALDA具有由酪氨酸、精氨酸和賴氨酸這些氨基酸提供的3個(gè)凈正電荷，以及由苯丙氨酸和酪氨酸提供的2個(gè)芳香基團(tuán)。DALDA的酪氨酸可以是被修飾的酪氨酸衍生物如2’，6’-二甲基酪氨酸，從而生成具有分子式為2’，6’-二甲基酪氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-NH2(2’，6’-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2)(即，Dmt1-DALDA，在本文中稱作SS-02)的化合物。
不具有μ-阿片樣物質(zhì)受體活性的肽通常在N-末端(即，氨基酸的位置1)不含有酪氨酸殘基或酪氨酸衍生物。在N-末端的氨基酸可以是除酪氨酸以外的任意天然存在的或非天然存在的氨基酸。
在一個(gè)實(shí)施例中，N-末端氨基酸是苯丙氨酸或其衍生物。優(yōu)選的苯丙氨酸衍生物包括2’-甲基苯丙氨酸(Mmp)、2’，6’-二甲基苯丙氨酸(Dmp)、N，2’，6’-三甲基苯丙氨酸(Tmp)和2’-羥基-6’-甲基苯丙氨酸(Hmp)。
另一種不具有μ-阿片樣物質(zhì)受體活性的芳香族陽(yáng)離子肽的分子式為苯丙氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-NH2(Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2)(即，Phe1-DALDA，在本文中稱作SS-20)?？蛇x替換地，該N-末端苯丙氨酸可以是苯丙氨酸的衍生物如2’，6’-二甲基苯丙氨酸(2’6’Dmp)。在氨基酸位置1含有2’，6’-二甲基苯丙氨酸的DALDA的分子式為2’，6’-Dmp-右旋精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-NH2(2’，6’-Dmp-D-Arg-Phe-Lys-NH2)(即，2’6’Dmp1-DALDA)。
在一優(yōu)選實(shí)施例中，Dmt1-DALDA(SS-02)的氨基酸序列是重新排列的，使得Dmt不位于N-末端。這樣不具有μ-阿片樣物質(zhì)受體活性的芳香族陽(yáng)離子肽的例子具有的分子式為右旋精氨酸-2’6’Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2(D-Arg-2’6’Dmt-Lys-Phe-NH2)(在本說明書中稱作SS-31)。
DALDA、Phe1-DALDA、SS-31、和它們的衍生物可以進(jìn)一步包括功能類似物。如果該類似物具有與DALDA、Phe1-DALDA或SS-31類似的功能，則該肽被稱作是DALDA、Phe1-DALDA或SS-31的功能類似物。例如，該類似物可以是DALDA、Phe1-DALDA或SS-31的取代變體，在該取代變體中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被其它氨基酸取代。
DALDA、Phe1-DALDA或SS-31適宜的取代變體包括保守的氨基酸取代。氨基酸按照它們的物理化學(xué)性質(zhì)可以分組如下(a)非極性氨基酸丙氨酸(A)絲氨酸(S)蘇氨酸(T)脯氨酸(P)甘氨酸(G)(Ala(A)Ser(S)Thr(T)Pro(P)Gly(G))；(b)酸性氨基酸天冬酰胺(N)天冬氨酸(D)谷氨酸(E)谷胺酰胺(Q)(Asn(N)Asp(D)Glu(E)Gln(Q))；(c)堿性氨基酸組氨酸(H)精氨酸(R)賴氨酸(K)(His(H)Arg(R)Lys(K))；(d)疏水性氨基酸甲硫氨酸(M)亮氨酸(L)異亮氨酸(I)纈氨酸(V)(Met(M)Leu(L)Ile(I)Val(V))；以及
(e)芳香族氨基酸苯丙氨酸(F)酪氨酸(T)色氨酸(W)組氨酸(H)(Phe(F)Tyr(Y)Trp(W)His(H))。
肽中的一個(gè)氨基酸被同組的另一個(gè)氨基酸取代稱作保守取代，并且這種可以保留原始肽的物理化學(xué)性質(zhì)。相反，肽中的一個(gè)氨基酸被不同組的另一個(gè)氨基酸取代一般更有可能改變?cè)茧牡男再|(zhì)。
在本發(fā)明的實(shí)踐中，能激活μ-阿片樣物質(zhì)受體有用的類似物的例子包括但不限于表1中所示的芳香族陽(yáng)離子肽。
表1





Dab＝二氨基丁酸Dap＝二氨基丙酸Dmt＝二甲基酪氨酸Mmt＝2’-甲基酪氨酸Tmt＝N，2’，6’-三甲基酪氨酸Hmt＝2’-羥基-6’-甲基酪氨酸dnsDap＝β-丹磺?；?L-α，β-二氨基丙酸atnDap＝β-鄰氨基苯甲酰基-L-α，β-二氨基丙酸Bio＝生物素。
在本發(fā)明的實(shí)踐中不能激活μ-阿片樣物質(zhì)受體的有用的類似物的例子包括但不限于表2所示的芳香族陽(yáng)離子肽。
表2


Cha＝環(huán)己基表1和表2中所示的肽中的氨基酸既可以是L-構(gòu)象也可以是D-構(gòu)象。
治療方法上文所述的肽可用于治療與MPT相關(guān)的任何疾病或病癥。這些疾病和病癥包括但不限于組織或器官的局部缺血和/或再灌注，缺氧癥和眾多的神經(jīng)退行性疾病中的任意一種。需要治療或防止MPT的哺乳動(dòng)物是患這些疾病或病癥的那些哺乳動(dòng)物。
哺乳動(dòng)物組織或器官中的局部缺血是一種由氧缺乏(缺氧)和/或葡萄糖(即，底物)缺乏所引起的多方面的病理癥狀。組織或器官細(xì)胞中的氧和/或葡萄糖缺乏導(dǎo)致能量生成能力的降低或完全喪失以及隨后發(fā)生的活性離子跨膜運(yùn)輸?shù)墓δ艿膯适АＱ鹾?或葡萄糖缺乏還可導(dǎo)致其它細(xì)胞膜中的病理變化，包括線粒體膜內(nèi)的通透性改變。另外一些分子，如通常被封閉在線粒體中的凋亡蛋白可以泄露到細(xì)胞質(zhì)中并且引起編程性細(xì)胞凋亡(apoptotic cell death)。嚴(yán)重的局部缺血可以導(dǎo)致細(xì)胞壞死。
