專利名稱：一種利用大氣壓冷等離子體提高細胞膜通透性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于冷等離子體技術(shù)在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，特別涉及利用大氣壓冷等離子體提高細胞膜通透性的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
等離子體是物質(zhì)的第四態(tài)，放電過程可以產(chǎn)生大量高能電子、離子、分子、中性原子、激發(fā)態(tài)原子、光子和自由基，具有高度的物理和化學(xué)活性。大氣壓冷等離子體可以在大氣壓下通過氣體放電獲得，整個體系溫度接近室溫，具有作用效果顯著、低能耗、無毒性等優(yōu)點，因而在生物領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。細胞膜是包圍細胞質(zhì)的一層半透性薄膜，其主要性狀之一是選擇通透性。細胞膜通透性的提高有利于細胞與周圍環(huán)境之間的物質(zhì)交換、能量轉(zhuǎn)換和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。通常提高細胞膜通透性的方法包括物理方法(如電處理、超聲波、滲透壓等)和化學(xué)方法(如添加吐溫、C16-18飽和脂肪酸、青霉素等)。但是，這些方法往往存在作用效果不明顯、成本高、后處理不便等問題。本發(fā)明采用大氣壓冷等離子體這種條件溫和且能量密度較高的方法對微生物細胞膜進行處理，可以高效、方便的提高細胞膜的通透性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過采用大氣壓冷等離子體中的介質(zhì)阻擋放電等離子體作用于微生物細胞懸浮液，利用了大氣壓冷等離子體具有的條件溫和且能量密度高的特點，達到了提高細胞膜通透性的目的，其具體操作步驟如下將微生物細胞懸浮液載于石英載片上，將載片置于大氣壓冷等離子體發(fā)生器的放電區(qū)，放電區(qū)金屬電極的間距為1 12mm，外加電壓0. 5 100kV，頻率0 50MHz，作用時間為IOs 25min，作用溫度為15 45°C ；其中，放電區(qū)的工作氣體為下述一種或幾種的混
合物空氣、氮氣、氬氣、氦氣。當(dāng)上述操作條件為下述值時，處理的效果較佳當(dāng)電極間距為3 4mm，外加電壓為12kV，頻率設(shè)定為20MHz，作用時間為30s 240s,作用溫度為25°C，工作氣體為空氣時，提高細胞膜通透性的效果較佳。當(dāng)上述電極為下述的一種銅、鋁、不銹鋼，尤其是不銹鋼的時候，效果較佳。當(dāng)上述電極是平板型或同軸型，尤其是平板型的時候，效果較佳。當(dāng)上述微生物為原核微生物或真核微生物時，細胞懸浮液中的細胞個數(shù)為 1 X IO5 1 X IO9個/mL，效果均較佳。當(dāng)上述原核微生物為克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，細胞懸浮液中的細胞個數(shù)為1 X IO7個/mL時，效果較佳。當(dāng)上述真核微生物為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，細胞懸浮液中的細胞個數(shù)為5 X IO5個/mL，效果較佳。當(dāng)上述細胞懸浮液按下述方法制備時，效果較佳在無菌條件下，將培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液收集、8000 10000r/min，0 4°C，離心20 30min后所得沉淀用0. 05mol/L的磷酸鉀緩沖液洗滌兩次后，再用磷酸鉀緩沖液稀釋制得，其中，所述磷酸鉀緩沖液的濃度為 0. 05mol/L, pH 為 7. 0。本發(fā)明中涉及到的微生物細胞培養(yǎng)及微生物細胞懸浮液的制備方法，均屬于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)和常規(guī)實驗?zāi)軌蛲瓿傻?，因此在實現(xiàn)獲得培養(yǎng)至對數(shù)期微生物并稀釋至上述濃度范圍的前提下，可通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的種類、微生物接種的量、培養(yǎng)溫度、或改變其他培養(yǎng)條件來實現(xiàn)。有益效果本發(fā)明具有操作簡單、無毒性、高效性的特點。不會引發(fā)微生物細胞完全失活，并可以達到提高微生物細胞膜通透性的效果。
具體實施例方式下述非限制性實施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。下述實施例中所述試驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得，或可以常規(guī)方法制備。以下結(jié)合大氣壓介質(zhì)阻擋放電等離子體處理原核微生物克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) ^lRMMWL^^iMW1^ (Saccharomyces cerevisiae)。Luria-Bertani (LB)胰蛋白胨=IOg ；酵母粉:5g ；氯化鈉=IOg ；加水調(diào)至IL并調(diào)pH至7. 0后，121°C滅菌后冷卻備用。LB固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加15g/L瓊脂粉。酵母浸出粉胨葡萄糖(Yeast Peptone Dextrose, YPD)培養(yǎng)基酵母膏IOg ；蛋白胨20g ；葡萄糖20g ；溶于IOOOml水中，115°C滅菌后冷卻備用。YPD固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加20g/L瓊脂粉。實施例1大氣壓冷等離子體提高克雷伯氏菌細胞膜的通透性一.所用菌種克雷伯氏菌，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，菌種保藏號是1.6366。二.實驗步驟1.細胞培養(yǎng)將克雷伯氏菌接種于Luria-Bertani培養(yǎng)基，接種量為體積百分含量1%，搖床轉(zhuǎn)速為170r/min，溫度為37°C，培養(yǎng)時間為10h。2.細胞懸浮液的制備將培養(yǎng)至OD值為2. 0菌液收集，在無菌條件下8000r/min， 4°C，離心30min，沉淀用0. 