專利名稱：用于生產(chǎn)二肽基肽酶iv抑制劑和它的中間體的方法和化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)基于環(huán)丙基-稠合的吡咯烷的二肽基肽酶IV抑制劑的方法中的方法和化合物。還提供了用于不對(duì)稱還原性氨基化中間體化合物(S)-氨基-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸的方法，該中間體化合物被用于生產(chǎn)基于環(huán)丙基-稠合的吡咯烷的二肽基肽酶IV抑制劑。還提供了其他中間體化合物以及它們的生產(chǎn)方法。通過(guò)本發(fā)明的化合物和方法生產(chǎn)的二肽基肽酶IV抑制劑可用于治療糖尿病及其并發(fā)癥，高血糖癥，X綜合征，高胰島素血癥，肥胖和動(dòng)脈粥樣硬化和相關(guān)的疾病，以及免疫調(diào)節(jié)疾病和慢性炎性腸疾病。
背景技術(shù)：
二肽基肽酶IV是膜結(jié)合的非經(jīng)典絲氨酸氨肽酶，它定位于多種組織中，包括，但不局限于，腸，肝臟，肺和腎臟。這種酶還定位于循環(huán)的T-淋巴細(xì)胞上，在這里，它被稱作CD-26。二肽基肽酶IV負(fù)責(zé)內(nèi)源肽GLP-1(7-36)和胰高血糖素的體內(nèi)代謝切割，并且還在體外表現(xiàn)出針對(duì)諸如GHRH，NPY，GLP-2和VIP的其他肽的蛋白水解活性。
GLP-1(7-36)是在小腸中通過(guò)對(duì)胰高血糖素原進(jìn)行翻譯后加工產(chǎn)生的、具有29個(gè)氨基酸的肽。這種肽具有多種體內(nèi)作用。例如，GLP-1(7-36)能刺激胰島素分泌，并且抑制胰高血糖素分泌。這種肽能刺激飽腹感，并且延緩胃排空。通過(guò)連續(xù)輸注外源施用的GLP-1(7-36)業(yè)已被證實(shí)對(duì)糖尿病患者是有效的。不過(guò)，對(duì)于連續(xù)治療用途來(lái)說(shuō)，所述外源肽降解的太快了。
業(yè)已開(kāi)發(fā)出了二肽基肽酶IV的抑制劑，以便提高GLP-1(7，36)的內(nèi)源水平。美國(guó)專利號(hào)6,395,767公開(kāi)了基于環(huán)丙基-稠合的吡咯烷的二肽基肽酶IV抑制劑。用于化學(xué)合成所述抑制劑的方法公開(kāi)于美國(guó)專利號(hào)6,395,767以及相關(guān)文獻(xiàn)中。例如，參見(jiàn)Sagnard等Tet-Lett.1995363148-3152；Tverezovsky等Tetrahedron19975314773-14792；和Hanessian等Bioorg.Med.Chem.Lett.199882123-2128。公開(kāi)于美國(guó)專利號(hào)6,395,767中的優(yōu)選抑制劑是(1S，3S，5S)-2-[(2S)-2-氨基-2-(3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-1基)-1-氧代乙基]-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-3-腈苯甲酸鹽(1∶1)，正如在式M中所示出的 以及相應(yīng)的游離堿，(1S，3S，5S)-2-[(2S)-2-氨基-2-(3-羥基-三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-1-基)-1-氧代乙基]-2-氮雜二環(huán)-[3.1.0]己烷-3-腈(M′)和它的一水合物(M″)
游離堿M′或它的一水合物M″。
適合用于制備用來(lái)生產(chǎn)這種二肽基肽酶IV抑制劑的中間體的方法公開(kāi)于EP 0 808 824 A2中。還可參見(jiàn)Imashiro和Kuroda，Tetrahedron Letters 2001421313-1315，Reetz等Chem.Int.Ed.Engl.19791872，Reetz和Heimbach，Chem.Ber.19831163702-3707，Reetz等Chem.Ber.19831163708-3724。
本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)基于環(huán)丙基-稠合的吡咯烷的二肽基肽酶IV抑制劑的新生產(chǎn)方法和化合物。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供可用作生產(chǎn)基于環(huán)丙基-稠合的吡咯烷的二肽基肽酶IV抑制劑的中間體的化合物。
在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的中間體包括具有式IA的化合物 其中R1選自H和OH；R2選自-C(＝O)-COR4，-C(＝O)NR5R6，-C(X)n-COR4和-C-NR7R8COR4，其中X是鹵素；n是1-2R4選自O(shè)-烷基，NH2和OH；和R5，R6，R7和R8分別選自H和COOR9，其中，R9是取代過(guò)的或未取代過(guò)的烷基；和
R3選自H，OH和R10，其中，R10是NHR11C(＝O)R12，R11是R13COOH，R12是 且R13是烷基或芳基。
可用作生產(chǎn)基于環(huán)丙基-稠合的吡咯烷的二肽基肽酶IV抑制劑的中間體的本發(fā)明式IA的示例性優(yōu)選化合物包括3-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸甲酯如式I所示， 3-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸，如式II所示，
(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸，如式V所示， (＜aS)-＜a[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸，如式VI所示，
(或它的DABCO鹽VIA)，金剛烷-1-基-二氯-乙酸甲酯，如式VII所示， 二氯-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸甲酯，如式VIII所示，和 二氯-(3-羥基-金剛烷-1-基-乙酸，如式IX所示 在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的中間體包括化合物4，5-二氫-1H-吡咯-1，5-二羧酸[1-(1，1-二甲基乙基)，5-乙基]酯，如式III所示，
其中R1選自O(shè)-烷基，NH2和OH，和R2選自t-BOC和CBz；和(5S)-5-氨基羰基-4，5-二氫-1H-吡咯-1-羧酸1-(1，1-二甲基乙基)酯，如式IV所示， 在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述化合物被用作生產(chǎn)二肽基肽酶IV抑制劑(1S，3S，5S)-2-[(2S)-2-氨基-2-(3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-1-基)-1-氧代乙基]-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-3-腈苯甲酸鹽(1∶1)的中間體，如式M所示
或它的游離堿M′(如上文所述)，和它的一水合物M″ 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于生產(chǎn)基于環(huán)丙基-稠合的吡咯烷的二肽基肽酶IV抑制劑的方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所生產(chǎn)的抑制劑是(1S，3S，5S)-2-[(2S)-2-氨基-2-(3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-1-基)-1-氧代乙基]-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-3-腈苯甲酸鹽(1∶1)及其相應(yīng)的游離堿，分別如式M和M′所示。所述抑制劑最終是通過(guò)偶聯(lián)兩種片段形成的，即，如式V所示的(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸，
和(1S，3S，5S)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-3-甲酰胺酸式鹽，如鹽酸鹽或甲磺酸鹽(甲磺?；騇SA鹽)，如在式J中所示出的 本文公開(kāi)了根據(jù)被選擇用作原材料的中間體化合物生產(chǎn)并且偶聯(lián)所述片段的各種方法。例如，在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，提供了用如式II所示的3-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸生產(chǎn)基于環(huán)丙基-稠合的吡咯烷的抑制劑的方法。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中提供了用具有式V的(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸生產(chǎn)基于環(huán)丙基-稠合的吡咯烷的抑制劑的方法。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，提供了用具有式VI的(＜aS)-＜a[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸生產(chǎn)基于環(huán)丙基-稠合的吡咯烷的抑制劑的方法。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，提供了用具有式IV的(5S)-5-氨基羰基-4，5-二氫-1H-吡咯-1-羧酸1-(1，1-二甲基乙基)酯生產(chǎn)基于環(huán)丙基-稠合的吡咯烷的抑制劑的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于合成可用于生產(chǎn)基于環(huán)丙基-稠合的吡咯烷的抑制劑的中間體的方法。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，提供了對(duì)3-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式II)進(jìn)行不對(duì)稱還原性氨基化作用或轉(zhuǎn)氨基作用，以便形成(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式V)的方法。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，提供了用三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式N)化學(xué)合成(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式V)的方法。