特定組織或器官中的局部缺血或缺氧可以由對(duì)該組織或器官的血液供應(yīng)的喪失或嚴(yán)重減少而引起。血液供應(yīng)的喪失或嚴(yán)重減少可以由例如血栓栓塞性腦卒中、冠狀動(dòng)脈硬化或外周血管疾病引起。受局部缺血或缺氧影響的組織通常是肌肉，如心肌、骨骼肌或平滑肌。
受局部缺血或缺氧影響的器官可以是遭受局部缺血或缺氧的任何器官。受局部缺血或缺氧影響的器官的例子包括腦、心臟、腎和前列腺。例如，心肌缺血或缺氧通常是由動(dòng)脈硬化或血栓阻塞引起的，它們導(dǎo)致通過心臟動(dòng)脈和毛細(xì)血管血液供應(yīng)輸送到心肌組織的氧減少或喪失。這樣的心肌缺血或缺氧可以導(dǎo)致受影響的心肌疼痛和壞死，并且最終可以導(dǎo)致心力衰竭。
骨骼肌或平滑肌中的局部缺血或缺氧可以由類似的原因引起。例如，在小腸平滑肌或四肢骨骼肌中的局部缺血或缺氧也可以由動(dòng)脈硬化或血栓阻塞引起。
再灌注是向減少或阻斷血流的任意組織或器官中恢復(fù)血流。例如，可以對(duì)任何受局部缺血或缺氧影響的組織或器官恢復(fù)血流。血流的恢復(fù)(再灌注)可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意方法來實(shí)現(xiàn)。例如，局部缺血的心臟組織的再灌注可以通過血管成形術(shù)(血管重建術(shù))、冠狀動(dòng)脈旁路移植或使用溶栓藥物來實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的方法還可以用于治療或預(yù)防與MPT相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病。與MPT相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病包括例如帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓氏舞蹈病和肌萎縮性側(cè)索硬化病(ALS，也稱作洛蓋赫里格病)。本發(fā)明的方法可以用于延緩與MPT相關(guān)的這些或其它神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生或減慢其進(jìn)程。本發(fā)明的方法在治療與MPT相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的早期患者和易感人員時(shí)是特別有用的。
本發(fā)明中有用的肽也可以用于在移植前保存哺乳動(dòng)物的器官。例如，離體器官由于缺乏血流可能易受到MPT。因此，該肽能用于在離體器官中防止MPT。
可以將離體器官置于如那些在本領(lǐng)域中常用的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中。例如，離體心臟可以置于含有上述肽的心臟停搏液中。肽在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中的濃度可以很容易被本領(lǐng)域技術(shù)人員測(cè)定。例如，該濃度可以是約0.1nM到約10μM之間，優(yōu)選為約1μM到約10μM。
該肽還可以給予正在進(jìn)行藥物治療疾病和病癥的哺乳動(dòng)物。如果該藥物的副作用包括MPT，則正在使用該藥物的哺乳動(dòng)物將會(huì)從本發(fā)明的肽中獲得極大的益處。
通過影響MPT來誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的藥物的例子是化療藥物阿霉素。
肽的合成本發(fā)明的方法中有用的肽可以通過本領(lǐng)域公知的任何方法來化學(xué)合成。合成該蛋白適宜的方法包括例如由Stuart和Young在“Solid Phase Peptide Systhesis，”第二版，Pierce Chemical Company(1984)，以及在“Solid Phase Peptide Systhesis，”Methods Enzymol.289，Academic Press，Inc，New York(1997)中所描述的方法。
給藥方法在本發(fā)明的方法中，將有用的肽以減少遭受線粒體MPT的數(shù)量或阻止MPT的有效量給予哺乳動(dòng)物。該有效量在臨床前期測(cè)試和臨床測(cè)試中用醫(yī)師和臨診醫(yī)師熟悉的方法來測(cè)定。
在本發(fā)明的方法中，有效量的有用肽，優(yōu)選在藥物組合物中，可以通過給予藥物化合物的眾多公知方法中的任意一種來給予有需要的哺乳動(dòng)物。
該肽可以全身給藥或局部給藥。在一個(gè)實(shí)施例中，該肽是靜脈內(nèi)給藥的。例如，本發(fā)明的方法中有用的芳香族陽(yáng)離子肽可以通過快速靜脈推注來給藥。然而，優(yōu)選的是該肽以恒速靜脈灌輸?shù)姆绞絹斫o藥。
該肽可以在例如血管成形術(shù)或冠狀動(dòng)脈旁路手術(shù)中直接注射到冠狀動(dòng)脈中，或涂布到冠狀動(dòng)脈支架上。
該肽也可以口服給藥、局部給藥、鼻內(nèi)給藥、肌肉內(nèi)給藥、皮下給藥或透皮給藥。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明方法中的芳香族陽(yáng)離子肽的透皮給藥是通過離子電滲療法實(shí)現(xiàn)的，其中帶電荷的肽是通過電流來透過皮膚輸送的。