05mol/L、pH 7. 0的磷酸鉀緩沖液洗滌兩次后，再離心，將沉淀制成菌懸液，菌懸液中菌體細胞個數(shù)IX IO7個/mL，4°C保存?zhèn)溆谩⑽⑸锛毎麘腋∫狠d于石英載片，然后置于等離子體放電區(qū)下電極正中進行處理。3.根據(jù)需要設(shè)定大氣壓介質(zhì)阻擋放電等離子體發(fā)生器的工作氣體為空氣，工作參數(shù)為電極間距為4mm，外加電壓12kV，頻率20MHz，電極為不銹鋼平板電極，作用溫度25°C。4.使用大氣壓介質(zhì)阻擋放電等離子體對克雷伯氏菌細胞懸浮液進行處理，處理時間分別為 Os，30s，60s，90s，120s。5.將等離子體處理的菌液用0. 05mol/L、pH7. 0的磷酸鉀緩沖液稀釋IO5 IO7倍， 涂布于LB固體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)時間12h，數(shù)菌落數(shù)，計算存活率。
6.對大氣壓介質(zhì)阻擋放電等離子體發(fā)生器處理的克雷伯氏菌細胞，根據(jù)菌體存活率調(diào)整不同處理時間的菌液濃度，使OD值均為2.0，然后檢測細胞膜的通透性。7.對大氣壓介質(zhì)阻擋放電等離子體發(fā)生器處理的克雷伯氏菌細胞，根據(jù)菌體存活率調(diào)整不同處理時間的菌液濃度，使OD值均為2. 0，然后接種于LB液體培養(yǎng)基，以檢測其活性及在生長過程中的細胞膜通透性變化。8.檢測方法如下(1)菌液濃度測定采用分光光度計法在650nm檢測吸光值。待測樣品濃度均用 0. 05mol/L、pH 7. 0的磷酸鉀緩沖液稀釋為吸光值為2. 0。(2)細胞膜通透性測定采用二乙酸熒光素(Fluorescein diacetate, FDA)染色 [1]，通過熒光分光光度計檢測熒光強度(最大激發(fā)光波長^9nm，發(fā)射光波長517nm)。所得樣品熒光強度與對照組熒光強度相比，即為相對熒光強度。(3)存活率計算通過平板計數(shù)法計數(shù)不同處理時間菌體存活個數(shù)，根據(jù)公式計算菌體存活率菌體存活率=處理菌液存活細胞數(shù)/對照組細胞數(shù)X 100%對比經(jīng)過不同時間的大氣壓介質(zhì)阻擋放電等離子體處理后的克雷伯氏菌細胞和對照細胞的菌體存活率，如表1所示，隨處理時間延長，菌體存活率有輕微的減少，但是 60%以上的大部分菌細胞還是處于存活狀態(tài)。表1經(jīng)不同時間大氣壓冷等離子體處理克雷伯氏菌的存活率
權(quán)利要求
1.一種利用大氣壓冷等離子體提高細胞膜通透性的方法，用大氣壓冷等離子體作用于微生物細胞懸浮液，其特征在于所述的作用方式為，將微生物細胞懸浮液載于石英載片， 置于等離子體放電區(qū)，放電區(qū)金屬電極間距為1 12mm，外加電壓0. 5 100kV，頻率0 50MHz，作用時間為IOs 25min，作用溫度為15 45°C ；其中，放電區(qū)的工作氣體為下述一種或幾種的混合物空氣、氮氣、氬氣、氦氣。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種方法，其特征在于所述的電極間距為3 4mm，外加電壓12kV，頻率20MHz，作用時間為30s 240s，作用溫度為25°C，工作氣體為空氣。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種方法，其特征在于所述電極是下述的一種銅、鋁、 不銹鋼。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種方法，其特征在于所述電極是不銹鋼。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的一種方法，其特征在于所述電極是平板型或同軸型。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種方法，其特征在于所述電極是平板型。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的一種方法，其特征在于所述微生物為原核微生物或真核微生物，細胞懸浮液中的細胞個數(shù)為IX IO5 IX IO9個/mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種方法，其特征在于所述的原核微生物為克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumoniae)，細胞懸浮液中的細胞個數(shù)為lX107f/mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種方法，其特征在于所述的真核微生物為釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)，細胞懸浮液中的細胞個數(shù)為5 X IO5個/mL。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的一種方法，其特征在于細胞懸浮液的制備方法為，在無菌條件下，將培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液收集、8000 10000r/min，0 4°C，離心20 30min、用 0. 05mol/L，磷酸鉀緩沖液洗滌兩次后，用磷酸鉀緩沖液稀釋制得，其中，所述磷酸鉀緩沖液的濃度為 0. 05mol/L, pH 為 7. 0。
全文摘要
本發(fā)明公開一種利用大氣壓冷等離子體發(fā)生器提高細胞膜通透性的方法，屬于冷等離子體技術(shù)在生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用。本發(fā)明采用間距為1～12mm的金屬電極，以空氣等氣體為放電氣體，石英板為放電介質(zhì)，在電壓0.5～100kV，頻率0～50MHz，溫度為15～45℃的條件下，作用10s～25min，對原核細胞和真核細胞進行處理，可高效、方便的提高細胞膜的通透性。利用這種低能耗，無毒性，效率高的大氣壓冷等離子體的方法來提高微生物細胞膜的通透性，可應(yīng)用于微生物發(fā)酵、分子生物學(xué)感受態(tài)細胞的制備以及輔助創(chuàng)傷給藥治療等領(lǐng)域。
文檔編號C12N13/00GK102321606SQ20111022226
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月4日
發(fā)明者劉婷婷, 董曉宇 申請人:大連大學(xué)