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，提供了用金剛烷-1-基-二氯-乙酸甲酯(式VII)，二氯-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸甲酯(式VIII)和二氯-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸(式IX)生產(chǎn)3-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式II)的方法。還提供了用于生產(chǎn)金剛烷-1-基-二氯-乙酸甲酯(式VII)，二氯-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸甲酯(式VIII)和二氯-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸(式IX)的方法。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，提供了用4，5-二氫-1H-吡咯-1，5-二羧酸[1-(1，1-二甲基乙基)，5-乙基]酯(式III)生產(chǎn)(5S)-5-氨基羰基-4，5-二氫-1H-吡咯-1-羧酸1-(1，1-二甲基乙基)酯(式IV)的方法。在本實(shí)施方案中，隨后可以將(5S)-5-氨基羰基-4，5-二氫-1H-吡咯-1-羧酸1-(1，1-二甲基乙基)酯(式(IV)用作生產(chǎn)[1S-(1＜a，3＜b，5＜a)-3-氨基羰基]-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-2-羧酸1，1-二甲基乙酯(式H)的中間體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種細(xì)胞系，所述細(xì)胞系能夠通過(guò)對(duì)3-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式II)進(jìn)行不對(duì)稱還原性氨基化作用或轉(zhuǎn)氨基作用生產(chǎn)(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.12，7]癸烷-1-乙酸(式V)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞系包括含有能表達(dá)甲酸脫氫酶和苯丙氨酸脫氫酶的質(zhì)粒的細(xì)胞。最優(yōu)選的細(xì)胞系是ATCC保藏號(hào)為PTA-4520的細(xì)胞系。
發(fā)明詳述基于環(huán)丙基-稠合的吡咯烷的化合物，如(1S，3S，5S)-2[(2S)-2-氨基-2-(3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-1-基)-1-氧代乙基]-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-3-腈苯甲酸鹽(1∶1)及其相應(yīng)的游離堿和它的一水合物是二肽基肽酶IV抑制劑，可用于治療糖尿病及其并發(fā)癥，高血糖癥，X綜合征，高胰島素血癥，肥胖和動(dòng)脈粥樣硬化和相關(guān)的疾病，以及免疫調(diào)節(jié)疾病和慢性炎性腸疾病。在本發(fā)明中，提供了用于生產(chǎn)基于環(huán)丙基-稠合的吡咯烷的化合物的新化合物和方法，所述基于環(huán)丙基-稠合的吡咯烷的化合物如(1S，3S，5S)-2-[(2S)-2-氨基-2-(3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-1-基)-1-氧代乙基]-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-3-腈苯甲酸鹽(1∶1)及其相應(yīng)的游離堿和它的一水合物。
所述二肽基肽酶IV抑制劑(1S，3S，5S)-2-[(2S)-2-氨基-2-(3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-1-基)-1-氧代乙基]-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-3-腈苯甲酸鹽(1∶1)，如式M所示 并且優(yōu)選下面所示出的相應(yīng)的游離堿式M′或前面所述的它的一水合物M″。
在本發(fā)明中，提供了通過(guò)組裝兩個(gè)片段來(lái)生產(chǎn)(1S，3S，5S)-2-[(2S)-2-氨基-2-(3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-1-基)-1-氧代乙基]-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-3-腈(式M′)的方法。所述片段是在式V中示出的(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸， 以及(1S，3S，5S)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-3-甲酰胺的酸式鹽，如在式J中所示出的鹽酸鹽或MSA鹽
本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)所述片段的方法，以及可用于生產(chǎn)所述片段的中間體化合物。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，通過(guò)對(duì)中間體化合物3-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式II)進(jìn)行還原性氨基化作用或轉(zhuǎn)氨基作用，生產(chǎn)片段(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式V)的方法。在該方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)還原性氨基化作用將3-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式II)轉(zhuǎn)化成(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式V)，這是通過(guò)用對(duì)酮酸有活性的苯丙氨酸脫氫酶或其他氨基酸脫氫酶通過(guò)酶促方式進(jìn)行的?？捎糜诒景l(fā)明的示例性的苯丙氨酸脫氫酶包括，但不局限于，來(lái)自芽孢八疊球菌屬(Sporosarcina)物種的苯丙氨酸脫氫酶或來(lái)自諸如中間型高溫放線菌(Thermoactinomycesintermedius)的高溫放線菌屬(Thermoactinomyces)物種的苯丙氨酸脫氫酶。還原性氨基化作用優(yōu)選是用在大腸桿菌(Escherichiacoli)或巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)中表達(dá)的中間型高溫放線菌ATCC 33205的苯丙氨酸脫氫酶進(jìn)行的。能表達(dá)中間型高溫放線菌ATCC 33205苯丙氨酸脫氫酶的大腸桿菌和巴斯德畢赤氏酵母的重組菌株的構(gòu)建和生長(zhǎng)業(yè)已由Hanson等公開(kāi)(Enzyme andMicrobial Technology 2000 26348-358)。在甲醇上生長(zhǎng)巴斯德畢赤氏酵母還可以誘導(dǎo)甲酸脫氫酶的產(chǎn)生(Hanson等Enzyme andMicrobial Technology 2000 26348-358)。
包括能表達(dá)巴斯德畢赤氏酵母(ATCC 20864)甲酸脫氫酶和修飾形式的中間型高溫放線菌(ATCC 33205)苯丙氨酸脫氫酶基因的大腸桿菌細(xì)胞，按照布達(dá)佩斯條約(Budapest Treaty)的規(guī)定由國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)(International Depository Authority)進(jìn)行了保藏和承認(rèn)。保藏是于2002年6月25日在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行的，該保藏中心的地址是10801 University Boulevard in Manassas，Virginia 20110-2209。ATCC保藏號(hào)為PTA-4520。在本專利申請(qǐng)授權(quán)之后，對(duì)公眾獲得該細(xì)胞系的所有限制都將被不可撤回地去除。該保藏物從保藏日期開(kāi)始計(jì)算，將在公共保藏機(jī)構(gòu)保存30年時(shí)間，或者在最后要求樣品之后再保存5年時(shí)間或者為專利可實(shí)施的期限，取三者最長(zhǎng)的時(shí)間。上述細(xì)胞系在保存時(shí)是活的。如果所述保藏機(jī)構(gòu)不能分配活的樣品的話，可以更換所述保藏物。
在下面的方案I中示出了將3-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式II)轉(zhuǎn)化成(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式V)的還原性氨基化作用。
方案I 如方案I所示，該反應(yīng)需要氨和還原的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。在該反應(yīng)中產(chǎn)生的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)被再循環(huán)成NADH，這通過(guò)由甲酸脫氫酶將甲酸氧化成二氧化碳來(lái)實(shí)現(xiàn)。來(lái)自該反應(yīng)的(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式V)的預(yù)期收率為80-100％，并且預(yù)期的對(duì)映體過(guò)量超過(guò)99％。還可參見(jiàn)本文的實(shí)施例1至10。
相同的轉(zhuǎn)化還可以通過(guò)使用轉(zhuǎn)氨酶實(shí)現(xiàn)，正如在下面的方案II中所示出的方案II
如方案II所示，在這種酶促轉(zhuǎn)化作用中，谷氨酸起著氨基供體的作用。用于該轉(zhuǎn)化的示例性的轉(zhuǎn)氨酶是如本文的實(shí)施例11所述的支鏈轉(zhuǎn)氨酶。