其它的給藥途徑包括腦室內(nèi)或鞘內(nèi)給藥。腦室內(nèi)給藥是指給予到腦的腔室系統(tǒng)中。鞘內(nèi)給藥是指給予到脊髓的蛛網(wǎng)膜下的間隙中。因此，腦室內(nèi)或鞘內(nèi)給藥可以優(yōu)選用于影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)器官或組織的疾病和病癥。在一優(yōu)選實(shí)施例中，鞘內(nèi)給藥用于脊髓外傷。
本發(fā)明的方法中有用的肽還可以通過持續(xù)釋放的方式給予哺乳動(dòng)物，這在本領(lǐng)域是公知的。持續(xù)釋放給藥是在特定時(shí)間段達(dá)到一定藥物水平的藥物輸送方法。該水平通常是由血清或血漿濃度測(cè)定的。
制藥領(lǐng)域中已知的任何劑型都適用于本發(fā)明的方法中有用的芳香族陽(yáng)離子肽的給藥。對(duì)于口服給藥，可以使用液體或固體劑型。劑型的一些例子包括片劑、凝膠膠囊、丸劑、錠劑、酏劑、混懸劑、糖漿、糯米紙囊劑、口嚼劑(chewing gum)等等。該肽可以與本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的適宜的藥物載體(媒介物)或賦形劑混合。載體或賦形劑的例子包括淀粉、牛奶、蔗糖、某些類型的粘土、凝膠、乳酸、硬脂酸或其鹽(包括硬脂酸鎂或硬脂酸鈣)、滑石、植物油脂或植物油、樹膠和乙二醇。
對(duì)于全身給藥、腦室內(nèi)給藥、鞘內(nèi)給藥、局部給藥、鼻內(nèi)給藥、皮下給藥、或者透皮給藥，本發(fā)明方法中有用的芳香族陽(yáng)離子肽的劑型可以利用傳統(tǒng)的如可以用于本領(lǐng)域的已知的稀釋劑、載體或賦形劑等輸送該肽。例如，該劑型可以含有一種或多種下述物質(zhì)穩(wěn)定劑，表面活性劑，優(yōu)選為非離子表面活性劑，以及任選的鹽和/或緩沖液。該肽可以以水溶液或凍干品的形式輸送。
穩(wěn)定劑可以是，例如甘氨酸這樣的氨基酸；或如蔗糖、四元糖、乳糖或葡聚糖這樣的寡糖。另一種可選的方案是，該穩(wěn)定劑可以是，例如甘露醇這樣的糖醇；或者是它們的組合物。優(yōu)選的是，穩(wěn)定劑或穩(wěn)定劑組合物構(gòu)成了肽的重量的約0.1％到約10％。
表面活性劑優(yōu)選為非離子表面活性劑，如聚山梨醇酯。適宜的表面活性劑的例子包括吐溫20、吐溫80；聚乙二醇或聚氧乙烯聚氧丙烯二醇(醚)，如約0.001％(w/v)到約10％(w/v)的PluronicF-68。
鹽或緩沖液可以分別是任意如氯化鈉或磷酸鈉/鉀的鹽或緩沖液。優(yōu)選地，緩沖液使藥物組合物的pH維持在約5.5到約7.5的范圍內(nèi)。鹽和/或緩沖液也用來將摩爾滲透壓濃度維持在適于給人或動(dòng)物給藥的水平。優(yōu)選的是鹽或緩沖液呈現(xiàn)約150μM到約300μM的粗略的等滲濃度。
在本發(fā)明的方法中，有用的肽的劑型可以另外含有一種或多種常用的添加劑。這些添加劑的一些例子包括如甘油這樣的增溶劑；如苯扎氯銨(季銨化合物的混合物，稱作“季銨化合物”)、苯甲醇、氯惹酮或氯丁醇這樣的抗氧化劑；如嗎啡衍生物這樣的麻醉劑；或上述的等滲劑等。為了進(jìn)一步防止氧化或其它腐敗，該藥物組合物可以用不滲透的塞子封裝在小瓶中在氮?dú)庀卤４妗?br> 該哺乳動(dòng)物可以是任意哺乳動(dòng)物，包括如農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，如羊、豬、牛和馬；寵物，如狗和貓；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如大鼠、小鼠和兔。在一優(yōu)選實(shí)施例中，該哺乳動(dòng)物是人。
實(shí)施例實(shí)施例1[Dmt1]DALDA穿透細(xì)胞膜利用人類腸上皮細(xì)胞系(Caco-2)研究[3H][Dmt1]DALDA的細(xì)胞攝入，并且用SH-SY5Y細(xì)胞(人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞)、HEK293細(xì)胞(人類胚胎腎細(xì)胞)及CRFK細(xì)胞(腎上皮細(xì)胞)進(jìn)行確認(rèn)。在涂布有膠原的12孔板上(5×105細(xì)胞/孔)將單層細(xì)胞培養(yǎng)三天。在第四天，用預(yù)熱的HBSS洗滌兩次細(xì)胞，然后用0.2ml含有250nM[3H][Dmt1]DALDA的HBSS于37℃或4℃孵育不同的時(shí)間直至1小時(shí)。
早在5分鐘時(shí)，在細(xì)胞裂解液中即可以觀察到[3H][Dmt1]DALDA，并在30分鐘時(shí)達(dá)到穩(wěn)態(tài)水平。孵育1小時(shí)后在細(xì)胞裂解液中回收的[3H][Dmt1]DALDA的總量占總藥量的大約1％。雖然[3H][Dmt1]DALDA的攝入在4℃時(shí)比37℃時(shí)變慢，但是在45分鐘時(shí)可達(dá)到76.5％并在1小時(shí)時(shí)達(dá)到86.3％。[3H][Dmt1]DALDA的內(nèi)化并不限于Caco-2細(xì)胞，在SH-SY5Y細(xì)胞、HEK293細(xì)胞和CRFK細(xì)胞中也可以觀察到。[3H][Dmt1]DALDA的細(xì)胞內(nèi)濃度估計(jì)比細(xì)胞外濃度大約高50倍。