在另一種實(shí)施方案中，(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式V)是化學(xué)合成的。用于化學(xué)合成(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式V)的示例性方法如下面的方案III所示方案III 如方案III所示，(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式V)的外消旋混合物是用三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式N)化學(xué)合成的，這通過(guò)首先將三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸溴化成α-溴代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式O)來(lái)實(shí)現(xiàn)。在該溴化反應(yīng)中，將原材料三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式N)懸浮在亞硫酰氯中。然后添加二甲基甲酰胺(DMF)，并且在室溫下攪拌該懸浮液1.5小時(shí)。通過(guò)氣相層析證實(shí)所述反應(yīng)的完成。然后將固體N-溴代琥珀酐(NBS)逐份地添加到所述反應(yīng)混合物中，并且將所述反應(yīng)混合物加熱到60℃。將溫度保持在60-65℃，同時(shí)攪拌反應(yīng)物3小時(shí)。同樣通過(guò)氣相層析證實(shí)反應(yīng)的完成。然后將庚烷添加到所述所述反應(yīng)混合物中，并且在78-80℃下蒸餾掉多余的亞硫酰氯。添加水終止該反應(yīng)，并且添加額外的庚烷。然后使水層與所述有機(jī)層分離，并且用水洗滌所述有機(jī)層。在洗滌之后，將額外的水添加到所述庚烷層中，并且將庚烷蒸餾掉，然后將四氫呋喃(THF)添加到剩余的水層中，并且在室溫下劇烈攪拌該混合物若干小時(shí)。可以添加額外的水，以便加速這一水解過(guò)程。然后將THF蒸餾掉，剩下雙相(水和油)反應(yīng)混合物。然后添加晶種(Seed)，并且讓反應(yīng)物達(dá)到室溫，同時(shí)以粗粒(heavy solid)形式產(chǎn)生了α-溴代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式O)。添加水和乙腈，以便保持該懸浮液可以攪動(dòng)。在攪拌若干小時(shí)之后，將含有α-溴代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式O)的固體過(guò)濾掉，并且用乙腈洗滌若干次。也參見(jiàn)本文的實(shí)施例17。
然后讓?duì)?溴代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式O)與H2SO4和HNO3起反應(yīng)，以便產(chǎn)生α-溴代-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式Q)。更具體地講，α-溴代-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式Q)是用α-溴代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式O)制備的，這通過(guò)首先用H2SO4填充錐形瓶來(lái)實(shí)現(xiàn)。然后在冰浴中冷卻所述燒瓶，并且將50％HNO3添加到所述燒瓶中。然后將固體α-溴代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式O)逐份添加到該混合物中，將溫度保持在28℃以下。然后將反應(yīng)混合物加熱到60℃，同時(shí)攪拌，直到獲得清澈溶液。在反應(yīng)完成時(shí)，將它冷卻到室溫并且保持在室溫下。然后添加水，以便終止反應(yīng)。在冰浴中冷卻所得到的漿，然后過(guò)濾，以便獲得α-溴代-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式Q)。還可參見(jiàn)本文的實(shí)施例18。
然后將α-溴代-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式Q)溶解在氫氧化銨中，優(yōu)選30％氫氧化銨，并且優(yōu)選將所述反應(yīng)混合物加熱到65℃。然后將所述反應(yīng)混合物濃縮成固體。然后添加EtOH，并且再次濃縮反應(yīng)混合物，以便產(chǎn)生含有(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.133，7]癸烷-1-乙酸(式V)的外消旋混合物。還可參見(jiàn)本文的為了從所述外消旋混合物中分離(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式V的外消旋混合物)，通過(guò)一般的Boc保護(hù)，用Boc酐和氫氧化鈉在四氫呋喃中處理該混合物，以便產(chǎn)生α-[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-]3]羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(化合物R)。然后將α-[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-]3]羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(化合物R)與諸如[1R，2S]-(-)-1，2-二苯基羥基乙胺、1，7，7-三甲基二環(huán)[2.2.1]庚烷-2-胺或S-(-)-1-1(1-萘基)乙胺的手性堿混合，并且將混合物蒸發(fā)至干燥。將干燥的混合物重新懸浮在溶劑中，并且將重新懸浮的混合物放置在搖床上加熱若干小時(shí)。在冷卻到室溫之后，發(fā)生了(αS)-α-[[二甲基乙氧基]羰基]氨基)-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(化合物S)的結(jié)晶。還可參見(jiàn)本文的實(shí)施例20。
除掉Boc基團(tuán)，得到了(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13,7]癸烷-1-乙酸(式V)。
本發(fā)明的另一方面涉及用于生產(chǎn)中間體化合物3-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式II)的方法，該化合物被用于合成片段(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式V)。所述中間體化合物3-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式II)可以按照在方案IV中所示的方法生產(chǎn)。
方案IV
如方案IV所示，在該方法中，通過(guò)氯化鋅催化將溴化金剛烷(式A)烷基化，以便產(chǎn)生＜a-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式B)。然后用乙酰氯在甲醇中酯化＜a-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式B)，以便產(chǎn)生＜a-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸甲酯(式C)。然后通過(guò)Swern氧化作用將＜a-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸甲酯(式C)轉(zhuǎn)化成＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸甲酯(式D)。然后對(duì)＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸甲酯(式D)進(jìn)行羥基化，以便形成3-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸甲酯(式I)，然后對(duì)它進(jìn)行水解，以便形成3-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式II)。還可參見(jiàn)本文的實(shí)施例21至25。
另外，中間體化合物3-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式II)可以按照下面的方案V所示方法生產(chǎn)。
方案V
如方案V所示，(2，2-二氯-1-甲氧基-乙烯氧基)-三甲基硅烷1是通過(guò)對(duì)Kuroda等的方法進(jìn)行小的改進(jìn)制備的(EP 08 08 824A3；Imashiro和Kuroda，Tetrahedron Letters 2001 421313-1315)。在氯化鋅的影響下，用1處理溴代金剛烷(Reetz等Chem.Int.Ed.Engl.19791872，Reetz和Heimbach，Chem.Ber.19831163702-3707，Reetz等Chem.Ber.19831163708-3724)，得到了具有式VII的金剛烷-1-基-二氯-乙酸甲酯。然后在濃硫酸中用氧化氮對(duì)具有式VII的金剛烷-1-基-二氯-乙酸甲酯進(jìn)行羥基化，以便提供定量產(chǎn)量的具有式VIII的二氯-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸甲酯。在室溫下，在甲醇中用含水氫氧化鈉水解式VIII，以便產(chǎn)生具有式IX的二氯-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸。然后用弱堿，優(yōu)選碳酸氫鈉在較高溫度下處理二氯-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸(式IX)，專一地導(dǎo)致中間體化合物3-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式II)的形成。還可參見(jiàn)本文的實(shí)施例26至29。
方案VA 如方案VA所示，中間體化合物3-羥基-＜a-氧代三環(huán)-[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式II)可以用單罐(one pot)的方法制備。如所示的，在諸如氬氣的惰性氣氛中，在四氫呋喃中用含水氫氧化鈉(或諸如氫氧化鉀或氫氧化鋰的其他堿)處理式VIII化合物，得到相應(yīng)的鈉鹽。在不回收鈉鹽的情況下，用諸如鹽酸的酸處理含有鈉鹽的所述反應(yīng)混合物，以便將pH降低到低于大約0.50，優(yōu)選大約0.20，以便形成相應(yīng)的酮酸II，它能夠從水中再結(jié)晶，以便形成酮酸II的晶體。
本發(fā)明的另一方面涉及用于生產(chǎn)片段(1S，3S，5S)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-3-甲酰胺(式J)的方法。該片段被用于生產(chǎn)(1S，3S，5S)-2-[(2S)-2-氨基-2-(3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-1-基)-1-氧代乙基]-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-3-腈，它可以按照下面的方案VI中所示出的方法生產(chǎn)。
方案VI
如方案VI所示，首先酯化L-焦谷氨酸(式E)，以便產(chǎn)生L-焦谷氨酸乙酯(式F；SQ 7539)。然后在氮上對(duì)該L-焦谷氨酸乙酯進(jìn)行BOC-保護(hù)，以便產(chǎn)生(5S)-2-氧代吡咯烷-1，5-二羧酸[1-(1，1-二甲基乙基)，5-乙基]酯(式G)。然后進(jìn)行SuperHydride還原和消除，以便形成4，5-二氫-1H-吡咯-1，5-二羧酸[1-(1，1-二甲基乙基)，5-乙基]酯(式III)。然后通過(guò)用氫氧化鋰皂化水解BOC-DHPEE III，以便形成BOC-DHP。然后使用甲磺酰氯隨后再使用氨通過(guò)混合的酐在BOC-DHP上形成了酰胺，以便產(chǎn)生(5S)-5-氨基羰基-4，5-二氫-IH-吡咯-1-羧酸1-(1，1-二甲基乙基)酯(式IV)。然后通過(guò)Simmons-Smith反應(yīng)將(5S)-5-氨基羰基-4，5-二氫-1H-吡咯-1-羧酸1-(1，1-二甲基乙基)酯(式IV)環(huán)丙烷化，以便產(chǎn)生[1S-(1＜a，3＜b，5＜a)-3-氨基羰基]-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-2-羧酸1，1-二甲基乙酯(式H)。然后除掉BOC，導(dǎo)致了酸式鹽的形成，如片段(1S，3S，5S)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-3-甲酰胺(式J)的鹽酸鹽或甲磺酸鹽。還可參見(jiàn)本文的實(shí)施例29至35。
本發(fā)明的另一方面還在方案VI中示出，該方案涉及在Simmons-Smith反應(yīng)中通過(guò)環(huán)丙烷化將(5S)-5-氨基羰基-4，5-二氫-1H-吡咯-1-羧酸1-(1，1-二甲基乙基)酯(式IV)轉(zhuǎn)化成[1S-(1＜a，3＜b，5＜a)-3-氨基羰基]-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-2-羧酸1，1-二甲基乙酯(式H)。在該反應(yīng)中，將(5S)-5-氨基羰基-4，5-二氫-1H-吡咯-1-羧酸1-(1，1-二甲基乙基)酯在第一個(gè)反應(yīng)器中溶解于二氯甲烷中。在第二個(gè)反應(yīng)器中，將二氯甲烷冷卻到-30℃，并且添加二甲氧基乙烷和存在于甲苯中的30％的二乙基鋅溶液，然后添加二碘甲烷。然后將該混合物添加到第一個(gè)反應(yīng)器中，然后添加飽和的碳酸氫鹽溶液中。攪拌所得到的反應(yīng)混合物，直到形成沉淀。然后對(duì)所述沉淀進(jìn)行過(guò)濾，洗滌，并且重新懸浮在二氯甲烷中兩次或兩次以上。然后將濾液分離成水相和有機(jī)相，并且用半飽和的鹽水洗滌所述有機(jī)相。除去溶劑，并且通過(guò)庚烷進(jìn)行交換，以便獲得存在于庚烷中的漿狀粗制產(chǎn)物[1S-(1＜a，3＜b，5＜a)-3-氨基羰基]-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-2-羧酸1，1-二甲基乙酯(式H)。
另外，可以按照方案VIA制備(5S)-5-氨基羰基-4，5-二氫-1H-吡咯-1-羧酸1-(1，1-二甲基乙基)酯(式IV)。
方案VIA 如方案VIA所示，用諸如氫氧化鈉的堿金屬堿處理4，5-二氫-1H-吡咯-1，5-二羧酸1-(1，1-二甲基乙基)酯X的9CHA鹽，以便形成相應(yīng)的鹽，如鈉鹽。
4，5-二氫-1H-吡咯-1，5-二羧酸1-(1，1-二甲基乙基)酯XI的鈉鹽還可以用相應(yīng)的乙酯制備，這通過(guò)用乙醇和氫氧化鈉處理所述乙酯(優(yōu)選存在于甲苯中的所述乙酯的溶液)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
用諸如氯化銨和磷酸二氫鈉的緩沖液處理鈉鹽XI的溶液，以便將該溶液的pH降低到低于7，優(yōu)選大約6-6.5，并且用4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鎓氯化物(DMT-MM)處理所述緩沖的鈉鹽溶液，以便形成活化的DMT-酯XII，所述活化的PMT-酯XII用氨或其他堿，如硫酸銨，氯化銨或氫氧化銨進(jìn)行處理，以便形成(5S)-5-氨基羰基-4，5-二氫-1H-吡咯-1-羧酸1-(1，1-二甲基乙基)酯IV。
可以按方案VIA所示制備4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基-嗎啉鎓氯化物(DTM-MM)，這通過(guò)讓2-氯-4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪(CDMT)與N-甲基嗎啉在大約0至大約10℃的對(duì)比溫度(reduced temperature)下起反應(yīng)，以便形成DMT-MM。
4，5-二氫-1H-吡咯-1，5-二羧酸1-(1，1-二甲基乙基)酯X的DCHA鹽可以用相應(yīng)的鈉鹽XI制備，這通過(guò)用甲基叔丁酯(MTBE)處理前面制備的DCHA鹽X的水溶液來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中用諸如H3PO4的酸將所述反應(yīng)混合物的pH調(diào)節(jié)到2.5-3。分離所述有機(jī)層，并且用鹽水處理，以便形成相應(yīng)的鈉鹽XI。冷卻所得到的反應(yīng)混合物，并且用DCHA處理，以便形成相應(yīng)的DCHA鹽X。
方案VIB
方案VI的化合物H還可以按照方案VIB所示制備，這通過(guò)按以下方法對(duì)N-BOC 4，5-脫氫脯氨酸乙酯III進(jìn)行環(huán)丙烷化來(lái)實(shí)現(xiàn)。
在大約-30至大約0℃的對(duì)比溫度下，在存在諸如甲苯，二氯甲烷或二氯乙烷的無(wú)水有機(jī)溶劑的條件下，用二乙基鋅和氯碘甲烷處理N-BOC 4，5-脫氫脯氨酸乙酯III，以便形成N-BOC 4，5-亞甲基脯氨酸乙酯XV。
通過(guò)在諸如氮?dú)夥盏亩栊詺夥罩杏煤装诽幚?，分離所得到的BOC 4，5-亞甲基脯氨酸乙酯XV(順式和反式同分異構(gòu)體(8∶1)的混合物)，并且回收順(S)-BOC-4，5-亞甲基脯氨酸乙酯XVI(與XVII分離)。
在乙醇或其他有機(jī)溶劑，如甲苯或THF中，用諸如含水氫氧化鋰，氫氧化鈉或氫氧化鉀的堿處理s-BOC-4，5-亞甲基脯氨酸乙酯XVI，以便形成相應(yīng)的s-BOC-亞甲基脯氨酸游離酸XVIII。
通過(guò)如下方法將游離酸XVIII轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的s-BOC-亞甲基脯氨酸酰胺H，即在存在N-甲基嗎啉的條件下，在諸如不超過(guò)約-8℃的對(duì)比溫度下，處理溶解在諸如THF或二氯甲烷；氯甲酸異丁酯或甲磺酰氯的有機(jī)溶劑中的游離酸XVIII，然后用氨處理所述反應(yīng)混合物，以便形成s-BOC-亞甲基脯氨酸酰胺H。
本發(fā)明的另一方面涉及用于偶聯(lián)片段(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式V)和(1S，3S，5S)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-3-甲酰胺(式J)，以便產(chǎn)生(1S，3S，5S)-2-[(2S)-2-氨基-2-(3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-1-基)-1-氧代乙基]-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-3-腈苯甲酸鹽(1∶1)的方法。所述片段的偶聯(lián)如下面的方案VII所示。
方案VII 如方案VII所示，首先用BOC保護(hù)片段(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式V)，以便產(chǎn)生(＜aS)-＜a[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基)氨基]-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式VI)，這通過(guò)在存在諸如氫氧化鈉的堿的條件下用BOC2O處理V，并且通過(guò)乙酸乙酯(EtOAc)提取分離，以便分離出游離酸VI來(lái)實(shí)現(xiàn)。另外，作為乙酸乙酯的替代，還可以將乙酸異丙酯/庚烷用于使游離酸VI結(jié)晶。在另一種實(shí)施方案中，使用了具有式V的化合物，而不用從生物轉(zhuǎn)化中分離，其中使用如實(shí)施例8A中所述的分離的PDH/FDH酶濃縮物。
用甲磺酰氯(甲磺酰Cl)和Hunig堿(二異丙基乙胺或DIPEA)處理存在于諸如四氫呋喃(THF)的合適的有機(jī)溶劑中的式VI化合物的溶液(冷卻到大約-10至大約0℃)，以便形成相應(yīng)的VI的甲磺酸鹽。
在存在1-羥基苯并三唑(HOBT)或其他已知偶聯(lián)劑的條件下，通過(guò)偶聯(lián)反應(yīng)將(＜aS)-＜a[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式VI)甲磺酸鹽偶聯(lián)在(1S，3S，5S)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-3-甲酰胺(式J)上，以便產(chǎn)生3-(氨基羰基)-＜aS)-＜a-(3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-1-基)-＜b-氧代-(1S，3S，5S)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-2-乙烷氨基甲酸1，1-二甲基乙酯(式K)。通過(guò)用諸如吡啶或三乙胺和三氟乙酸酐的有機(jī)堿處理化合物K，對(duì)式K化合物進(jìn)行脫水，然后通過(guò)冷卻到大約0至大約10℃對(duì)該反應(yīng)物進(jìn)行水解，并且添加氫氧化鈉或諸如KOH或LiOH的其他強(qiáng)堿，以便形成化合物L(fēng)。然后對(duì)3-氰基-(＜aS)-＜a-(3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-1-基)-＜b-氧代-(1S，3S，5S)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-2-乙烷氨基甲酸1，1-二甲基乙酯(式L)進(jìn)行脫保護(hù)(并且用苯甲酸鈉處理)，以便形成二肽基肽酶IV抑制劑(1S，3S，5S)-2-[(2S)-2-氨基-2-(3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-1-基)-1-氧代乙基]-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-3-腈苯甲酸鹽(1∶1)(式M)。還可參見(jiàn)本文的實(shí)施例37至39。
方案VIIA
如方案VIIA所示，可以按以下方法用化合物VIA(DABCO鹽)制備化合物K。
用1，4-二氮雜二環(huán)[2，2，2]辛烷(DABCO)處理式VI酸，以便形成(＜aS)-＜a[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸1，4-二氮雜二環(huán)[2.2.2]辛烷鹽(式VIA)。在存在1-羥基苯并三唑(HOBT)或其他已知偶聯(lián)劑的條件下通過(guò)偶聯(lián)反應(yīng)(參見(jiàn)方案VIIA)將(＜aS)-＜a[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸1，4-二氮雜二環(huán)[2.2.2]辛烷鹽(式VIA)偶聯(lián)在(1S，3S，5S)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-3-甲酰胺HCl或MSA鹽(式J)上，以便產(chǎn)生3-(氨基羰基)-＜aS)-＜a-(3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-1-基)-＜b-氧代-(1S，3S，5S)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-2-乙烷氨基甲酸1，1-二甲基乙酯(式K)。