在一獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，用一定濃度范圍(1μM-3mM)的[Dmt1]DALDA于37℃下孵育細(xì)胞1小時(shí)。在孵育期結(jié)束后，用HBSS洗滌細(xì)胞4次，向各個(gè)孔中加入0.2ml含有1％SDS的0.1N NaOH。然后將細(xì)胞內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到閃爍管中，并且進(jìn)行放射性計(jì)數(shù)。為了將內(nèi)化的放射性和表面結(jié)合的放射性區(qū)分開，引入了酸洗步驟。在細(xì)胞裂解之前，將細(xì)胞用0.2ml的0.2M醋酸/0.05M NaCl于冰上孵育5分鐘。
DALDA攝入到Caco-2細(xì)胞中是通過共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)使用一種[Dmt1]DALDA的熒光類似物(Dmt-右旋精氨酸-苯丙氨酸-dnsDap-NH2)來確認(rèn)的；其中dnsDap為β-丹磺?；?1-α，β-二氨基丙酸)。細(xì)胞培養(yǎng)如前所述，并且于(35mm)玻璃底培養(yǎng)皿上(MatTek Corp.，Ashland，MA)平鋪兩天。棄去培養(yǎng)液(基)，將細(xì)胞用1ml含有0.1μM至1.0μM該熒光肽類似物的HBSS于37℃孵育1小時(shí)。然后用冰冷的HBSS洗滌細(xì)胞3次，并且用200μl的PBS覆蓋，然后于室溫下用具有C-復(fù)消色差63×/1.2W校正物鏡的Nikon共聚焦激光掃描顯微鏡在10分鐘內(nèi)完成顯微成像。在340nm通過UV激光進(jìn)行激發(fā)，并于520nm處測(cè)量發(fā)射光。為了進(jìn)行Z-方向上的光學(xué)斷層顯微成像，將每2.0μm切5-10幀。
CLSM確認(rèn)了用0.1μM的[Dmt1，DnsDap4]DALDA于37℃孵育1小時(shí)后，熒光Dmt-右旋精氨酸-苯丙氨酸-dnsDap-NH2攝入到Caco-2細(xì)胞中。37℃時(shí)與4℃時(shí)熒光肽的攝入是類似的。雖熒光在整個(gè)胞質(zhì)中出現(xiàn)了擴(kuò)散，但是被完全排除于細(xì)胞核之外。
實(shí)施例2[Dmt1]DALDA靶向定位到線粒體為了檢測(cè)[Dmt1]DALDA的亞細(xì)胞分布，制備熒光類似物[Dmt1，AtnDap4]DALDA(Dmt-右旋精氨酸-苯丙氨酸-atnDap-NH2；其中atn為β-鄰氨基苯甲?；?1-α，β-二氨基丙酸)。該類似物含有β-鄰氨基苯甲酰-1-α，β-二氨基丙酸以替代位置4上的賴氨酸殘基。細(xì)胞培養(yǎng)如實(shí)施例1所述，并且于(35mm)玻璃底培養(yǎng)皿(MatTek Corp.，Ashland，MA)上平鋪2天。棄去培養(yǎng)液，并且用1ml含有0.1μM[Dmt1，AtnDap4]DALDA的HBSS于37℃孵育細(xì)胞15分鐘至1小時(shí)。
細(xì)胞也可以用四甲基若丹明甲酯(TMRM，25nM)，一種著染線粒體的染料，37℃下孵育15分鐘。然后用冰冷的HBSS洗滌細(xì)胞3次，并且用200μl的PBS覆蓋，并且于室溫下用具有C-復(fù)消色差63×/1.2W校正物鏡的Nikon共聚焦激光掃描顯微鏡在10分鐘內(nèi)完成顯微成像。
對(duì)于[Dmt1，AtnDap4]DALDA，通過UV激光器于350nm處進(jìn)行激發(fā)，在520nm處測(cè)量發(fā)射光。對(duì)于TMRM，在536nm處進(jìn)行激發(fā)，并于560nm處測(cè)量發(fā)射光。
在37℃孵育至少15分鐘后，CLSM顯示熒光[Dmt1，AtnDap4]DALDA攝入到Caco-2細(xì)胞內(nèi)。雖然染料的攝入完全排除在細(xì)胞核之外，然而該藍(lán)色染料在細(xì)胞質(zhì)中顯示出條紋狀分布。用TMRM將線粒體標(biāo)記成紅色。通過疊加[Dmt1，AtnDap4]DALDA的分布和TMRM的分布來顯示[Dmt1，AtnDap4]DALDA的線粒體分布。
實(shí)施例3[Dmt1]DALDA攝入到線粒體中為了從鼠肝中分離線粒體，通過斷頭術(shù)處死小鼠。將肝臟取出并快速置于冷卻的肝臟勻漿液中。用剪刀將小鼠肝臟剪成細(xì)小的碎塊，然后用玻璃勻漿器手動(dòng)勻漿。
將勻漿液于4℃、1000×g下離心10分鐘。吸出上清液并轉(zhuǎn)移到聚碳酸酯管中，于4℃、3000×g下再次離心10分鐘。棄去上清液，并小心除去管側(cè)壁上的油脂。
將沉淀再懸浮于肝臟勻漿液中，并反復(fù)勻漿兩次。將最終純化的線粒體沉淀再懸浮于勻漿液中。線粒體制備過程中的蛋白濃度用Bradford方法檢測(cè)。
將在400μl緩沖液中的大約1.5mg的線粒體用[3H][Dmt1]DALDA于37℃孵育5-30分鐘。然后將線粒體離心下來，測(cè)定線粒體部分和緩沖液部分的放射性的量。假設(shè)線粒體基質(zhì)容積為0.7μl/mg蛋白(Lim et a1.，J.Physiol 545961-974，2002)，則發(fā)現(xiàn)[3H][Dmt1]DALDA在線粒體中的濃度比緩沖液中的高200倍。因此，[Dmt1]DALDA在線粒體內(nèi)得到了濃縮。