再參見(jiàn)方案VII，可以通過(guò)用諸如鹽酸的強(qiáng)酸處理對(duì)化合物L(fēng)進(jìn)行脫保護(hù)，正如方案VIIB所描述的。
方案VIIB
參見(jiàn)方案VIIB，可以按以下方法用BOC-保護(hù)的中間體L生產(chǎn)游離堿一水合物M″。
在存在二氯甲烷和甲醇的條件下用濃鹽酸處理BOC-保護(hù)的中間體L，同時(shí)將反應(yīng)溫度保持在大約20-25℃范圍內(nèi)，以便形成鹽酸鹽L′。用鹽酸處理鹽酸鹽L′，然后用氫氧化鈉或其他強(qiáng)堿處理，以便形成游離堿M′。然后用水處理游離堿M′，以便形成游離堿一水合物M″。
本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本公開(kāi)內(nèi)容之后可以理解，終產(chǎn)物二肽基肽酶IV抑制劑(1S，3S，5S)-2-[(2S)-2-氨基-2-(3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-1-基)-1-氧代乙基]-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-3-腈苯甲酸鹽(1∶1)(式M)或它的相應(yīng)的游離堿M′或它的一水合物M″可以使用在方案I，II或III和IV，V，VI，VII和VIIA中所示出的所有步驟或只是在方案I，II或III和IV，V，VI，VII和VIIA的任意一個(gè)中所示出的一部分步驟生產(chǎn)，這取決于哪一種中間體被選擇用作原材料。例如，采用本發(fā)明的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用具有式II的3-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸，具有式V的(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸，具有式VIA的(＜aS)-＜a[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸1，4-二氮雜二環(huán)[2.2.2]辛烷鹽或具有式IV的(5S)-5-氨基羰基-4，5-二氫-1H-吡咯-1-羧酸1-(1，1-二甲基乙基)酯作為原材料，按常規(guī)方法生產(chǎn)基于環(huán)丙基-稠合的吡咯烷的抑制劑(1S，3S，5S)-2-[(2S)-2-氨基-2-(3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-1-基)-1-氧代乙基]-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-3-腈苯甲酸鹽(1∶1)(式M)或相應(yīng)的游離堿M′。
因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以生產(chǎn)基于環(huán)丙基-稠合的吡咯烷的二肽基肽酶IV抑制劑，這只需要將(＜aS)-＜a[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式VI)(或它的DABCO鹽(式VIA))偶聯(lián)在(1S，3S，5S)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-3-甲酰胺(式J)上，以便產(chǎn)生3-(氨基羰基)-＜aS)-＜a-(3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-1-基)-＜b-氧代-(1S，3S，5S)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-2-乙烷氨基甲酸1，1-二甲基乙酯(式K)；使3-(氨基羰基)-＜aS)-＜a-(3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-1-基)-＜b-氧代-(1S，3S，5S)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-2-乙烷氨基甲酸1，1-二甲基乙酯(式K)脫水，以便產(chǎn)生3-氰基-(＜aS)-＜a-(3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-1-基)-＜b-氧代-(1S，3S，5S)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-2-乙烷氨基甲酸1，1-二甲基乙酯(式L)；并且水解3-氰基-(＜aS)-＜a-(3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-1-基)-＜b-氧代-(1S，3S，5S)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-2-乙烷氨基甲酸1，1-二甲基乙酯(式L)，以便形成二肽基肽酶IV抑制劑。在該方法中，所述原材料包括片段(＜aS)-＜a[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基)氨基)-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式VI)(或它的DABCO鹽(式VIA))和(1S，3S，5S)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-3-甲酰胺(式J)。
不過(guò)，所述方法還可以包括通過(guò)BOC保護(hù)用中間體(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式V)生產(chǎn)片段(＜aS)-＜a[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式VI)的步驟。在本實(shí)施方案中，所述方法還包括通過(guò)酶促氨基化作用或轉(zhuǎn)氨基作用(參見(jiàn)方案I或II)不對(duì)稱地還原3-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13， 7]癸烷-1-乙酸(式II)生產(chǎn)(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式V)中間體。另外，所述方法還包括按照方案III用三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式N)化學(xué)合成(＜aS-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式V)。
作為補(bǔ)充或替代，所述方法還包括通過(guò)從中間體[1S-(1＜a，3＜b，5＜a)-3-氨基羰基]-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-2-羧酸1，1-二甲基乙酯(式H)上除去BOC生產(chǎn)片段(1S，3S，5S)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-3-甲酰胺(式J)的步驟。在本實(shí)施方案中，所述方法還包括對(duì)(5S)-5-氨基羰基-4，5-二氫-1H-吡咯-1-羧酸1-(1，1-二甲基乙基)酯(式IV)進(jìn)行環(huán)丙烷化，優(yōu)選通過(guò)Simmons-Smith反應(yīng)，以便生產(chǎn)[1S-(1＜a，3＜b，5＜a)-3-氨基羰基]-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-2-羧酸1，1-二甲基乙酯(式H)的步驟。
本發(fā)明的另一方面涉及在這里被鑒定為生產(chǎn)基于環(huán)丙基-稠合的吡咯烷的二肽基肽酶IV抑制劑的有用中間體的新型化合物?？捎米魃a(chǎn)基于環(huán)丙基-稠合的吡咯烷的二肽基肽酶IV抑制劑的中間體的本發(fā)明的化合物包括
3-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13,7]癸烷-1-乙酸甲酯，如式I所示， 3-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸，如式II所示， (5S)-5-氨基羰基-4，5-二氫-1H-吡咯-1-羧酸1-(1，1-二甲基乙基)酯，如式IV所示，
(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸，如式V所示， (＜aS)-＜a[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸，如式VI所示，
(或它的DABCO鹽VIA)，金剛烷-1-基-二氯-乙酸甲酯，如式VII所示， 二氯-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸甲酯，如式VIII所示，和 二氯-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸，如式IX所示。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，正如本文所顯示的，所述化合物用作中間體，以用于生產(chǎn)二肽基肽酶IV抑制劑(1S，3S，5S)-2-[(2S)-2-氨基-2-(3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-1-基)-1-氧代乙基]-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-3-腈苯甲酸鹽(1∶1)，如式M所示 并且優(yōu)選分別如式M′和M″所示的相應(yīng)的游離堿或它的一水合物，
或它的一水合物M″(在上文中描述)。
用本發(fā)明的化合物和方法產(chǎn)生的二肽基肽酶IV的抑制作用可用于治療糖尿病及其并發(fā)癥，高血糖癥，X綜合征，高胰島素血癥，肥胖和動(dòng)脈粥樣硬化和相關(guān)的疾病，以及免疫調(diào)節(jié)疾病和慢性炎性腸疾病。
以下實(shí)施例表示本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。
實(shí)施例實(shí)施例1用來(lái)自能表達(dá)來(lái)自中間型高溫放線菌的苯丙氨酸脫氫酶并且產(chǎn)生內(nèi)源甲酸脫氫酶的重組巴斯德畢赤氏酵母的提取物進(jìn)行還原性氨基化作用。