基于這些數(shù)據(jù)，當(dāng)用[Dmt1]DALDA灌注離體的豚鼠心臟時(shí)，[Dmt1]DALDA在線粒體中的濃度可以估計(jì)為[Dmt1]DALDA在冠狀動(dòng)脈灌注液中的濃度 0.1μM[Dmt1]DALDA在肌細(xì)胞中的濃度 5μM[Dmt1]DALDA在線粒體中的濃度 1.0mM實(shí)施例4經(jīng)分離的線粒體對(duì)[Dmt1]DALDA的積聚(圖1)為了進(jìn)一步證明[Dmt1]DALDA是選擇性分布于線粒體中，我們檢測(cè)了[Dmt1，AtnDap4]DALDA和[3H][Dmt1]DALDA攝取進(jìn)入經(jīng)分離的鼠肝臟線粒體的情況。加入線粒體后可以觀察到熒光迅速淬滅，表明[Dmt1，AtnDap4]DALDA的快速攝取(圖1A)。用一種可以導(dǎo)致線粒體迅速去極化的解偶聯(lián)劑FCCP(對(duì)-(三氟甲氧基)-苯腙羰基氰化物)預(yù)處理線粒體，[Dmt1，AtnDap4]DALDA的攝取僅僅減少＜20％。因此，[Dmt1，AtnDap4]DALDA的攝取不是電位依賴性的。
為了確認(rèn)線粒體靶向定位不是熒光團(tuán)的人為假象(artifact)，我們還檢測(cè)了[3H][Dmt1]DALDA的線粒體攝入。經(jīng)分離的線粒體用[3H][Dmt1]DALDA孵育，并在線粒體沉淀和上清液中檢測(cè)放射性。從2分鐘至8分鐘，沉淀中的放射性的量不改變。用FCCP處理的線粒體僅僅減少了與線粒體沉淀連接的[3H][Dmt1]DALDA量的～20％(圖1B)。
FCCP對(duì)[Dmt1]DALDA攝取的微弱影響表明[Dmt1]DALDA可能與線粒體膜連接或位于膜間間隙而不是位于基質(zhì)中。我們隨后通過使用丙甲甘肽以誘導(dǎo)腫脹和外膜破裂檢測(cè)了線粒體腫脹對(duì)[Dmt1，AtnDap4]DALDA在線粒體中積聚的影響。與TMRM不同，[Dmt1]DALDA的攝入僅部分被線粒體腫脹逆轉(zhuǎn)(圖1C)。因此，[Dmt1]DALDA是與線粒體膜連接的。
實(shí)施例5[Dmt1]DALDA不改變線粒體呼吸或電位(圖1D)[Dmt1]DALDA在線粒體中的積聚不改變線粒體功能。用100μM的[Dmt1]DALDA孵育經(jīng)分離的鼠肝臟線粒體不改變階段3和階段4過程中的氧消耗、或改變呼吸率(階段3/階段4)(6.2/6.0)。線粒體膜電位用TMRM來測(cè)量(圖1D)。加入線粒體導(dǎo)致TMRM信號(hào)迅速淬滅，該信號(hào)通過加入FCCP可以快速恢復(fù)，表明線粒體去極化。加入Ca2+(150μM)導(dǎo)致迅速去極化，同時(shí)伴隨著逐步失去MPT的淬滅指示。單獨(dú)加入[Dmt1]DALDA，甚至在200μM時(shí)，也不引起線粒體去極化或MPT。
實(shí)施例6[Dmt1]DALDA保護(hù)線粒體免受由Ca2+和3-硝基丙酸誘導(dǎo)的MPT(圖2)除了對(duì)線粒體膜電位不具有直接影響之外，[Dmt1]DALDA還能夠保護(hù)線粒體免受由于Ca2+過載引起的MPT。在加入Ca2+之前，用[Dmt1]DALDA(10μM)預(yù)處理經(jīng)分離的線粒體2分鐘，僅僅導(dǎo)致短暫的去極化同時(shí)阻止了MPT的開始(圖2A)。[Dmt1]DALDA劑量依賴性增加了線粒體對(duì)積累的Ca2+刺激的耐受力。圖2B表明[Dmt1]DALDA增加了經(jīng)分離的線粒體在MPT之前能夠耐受的加入的Ca2+的量。
3-硝基丙酸(3NP)是電子傳遞鏈復(fù)合體II中的琥珀酸脫氫酶的一種不可逆抑制劑。在經(jīng)分離的線粒體中加入3NP(1mM)引起了線粒體電位的下降，并且引發(fā)了MPT的開始(圖2C)。用[Dmt1]DALDA預(yù)處理線粒體劑量依賴性地延緩了由3NP誘導(dǎo)的MPT的開始(圖3C)。
為了證明[Dmt1]DALDA能夠穿過細(xì)胞膜并且保護(hù)線粒體免受由3NP引起的線粒體去極化，在不存在或存在[Dmt1]DALDA(0.1μM)的情況下用3NP(10mM)處理Caco-2細(xì)胞4小時(shí)，然后用TMRM孵育并且在LSCM下檢測(cè)。在對(duì)照細(xì)胞中，可以清楚地看到線粒體在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中呈現(xiàn)細(xì)條紋狀。在用3NP處理的細(xì)胞中，TMRM熒光大大減少，表明普遍的去極化。與之相反，同時(shí)用[Dmt1]DALDA處理，保護(hù)線粒體免受由3NP引起的線粒體去極化。
實(shí)施例7[Dmt1]DALDA保護(hù)線粒體免受線粒體腫脹和細(xì)胞色素C釋放MPT孔開放導(dǎo)致線粒體腫脹。我們通過測(cè)量540nm處吸光度(A540)的降低來檢測(cè)[Dmt1]DALDA對(duì)線粒體腫脹的影響。然后將線粒體懸浮液離心，并用商購(gòu)的ELISA試劑盒檢測(cè)線粒體沉淀和上清液中的細(xì)胞色素C。用SS-02預(yù)處理經(jīng)分離的線粒體抑制了由Ca2+過載所引起的腫脹(圖3A)和以及細(xì)胞色素C的釋放(圖3B)。除了抑制由Ca2+過載所引起的MPT，SS-02還可以抑制由MPP+(1-甲基-4-苯基吡啶鎓(phenylpyridium)離子)引起的線粒體腫脹，MPP+是線粒體電子傳遞鏈的復(fù)合體I的一種抑制劑(圖3C)。
實(shí)施例8右旋精氨酸-Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2(D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2)(SS-31)能夠保護(hù)線粒體免受MPT、線粒體腫脹和細(xì)胞色素C釋放。
非類鴉片肽SS-21具有同樣的保護(hù)線粒體免受由Ca2+引起的MPT(圖4A)、線粒體腫脹(圖4B)和細(xì)胞色素C釋放(圖4C)的能力。研究方法如前對(duì)SS-02的研究方法。在本實(shí)施例中，線粒體腫脹通過監(jiān)測(cè)570nm處的光散射來檢測(cè)。
實(shí)施例9[Dmt1]DALDA(SS-02)和右旋精氨酸-Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2(D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2)(SS-31)保護(hù)心肌免受由局部缺血-再灌注所引起的心肌頓抑。
快速分離豚鼠心臟，隨后在原位插管到主動(dòng)脈并用氧化的Krebs-Henseleit溶液(pH7.4)于34℃以逆行的方式灌注。然后將心臟切除，置于一經(jīng)改進(jìn)的Langendorff灌注設(shè)備上，并在恒壓下灌注(40cm水柱)。用一插入到左心室心尖的小鉤子和牢固連接到力-位移換能器(傳感器)上的絲帶來測(cè)量收縮力。冠狀動(dòng)脈流量通過定時(shí)收集肺動(dòng)脈的流出物來檢測(cè)。
將心臟用緩沖液、[Dmt1]DALDA(SS-02)(100nM)或右旋精氨酸-Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2(D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2)(SS-31)(1nM)灌注30分鐘，然后進(jìn)行30分鐘的全身缺血。用缺血之前所使用的同樣溶液進(jìn)行再灌注。
雙因素方差分析顯示出三個(gè)處理組在收縮力(P＜0.001＝)、心率(P＝0.003)和冠狀動(dòng)脈流速(P＜0.001)方面具有顯著的差異。在緩沖液組中，再灌注期間收縮力比缺血前大大降低(圖5)。用SS-02和SS-31處理的心臟比用緩沖液處理的心臟具有好得多的缺血耐受能力(圖5)。尤其是SS-31能夠完全抑制心臟頓抑。另外，在再灌注的整個(gè)過程中冠狀動(dòng)脈流速很好地保持了穩(wěn)定，沒有心率降低。
實(shí)施例10[Dmt1]DALDA(SS-02)改善了器官保存對(duì)于心臟移植，在運(yùn)輸過程中將供體心臟保存在心臟停搏液中。該保存液含有高鉀，可以有效地停止心臟搏動(dòng)并且保存能量。然而，離體心臟的存活時(shí)間仍然是非常有限的。
我們對(duì)[Dmt1]DALDA是否延長(zhǎng)器官的存活進(jìn)行了試驗(yàn)。在這些研究中，將[Dmt1]DALDA加入到常用的心臟停搏液中(St.Thomas)來檢測(cè)在延長(zhǎng)的缺血之后，[Dmt1]DALDA是否能夠改善心臟的存活(體內(nèi)器官體外存活的模型)。
經(jīng)分離的豚鼠心臟用氧化的Krebs-Henseleit溶液于34℃以逆行的方式灌注。穩(wěn)定30分鐘后，心臟用含有或不含有100nM[Dmt1]DALDA的心臟停搏液CPS(St.Tohomas)灌注3分鐘。接著通過完全阻斷冠狀動(dòng)脈灌注90分鐘以引發(fā)全身缺血。隨后用氧化的Krebs-Henseleit溶液進(jìn)行60分鐘再灌注。整個(gè)試驗(yàn)中連續(xù)監(jiān)測(cè)收縮力、心率和冠狀動(dòng)脈流速。
心臟停搏液中加入[Dmt1]DALDA顯著改善了延長(zhǎng)的缺血之后的收縮功能(圖6)。
權(quán)利要求
1.一種在有需要的哺乳動(dòng)物中減少經(jīng)歷線粒體通透性改變(MPT)的線粒體數(shù)量或防止線粒體通透性改變的方法，所述方法包括給予哺乳動(dòng)物有效量的芳香族陽(yáng)離子肽，所述芳香族陽(yáng)離子肽具有(a)至少一個(gè)凈正電荷；(b)最少4個(gè)氨基酸；(c)最多大約20個(gè)氨基酸；(d)所述凈正電荷數(shù)的最小數(shù)目(pm)與所述氨基酸殘基的總數(shù)(r)之間的關(guān)系為，其中3pm是小于或等于r+1的最大數(shù)；以及(e)所述芳香基團(tuán)的最小數(shù)目(a)和凈正電荷總數(shù)(pt)之間的關(guān)系為其中2a是小于或等于pt+1的最大數(shù)，除非當(dāng)a是1時(shí)，pt也可以是1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中2pm是小于或等于r+1的最大數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中a等于pt。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽具有最少2個(gè)正電荷。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽具有最少3個(gè)正電荷。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽是水溶性的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽包括一個(gè)或多個(gè)D-氨基酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述氨基酸的C-末端羧基在所述的C-末端被酰胺化。