將來(lái)自能表達(dá)來(lái)自中間型高溫放線菌的苯丙氨酸脫氫酶的重組巴斯德畢赤氏酵母冷凍細(xì)胞(2.25kg)添加到含有甲酸銨(28.65g，0.454摩爾)的去離子水(6.75L)中。在解凍之后，用Janke and KunkelUltra-turrax T25勻漿器懸浮所述細(xì)胞，用濃NH4OH將pH調(diào)節(jié)到7，并且用碎冰冷卻，以便得到存在于50mM甲酸銨中的25％w/v細(xì)胞懸浮液。通過(guò)讓細(xì)胞以12000磅/英寸2(psi)通過(guò)微型流化床裝置(microfluidizer)2次來(lái)破碎細(xì)胞，并且通過(guò)在4℃下以20,000×g離心除掉細(xì)胞碎片。將7024ml含有分別通過(guò)測(cè)定A(參見(jiàn)實(shí)施例9)或測(cè)定B(參見(jiàn)實(shí)施例10)確定為230998單位或124641單位的苯丙氨酸脫氫酶活性，和80080單位的甲酸脫氫酶的上清液添加到NewBrunswick Scientific Bioflo IV生物反應(yīng)器的16L容器中。
制備含有甲酸銨(442.5克，7.017摩爾)和(3-羥基-金剛烷-1-基)-氧代-乙酸(786.7克，3.510摩爾)的7024ml溶液。用276ml濃氫氧化銨將該溶液的pH調(diào)節(jié)到8.0。然后添加煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD；9.834克，14.82毫摩爾)和二硫蘇糖醇(2.163克，14.027毫摩爾)，并且將該溶液添加到裝有巴斯德畢赤氏酵母提取物的生物反應(yīng)器中。將該溶液保持在40℃下，并且以150rpm的速度攪拌。將45，25和27ml的濃氫氧化銨的等分試樣分別在反應(yīng)開(kāi)始之后0，3和18小時(shí)添加進(jìn)去，以便將pH調(diào)節(jié)到8.0。在25小時(shí)之后，通過(guò)HPLC分析(參見(jiàn)實(shí)施例8，方法2)測(cè)量該溶液含有818.9克(3.637摩爾，100％收率)(S)-氨基-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸，并且沒(méi)有可檢測(cè)到的酮酸或氨基酸的R-對(duì)映體。
通過(guò)由以下步驟組成的方法分離了(S)-氨基-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸煮沸所述酶促轉(zhuǎn)化混合物，以便排除氨，用甲酸將pH調(diào)節(jié)到3，過(guò)濾以除去沉淀的蛋白，將氨基酸吸附在Dowex 50(H+)樹(shù)脂上，用1.5M氨洗脫，并且濃縮富流出物，以便得到結(jié)晶固體形式的(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸。用該分離方法進(jìn)行的最后處理(787克酮酸輸入量)，用3-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸得到了804克(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸，效力為94.3％，收率為96.0％。通過(guò)該方法分離的所有批次的(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸在隨后的產(chǎn)生(1S，3S，5S)-2-[(2S)-2-氨基-2-(3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-1-基)-1-氧代乙基]-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-3-腈苯甲酸鹽的反應(yīng)中表現(xiàn)良好。
實(shí)施例2用來(lái)自重組巴斯德畢赤氏酵母的加熱干燥的細(xì)胞進(jìn)行還原性氨基化作用在pH8.0制備在4.0ml的最終體積中含有以下成分的溶液(用NH4OH調(diào)節(jié)pH)0.50M甲酸銨，0.25M(3-羥基-金剛烷-1-基)-氧代-乙酸，1.06mM NAD，1.00mM二硫蘇糖醇和250mg重組巴斯德畢赤氏酵母加熱干燥的細(xì)胞，所述細(xì)胞含有通過(guò)測(cè)定A確定為32.7單位的苯丙氨酸脫氫酶和24.6單位的甲酸脫氫酶。巴斯德畢赤氏酵母加熱干燥的細(xì)胞的制備業(yè)已由Hanson等描述(Enzyme andMicrobial Technology 200026348-358)。該溶液在50ml錐形瓶中，在40℃下，以100rpm的速度溫育4天，然后通過(guò)HPLC進(jìn)行分析。該溶液含有45.02mg/ml(80％收率)(S)-氨基-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸。
實(shí)施例3使用來(lái)自重組巴斯德畢赤氏酵母的濕細(xì)胞進(jìn)行還原性氨基化作用在pH8.0制備在3.0ml的最終體積中含有以下成分的溶液(用NH4OH調(diào)節(jié)pH)0.415M甲酸銨，0.208M(3-羥基-金剛烷-1-基)-氧代-乙酸，0.88mM NAD，0.84mM二硫蘇糖醇和12.5％w/v巴斯德畢赤氏酵母濕細(xì)胞，所述細(xì)胞含有通過(guò)測(cè)定A確定為6.06單位的苯丙氨酸脫氫酶和12.8單位的甲酸脫氫酶。該溶液在50ml錐形瓶中，在40℃下，以200rpm的速度溫育68小時(shí)，然后通過(guò)HPLC進(jìn)行分析。該溶液含有31.9mg/ml(68％收率)(S)-氨基-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸。
實(shí)施例4用能表達(dá)來(lái)自中間型高溫放線菌的苯丙氨酸脫氫酶的重組大腸桿菌加熱干燥的細(xì)胞和來(lái)自傅伊丁氏假絲酵母(Candida boidinii)的甲酸脫氫酶，進(jìn)行還原性氨基化作用在pH8.0制備在4.0ml的最終體積中含有以下成分的溶液(用NH4OH調(diào)節(jié)pH)0.50M甲酸銨，0.25M(3-羥基-金剛烷-1-基)-氧代-乙酸，1.06mM NAD，1.00mM二硫蘇糖醇，2.55單位/ml(0.51單位/mg)來(lái)自傅伊丁氏假絲酵母的甲酸脫氫酶(BoehringerMannheim)和250mg重組大腸桿菌加熱干燥的細(xì)胞，所述細(xì)胞含有通過(guò)測(cè)定A確定為76單位的苯丙氨酸脫氫酶。該溶液在50ml錐形瓶中，在40℃下，以100rpm的速度溫育4天，然后通過(guò)HPLC進(jìn)行分析。該溶液含有7.69mg/ml(13.7％收率)(S)-氨基-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸。
實(shí)施例5用重組大腸桿菌濕細(xì)胞和來(lái)自傅伊丁氏假絲酵母的甲酸脫氫酶進(jìn)行還原性氨基化作用在pH8.0制備在3.0ml的最終體積中含有以下成分的溶液(用NH4OH調(diào)節(jié)pH)0.415M甲酸銨，0.208M(3-羥基-金剛烷-1-基)-氧代-乙酸，0.88mM NAD，0.84mM二硫蘇糖醇，1單位/ml(0.51單位/mg)來(lái)自傅伊丁氏假絲酵母的甲酸脫氫酶(BoehringerMannheim)和12.5％w/v大腸桿菌濕細(xì)胞，所述細(xì)胞含有通過(guò)測(cè)定A確定為97單位的苯丙氨酸脫氫酶。該溶液在50ml錐形瓶中，在40℃下，以200rpm的速度溫育68小時(shí)，然后通過(guò)HPLC進(jìn)行分析。該溶液含有5.16mg/ml(11.0％收率)(S)-氨基-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸。
實(shí)施例6用來(lái)自芽孢八疊球菌屬物種的苯丙氨酸脫氫酶和來(lái)自傅伊丁氏假絲酵母的甲酸脫氫酶進(jìn)行還原性氨基化作用在pH8.5制備在1.0ml的最終體積中含有以下成分的溶液(用NH4OH調(diào)節(jié)pH0.15M甲酸銨，0.05M(11.2mg/ml)(3-羥基-金剛烷-1-基)-氧代-乙酸，1mM NAD，1mM二硫蘇糖醇，0.51單位/ml(0.51單位/mg)來(lái)自傅伊丁氏假絲酵母的甲酸脫氫酶(BoehringerMannheim)和1.01單位/ml來(lái)自芽孢八疊球菌屬物種的苯丙氨酸脫氫酶(14.5單位/mg；Sigma Chemical Co.)。將該溶液在30℃下溫育20小時(shí)，然后通過(guò)HPLC進(jìn)行分析。該溶液含有0.31mg/ml(2.74％收率)(S)-氨基-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸。
實(shí)施例7構(gòu)建質(zhì)粒pBMS2000-PPFDH-PDHmod采用了表達(dá)載體pBMS2000-PPFDH-PDHmod的兩個(gè)步驟的構(gòu)建。將巴斯德畢赤氏酵母FDH基因亞克隆到表達(dá)載體pBMS2000(pBMS2000公開(kāi)于美國(guó)專利號(hào)6,068,991中，該專利于2000年5月30日授予S.W.Liu等)，其中使用包括巴斯德畢赤氏酵母FDH基因的5′和3′末端以及相容性限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)的寡核苷酸引物5’TCGTCATGAAAATCGTTCTCGTTTTG 3’(5’末端；有義；SEQ ID NO1)BspHI5’TACTGTTTTTCCAGCGTATTCCTAGGCT 3’(3’末端；反義；SEQ ID NO2)BamHI在四個(gè)100μl等分試樣中，進(jìn)行巴斯德畢赤氏酵母FDH基因的高保真度PCR擴(kuò)增，其各自含有1×TaqPlus反應(yīng)緩沖液(Stratagene，LaJolla，CA)，各0.2mM的脫氧核苷三磷酸(dATP，dCTP，dGTP和dTTP)，各0.4nM的寡核苷酸，2.5U TaqPlus DNA聚合酶(Stratagene)和10pg含有克隆的巴斯德畢赤氏酵母FDH基因的質(zhì)粒DNA。擴(kuò)增條件包括在94℃下溫育4分鐘，然后進(jìn)行25輪溫育94℃1分鐘，50℃1分鐘和72℃1.5分鐘，使用能進(jìn)行自動(dòng)延伸的Perkin-Elmer Model 480熱循環(huán)儀。
用等體積的1∶1酚∶氯仿(GibcoBRL，Gaithersburg，MD)提取所述PCR反應(yīng)混合物，并且以13,000×g的速度離心5分鐘。獲取上部水相，并且放入新的微量離心管中。通過(guò)添加0.1體積的3M乙酸鈉和2體積的冰冷的乙醇使DNA沉淀。以13,000×g的速度離心5分鐘，然后將液體從試管中吸出，并且用0.5ml冰冷的70％乙醇洗滌沉淀物。再次吸出液體，并且在室溫下讓沉淀物風(fēng)干30分鐘。