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽包括一個(gè)或多個(gè)非天然存在的氨基酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽具有最少4個(gè)氨基酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽具有最多約12個(gè)氨基酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽具有最多約9個(gè)氨基酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽具有最多約6個(gè)氨基酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽具有μ-阿片樣物質(zhì)受體激動(dòng)劑活性。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽不具有μ-阿片樣物質(zhì)受體激動(dòng)劑活性。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述肽具有分子式D-精氨酸-Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述肽包括在N-末端的酪氨酸殘基。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述肽包括在N-末端的2’，6’-二甲基酪氨酸殘基。
19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述肽包括在N-末端的D-精氨酸殘基。
20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述肽包括在N-末端的苯丙氨酸氨酸殘基。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述肽包括在N-末端的2’，6’-二甲基苯丙氨酸殘基。
22.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述肽具有分子式酪氨酸-D-精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-NH2(DALDA)。
23.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述肽具有分子式2’，6’-Dmt--D-精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-NH2(Dmt1-DALDA)。
24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述肽具有分子式苯丙氨酸-D-精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-NH2(Phe1-DALDA)。
25.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述肽具有分子式2’，6’-Dmp-D-精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-NH2(Dmp1-DALDA)。
26.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽經(jīng)口服給藥。
27.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽經(jīng)局部給藥。
28.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽經(jīng)鼻內(nèi)給藥。
29.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽經(jīng)全身給藥。
30.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述肽經(jīng)靜脈內(nèi)給藥。
31.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽經(jīng)皮下給藥。
32.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽經(jīng)肌肉內(nèi)給藥。
33.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽經(jīng)腦室內(nèi)給藥。
34.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽經(jīng)鞘內(nèi)給藥。
35.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽經(jīng)透皮給藥。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述透皮給藥采用離子電滲療法。
37.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物正在經(jīng)受局部缺血。
38.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物正在經(jīng)受再灌注。
39.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物正在經(jīng)受缺氧。
40.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述局部缺血是由中風(fēng)造成的。
41.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述局部缺血是腸局部缺血。
42.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述局部缺血存在于肌肉組織中。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述肌肉組織是心肌組織。
44.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述肌肉組織是骨骼肌組織。
45.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述肌肉組織是平滑肌組織。
46.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物正在經(jīng)受缺氧。
47.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物正在患神經(jīng)退行性疾病或病癥。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述神經(jīng)退行性疾病或病癥是帕金森氏癥。
49.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述神經(jīng)退行性疾病或病癥是阿爾茨海默氏癥。
50.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述神經(jīng)退行性疾病或病癥是亨廷頓氏癥。
51.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述神經(jīng)退行性疾病或病癥是肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)。
52.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物正在經(jīng)受藥物誘發(fā)的MPT。
53.依據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人類。
54.一種在哺乳動(dòng)物的離體器官中減少經(jīng)歷線粒體通透性改變(MPT)的線粒體數(shù)量或阻止線粒體通透性改變的方法，所述方法包括給予所述離體器官有效量的芳香族陽(yáng)離子肽，所述芳香族陽(yáng)離子肽具有(a)至少一個(gè)凈正電荷；(b)最少4個(gè)氨基酸；(c)最多大約20個(gè)氨基酸；(d)凈正電荷數(shù)的最小數(shù)目(pm)與氨基酸殘基的總數(shù)(r)之間的關(guān)系為其中3pm是小于或等于r+1的最大數(shù)；以及(e)所述芳香基團(tuán)的最小數(shù)目(a)與所述凈正電荷的總數(shù)(pt)之間的關(guān)系為其中2a是小于或等于pt+1的最大數(shù)，除非當(dāng)a是1時(shí)，pt也可以是1。
55.一種在需要的哺乳動(dòng)物中減少經(jīng)歷線粒體通透性改變(MPT)的線粒體數(shù)量或阻止線粒體通透性改變的方法，所述方法包括給予所述哺乳動(dòng)物有效量的芳香族陽(yáng)離子肽，所述芳香族陽(yáng)離子肽具有(a)至少一個(gè)凈正電荷；(b)最少3個(gè)氨基酸；(c)最多大約20個(gè)氨基酸；(d)凈正電荷數(shù)的最小數(shù)目(pm)與氨基酸殘基的總數(shù)(r)之間的關(guān)系為其中3pm是小于或等于r+1的最大數(shù)；以及(e)所述芳香基團(tuán)的最小數(shù)目(a)與所述凈正電荷的總數(shù)(pt)之間的關(guān)系為其中3a是小于或等于pt+1的最大數(shù)，除非當(dāng)a是1時(shí)，pt也可以是1。
56.一種在哺乳動(dòng)物的離體器官中減少經(jīng)歷線粒體通透性改變(MPT)的線粒體數(shù)量或阻止線粒體通透性改變的方法，所述方法包括給予所述離體器官有效量的芳香族陽(yáng)離子肽，所述芳香族陽(yáng)離子肽具有(a)至少一個(gè)凈正電荷；(b)最少3個(gè)氨基酸；(c)最多大約20個(gè)氨基酸；(d)凈正電荷數(shù)的最小數(shù)目(pm)與氨基酸殘基的總數(shù)(r)之間的關(guān)系為其中3pm是小于或等于r+1的最大數(shù)；以及(e)所述芳香基團(tuán)的最小數(shù)目(a)與所述凈正電荷的總數(shù)(pt)之間的關(guān)系為其中3a是小于或等于pt+1的最大數(shù)，除非當(dāng)a是1時(shí)，pt也可以是1。
57.一種具有序列D-精氨酸-Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2的肽。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種減少或防止線粒體通透性改變的方法。該方法包括給予有效量的芳香族陽(yáng)離子肽，該肽具有至少一個(gè)凈正電荷；最少四個(gè)氨基酸；最多約二十個(gè)氨基酸；凈正電荷的最小數(shù)目(p
文檔編號(hào)C07K5/00GK1787831SQ200480009297
公開日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2004年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月4日
發(fā)明者黑茲爾·H·塞托, 趙克勝, 彼得·W·席勒 申請(qǐng)人:科內(nèi)爾研究基金會(huì), 蒙特利爾臨床研究學(xué)院