在37℃下，在50μl的總體積中用BspHI和BamHI各20個(gè)單位消化擴(kuò)增的DNA，同時(shí)，用BspHI和BamHI消化pBMS2000載體(2μg)。在1.0％TAE瓊脂糖凝膠上于100v將消化過(guò)的樣品電泳2小時(shí)。將相當(dāng)于FDH基因(1100-堿基對(duì)片段)和線性化的載體(4700-堿基對(duì)片段)的帶分別從凝膠上切下，并且用QIAquick GelExtraction Kit(Qiagen，Chatsworth，CA)純化。相對(duì)于低分子量質(zhì)量梯(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)由電泳來(lái)估計(jì)分離的片段的濃度，并且在22℃下，在10μl的總體積中以5∶1(插入片段載體)的摩爾比連接2小時(shí)。通過(guò)添加15μl dH2O和250μl-丁醇使DNA沉淀，并且以13,000×g的速度在微量離心機(jī)中沉淀5分鐘。通過(guò)吸液排除液體，并且在低熱條件下在SpeedVac(SavantInstruments，F(xiàn)armingdale，NY)中使所述DNA干燥5分鐘。將沉淀物重新懸浮在5μl dH2O中通過(guò)電穿孔將重新懸浮的DNA轉(zhuǎn)化入0.04ml大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen)中，條件為25μF和250Ω。馬上添加SOC培養(yǎng)基(0.96ml；SOC＝在每一升體積中含有0.5％酵母提取物，2％胰化蛋白胨，10mM NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl2，10mM MgSO4和20mM葡萄糖)，并在37℃下，以225rpm的速度在搖床上溫育所述細(xì)胞1小時(shí)。在含有50μg/ml硫酸卡那霉素(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)的LB瓊脂平板上選擇含有質(zhì)粒DNA的菌落。通過(guò)菌落PCR鑒定具有需要的插入片段的質(zhì)粒，其中使用RapidCycler(Idaho Technology，Salt Lake City，UT)在毛細(xì)管中進(jìn)行。每一種反應(yīng)混合物含有50mM Tris-HCl(pH8.3)，4mM MgCl2，0.25mg/ml牛血清清蛋白，2％蔗糖400，0.1mM甲酚紅，各0.4nM的引物(SEQID NO1和SEQ ID NO2)，以及2.5U Taq DNA聚合酶(PromegaCorp.，Madison，WI)。將所述反應(yīng)混合物分成10μl的等分試樣，并且用移液管轉(zhuǎn)入圓底微量滴定板的孔中。使用一次性塑料接種針挑取卡那霉素抗性菌落，并且攪拌到所述反應(yīng)混合物中，并且轉(zhuǎn)移到LB-卡那霉素瓊脂上。將每一等分試樣的反應(yīng)混合物吸入30μl的毛細(xì)管中，并且在兩端對(duì)所述毛細(xì)管進(jìn)行火焰密封。裂解細(xì)胞，并且通過(guò)在94℃下溫育30秒使DNA變性；通過(guò)30輪溫育進(jìn)行擴(kuò)增，即在94℃0秒，40℃0秒和72℃60秒，使用RapidCycler熱循環(huán)儀(IdahoTechnologies，Salt Lake City，UT)。在1.0％TAE瓊脂糖凝膠上，于100v對(duì)樣品進(jìn)行電泳2小時(shí)。在17個(gè)檢測(cè)樣品中有7個(gè)樣品表現(xiàn)出1100堿基對(duì)的強(qiáng)的帶。選擇一個(gè)包含該質(zhì)粒(本文稱作DBMS2000-PPFDH)的菌落用于質(zhì)粒構(gòu)建的下一個(gè)步驟。
“PDHmod”表示修飾過(guò)的中間型高溫放線菌苯丙氨酸脫氫酶，它與公開(kāi)的DNA序列(Takada等，J.Biochem.109，pp.371-376)的差別在于，最后兩個(gè)氨基酸的改變，并且在羧基末端增加了額外12個(gè)氨基酸，這些氨基酸是將(3-羥基-金剛烷-1-基)-氧代-乙酸完全轉(zhuǎn)化成(S)-氨基-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸所需要的。將這種變化導(dǎo)入質(zhì)粒pPDH9K/10(詳細(xì)描述于專利WO 200004179中，于2000年1月27日授予Donovan等)，隨后將它轉(zhuǎn)化入巴斯德畢赤氏酵母SMD1168(作為菌株ATCC 74408保藏)。
天然PDH基因的3′末端和相應(yīng)的氨基酸AACAGCGCAAGGAGGTAAAsnSerAlaArgArg終止PDHmod基因的3′末端和相應(yīng)的氨基酸(改變了的或新的氨基酸用粗體表示)AAC AGC GCG GAG GGG TAC CTC GAG CCG CGGAsn Ser Ala Glu Gly Tyr Leu Glu Pro ArgCGG CCG CGA ATT AAT TCG CCT TAG (SEQ ID NO5)Arg Pro Arg Ile Asn Ser Pro 終止制備了包括PDHmod基因的5′和3′末端同時(shí)具有相容性限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)的寡核苷酸引物GATGCTCATATGCGCGACGTGTTTGAAATGATG(5’末端，有義；SEQ ID NO3)NdeIGATCCCGGGCTAAGGCGAATTAATAATTCG(3’末端，反義；SEQ ID NO4)SmaI通過(guò)PCR擴(kuò)增和純化PDHmod的反應(yīng)條件與用于巴斯德畢赤氏酵母FDH基因的條件相同，所不同的是，包括用ATCC 74408制備的染色體DNA作為該反應(yīng)的模板。在25℃下用NdeI和SmaI各20個(gè)單位消化所得到的片段1小時(shí)，然后在37℃下，在50μl的總體積中消化2小時(shí)。同時(shí)，使用相同的條件，用NdeI和SmaI消化在起始密碼子上具有NdeI位點(diǎn)的一種形式的pBMS2000載體(2μg)。消化過(guò)的樣品分別在1.0％TAE瓊脂糖凝膠上，于100v電泳2小時(shí)。將相當(dāng)于PDHmod基因(1200-堿基對(duì)片段)和線性化的載體(4700-堿基對(duì)片段)的帶從凝膠上切下，并且用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)純化。按照上文所述方法連接兩個(gè)片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并且篩選包括具有PDHmod基因的插入片段的菌落(形成pBMS2000-PDHmod)。
為了構(gòu)建pBMS2000-PPFDH-PDHmod，用HindIII和SmaI各10U在50μL的反應(yīng)物中，在25℃下切割pBMS2000-PDHmod(2μg)1小時(shí)，然后在37℃下切割1小時(shí)。添10單位的T4DNA聚合酶(Invitrogen)和2μL的所有四種脫氧核苷三磷酸的2.5mM混合物，并且在11℃下將所述樣品溫育20分鐘。在1.0％TAE瓊脂糖凝膠上于100v將所述反應(yīng)物電泳2小時(shí)。切下1800-堿基對(duì)的片段，并且用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)分離。該片段依次包括ta c啟動(dòng)子，groBS基因和PDHmod基因(作為轉(zhuǎn)錄融合體)。然后，在25℃下，用10單位限制性內(nèi)切核酸酶SmaI在50μL體積中消化pBMS2000-PPFDH(2μg)2小時(shí)，然后在37℃下用0.4U蝦堿性磷酸酶(United States Biochemicals，Cleveland，OH)處理1小時(shí)。于100v在1.0％TAE瓊脂糖凝膠上將質(zhì)粒DNA電泳2小時(shí)，分離，并且用QIAquick試劑盒提取。以6.5∶1(插入片段載體)摩爾比在16℃下，在10μL的最終體積中連接這兩個(gè)片段4小時(shí)。在用1-丁醇提取并且離心之后，將DNA轉(zhuǎn)化入電感受態(tài)(electrocempetent)DH10B細(xì)胞。用前面對(duì)FDH所描述的兩種PDHmod-特異性引物篩選卡那霉素-抗性菌落中PDHmod基因的存在。第二輪PCR篩選是通過(guò)使用分別與PPFDH的5′末端和PDHmod基因的3′末端同源的DNA引物進(jìn)行的。只有那些能夠支持1400-堿基對(duì)片段擴(kuò)增的構(gòu)建體具有相同方向的上述兩個(gè)基因。發(fā)現(xiàn)了一種這樣的質(zhì)粒，并且通過(guò)用KpnI進(jìn)行診斷性限制酶切消化證實(shí)了它的方向，由此得到了5422和1826堿基對(duì)的預(yù)期的片段。該質(zhì)粒被命名為“pBMS2000-PPFDH-PDHmod”。
實(shí)施例8FDH和PDHmod的表達(dá)將DBMS2000-PPFDH-PDHmod轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM110。在搖瓶研究中，在28℃下，以250rpm的速度，在MT5培養(yǎng)基(2.0％Yeastamine，4.0％甘油，0.6％磷酸鈉[二價(jià)]，0.3％磷酸鉀[一價(jià)]，0.125％硫酸銨，0.0256％硫酸鎂[七水合物；在高壓滅菌之后從無(wú)菌1M溶液中添加]和50μg/ml硫酸卡那霉素[在高壓滅菌之后從過(guò)濾滅菌的50mg/ml溶液中添加])中使JM110(pBMS2000-PPFDH-PDHmod)生長(zhǎng)18小時(shí)。記錄了在600nm下的光密度(OD600)，并且將足以提供0.35的起始OD600的細(xì)胞添加到新的MT5/卡那霉素培養(yǎng)基中。在28℃下以250rpm的速度振蕩燒瓶，直到OD600為0.8-1.0。通過(guò)添加過(guò)濾滅菌的1M異丙基硫代-β-D吡喃半乳糖苷(IPTG)到35μM的最終濃度來(lái)誘導(dǎo)兩個(gè)基因的表達(dá)，并且持續(xù)發(fā)酵24-48小時(shí)。通過(guò)以6，500×g的速度離心5分鐘使細(xì)胞沉淀，用等體積的50mM甲酸銨pH7.0洗滌一次，并且再次沉淀。細(xì)胞在-20℃保藏或馬上使用。將沉淀物以10mL/g濕細(xì)胞重量重新懸浮在50mM磷酸銨，pH7.0中，并且用功率設(shè)定為15且具有微型頭(microtip)的Fisher Scientific Model 50 SonicDismembrator(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)進(jìn)行超聲波處理3×15秒。通過(guò)在室溫下以13,000×g的速度離心5分鐘使碎片沉淀。
通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢查表達(dá)。將1μL細(xì)胞提取物與5μL的4×NuPAGETMLDS緩沖液(Invitrogen)混合，并且用蒸餾水將體積調(diào)節(jié)到19mL。在70℃將樣品加熱10分鐘。將1mL的1M二硫蘇糖醇溶液添加到該混合物，并且將10μL加樣到10％NuPAGETMBis-Tris聚丙烯酰胺微型凝膠上。在200v電泳50-60分鐘，并且在由0.1％(w/V)考馬斯藍(lán)(Sigma)，40％(v/v)乙醇和10％(v/v)乙酸組成的溶液中對(duì)所述凝膠染色。在微波爐中對(duì)浸泡在染色劑中的凝膠進(jìn)行加熱，直到沸騰，然后以40rpm在定軌搖床上振蕩15分鐘。用去離子水充分洗滌所述凝膠，并且用脫色液(GelClearTM；Invitrogen)覆蓋。再次將該溶液加熱到正好達(dá)到沸點(diǎn)，并且輕柔振蕩至少2小時(shí)。在誘導(dǎo)后觀察到了Mr43，000和40,000的兩個(gè)顯著的帶，相當(dāng)于FDH和PDHmod的亞基的預(yù)期分子量。在按照實(shí)施例10所述方法檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)上述樣品同時(shí)具有FDH和PDH活性。為這種重組大腸桿菌菌株確定的內(nèi)部名稱為SC16496。
然后在15和250升體積中對(duì)SC 16496進(jìn)行發(fā)酵。對(duì)于15升發(fā)酵來(lái)說(shuō)，在室溫對(duì)裝有1mL冷凍SC 16496的一個(gè)小瓶進(jìn)行解凍，并且添加到在4升的燒瓶中裝有1升含有50μg/ml卡那霉素的MT5培養(yǎng)基中。在28℃下，以250rpm的速度溫育燒瓶24小時(shí)，并且轉(zhuǎn)移到Braun發(fā)酵罐的13升的MT5培養(yǎng)基中(成分計(jì)量是根據(jù)15L的最終體積確定的)。將分別足以提供50μg/ml和0.0246％的最終濃度的硫酸卡那霉素和硫酸鎂七水合物溶解在500mL蒸餾水中，并且通過(guò)0.2微米乙酸纖維素過(guò)濾裝置進(jìn)行過(guò)濾滅菌。將該溶液添加到罐中，然后馬上接種。起始OD600為0.35。
發(fā)酵工作參數(shù)如下16升工作體積溫度28℃通氣1.0vvm壓力690毫巴攪拌500rpm根據(jù)需要用NH4OH將pH控制在6.8根據(jù)需要，通過(guò)添加UCON(由Dow Chemical Company生產(chǎn)的碳氟化合物溶劑摻合物)控制發(fā)泡。
在OD6000.8-1.0的條件下(在接種之后大約2小時(shí))，在無(wú)菌條件下添加過(guò)濾滅菌的IPTG(溶解在500mL dH2O中)，使最終濃度為35μM。讓發(fā)酵再繼續(xù)48小時(shí)，然后將罐的內(nèi)容物低溫冷卻到10℃。通過(guò)離心收集細(xì)胞，并且用0.1體積的50mM甲酸銨pH7.0漂洗1次。將細(xì)胞糊放入塑料容器中，并且在-70℃下保存待用。
對(duì)于250-L罐來(lái)說(shuō)，按以下方法制備接種物對(duì)1mL的冷凍SC16496進(jìn)行解凍，并且添加到含有50μg/ml卡那霉素的300mL MT5培養(yǎng)基中。讓所述燒瓶在28℃下和250rpm的速度下生長(zhǎng)24小時(shí)。測(cè)定OD600，并且取出能提供80OD單位的合適體積的細(xì)胞，并且添加到250mL新鮮的MT5培養(yǎng)基中。在無(wú)菌條件下將所述細(xì)胞添加到裝在Braun發(fā)酵罐中的10L的MT5/卡那霉素培養(yǎng)基中(起始OD600大約0.008)，在上文所公開(kāi)的發(fā)酵工作參數(shù)條件下生長(zhǎng)16小時(shí)。然后將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含有合適濃度的卡那霉素和硫酸鎂的250L的MT5中。根據(jù)SC 16496在上述條件下的90分鐘的倍增時(shí)間，250L體積中的10L接種物提供的起始OD600應(yīng)為0.30-0.35。誘導(dǎo)，生長(zhǎng)，收獲和保存是按照對(duì)15-L發(fā)酵所描述的方法進(jìn)行的。
實(shí)施例8A使用分離的PDH/FDH酶濃縮物，由3-羥基-α-氧代三環(huán)-[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式II)，通過(guò)(αS)-α-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式V)并縮生產(chǎn)(αS)-α-[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式VI)步驟1分離PDH/FDH酶濃縮物大腸桿菌JM110(pBMS2000-PPFDH-PDHmod)的發(fā)酵培養(yǎng)液(30升)是從4000L罐發(fā)酵中獲得的，并且通過(guò)微型流化床裝置(Microfluidics model M-110Y，工作壓力為12,000-20,000磅/英寸2)(通過(guò)一次)，以便從所述細(xì)胞中釋放所述活性，其中將培養(yǎng)液的溫度保持在低于40℃。微流化培養(yǎng)液的PDH/FDH活性對(duì)于PDH來(lái)說(shuō)為32IU/ML，對(duì)于FDH來(lái)說(shuō)為8IU/ml。
為了使整個(gè)培養(yǎng)液澄清，將4.5kg的Celite添加到充分?jǐn)嚢璧呐囵B(yǎng)液中。然后添加0.201升的30％含水聚乙烯亞胺，并且混合30分鐘。然后用壓濾機(jī)(Ertel Alsop model 8-ESSC-10)對(duì)該混合物進(jìn)行過(guò)濾，并且獲得了18升的濾液。用12升的水洗滌濾餅，以便將體積重新調(diào)節(jié)到30升。該步驟得到了PDH的97％的活性回收，PDH活性為31IU/ml，F(xiàn)DH的活性為8IU/ml。
通過(guò)100,000MWCO過(guò)篩盒(Millipore Pellicon 2unit，聚醚砜低蛋白結(jié)合盒，0.5m2過(guò)濾面積)對(duì)澄清的培養(yǎng)液進(jìn)行超濾。泵的循環(huán)速度為400mL/分鐘。將澄清的濾液濃縮到1.5升，并且得到的酶濃縮物的PDH效價(jià)為567IU/ml，F(xiàn)DH效價(jià)為136IU/ml。對(duì)滲透液進(jìn)行了測(cè)定，并且沒(méi)有發(fā)現(xiàn)活性。該濃縮物的總體酶活性回收率為84％。
步驟2還原性氨基化作用將3-羥基-α-氧代三環(huán)-[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式II(1.00kg；4.46摩爾)添加到20L容器中，然后添加水(5L)。攪拌該混合物，并且用10N NaOH將pH調(diào)節(jié)到pH～8，以便得到溶液。添加DarcoKBB碳(100g)，并且攪拌該混合物5分鐘，然后通過(guò)裝有5μ濾紙的布氏漏斗過(guò)濾。用水洗滌濾紙(2×1L)，并且合并濾液和洗滌液，以便得到清澈溶液。
在攪拌條件下添加甲酸銨(0.562Kg；8.92摩爾)，并且用10N NaOH將pH再次調(diào)節(jié)到大約7.5。添加煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(2.65g)和二硫蘇糖醇(1.54g)。在固體溶解之后，添加PDH/FDH酶濃縮物(1.03L；500,000IU的PDH)。在環(huán)境溫度下用10N NaOH將pH再次調(diào)節(jié)到大約8.0。
然后將該混合物加熱到大約40℃，并且用水稀釋到10L的總體積。將pH保持在7.7-8.3，同時(shí)攪拌42小時(shí)。所得到的溶液含有0.955Kg(95.1％)的產(chǎn)物(αS)-α-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式V)。
步驟3BOC-保護(hù)將重碳酸二-叔丁酯(1.022kg；4.68摩爾)添加到(αS)-α-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式V)(477.5g；2.12摩爾)的一部分溶液中。在環(huán)境溫度下攪拌該混合物，用10N NaOH通過(guò)pH靜滴定器(stat titrator)將pH調(diào)節(jié)到并保持在10。在添加Boc2O之后4小時(shí)完成所述反應(yīng)，此時(shí)只剩下不到1.0％的原材料。
用35％H2SO4將該混合物的pH調(diào)節(jié)到大約8，并且將i-PrOAc(5.0L)添加到該混合物中。然后用35％H2SO4將該混合物的pH調(diào)節(jié)到2.0，并且保持在該pH下5-10分鐘。添加Dicalite(250g)；攪拌該混合物大約10分鐘，然后通過(guò)放置在布氏漏斗中的濾紙上的Dicalite(250g)墊過(guò)濾，用2.5Li-PrOAc進(jìn)一步洗滌所述Dicalite墊。
用10N NaOH將濾液調(diào)節(jié)到pH8。在靜置1小時(shí)之后，棄掉包括界面在內(nèi)的有機(jī)層。向水層中添加i-PrOAc(7.5L)。用35％H2SO4將該混合物酸化到pH大約2，并且然后加熱到大約40℃并且在柔和攪拌中維持在大約40℃4小時(shí)。分離不同的層，并且保留有機(jī)提取物。包括界面在內(nèi)的水層用i-PrOAc(3.75L)提取，并且在40℃下經(jīng)過(guò)2小時(shí)之后再次分離不同的層。再次用i-PrOAc(3.75L)提取具有界面的水層，并且在40℃下經(jīng)過(guò)2小時(shí)之后分離不同的層。
通過(guò)蒸餾將合并的有機(jī)提取物(大約15L)濃縮到大約4.5L。然后用10-15分鐘時(shí)間向該溶液中添加庚烷(大約10L)，同時(shí)將溫度保持在大約82-89℃。將反應(yīng)器夾套溫度設(shè)定為70℃，并且在該溫度保持1小時(shí)。在冷卻之后不久就發(fā)生結(jié)晶。然后將反應(yīng)器夾套溫度設(shè)定為40℃，并且在該溫度下保持30分鐘。
將懸浮液冷卻到環(huán)境溫度，然后進(jìn)一步冷卻到0-5℃。在0-5℃下攪拌1小時(shí)之后，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行過(guò)濾。用庚烷(2.5L)洗滌產(chǎn)物，然后在40℃下在真空中干燥，以得到607.0g(88％收率)的(αS)-α-[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-3羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式VI)。
實(shí)施例9用來(lái)自重組大腸桿菌SC16496JM110[pBMS2000-PPFDH-PDHmod](ATCC保藏PTA-4520)的提取物進(jìn)行還原性氨基化作用將重組大腸桿菌冷凍細(xì)胞(25克)添加到去離子水中(足以使總體積達(dá)到100ml，并且含有5ml 1M甲酸銨)。在解凍之后，用Janke and Kunkel Ultra-turrax T8勻漿器懸浮細(xì)胞，并且用濃NH4OH調(diào)節(jié)到pH7，并且用碎冰冷卻，以得到存在于50mM甲酸銨中的25％w/v的細(xì)胞懸浮液。通過(guò)于12000磅/英寸2從微型流化床裝置中通過(guò)兩次破壞細(xì)胞，并且通過(guò)在4℃下以20,000×g的速度離心除去細(xì)胞碎片。將含有2456u(測(cè)定A)或768u(測(cè)定C)苯丙氨酸脫氫酶和8801u甲酸脫氫酶的266ml上清液添加到1-L瓶子中。
制備了含有甲酸銨(16.74g，0.2654摩爾)和(3-羥基-金剛烷-1-基)-氧代-乙酸(29.76g，0.1327摩爾)的266ml的溶液，并且用12.7ml濃氫氧化銨調(diào)節(jié)到pH8.0。添加NAD(372mg，0.561毫摩爾)和二硫蘇糖醇(81.8mg，0.530毫摩爾)，然后將該溶液添加到裝有大腸桿菌提取物的瓶子中。該瓶子保持在40℃，在搖床上以40rpm的速度振蕩。定期添加濃氫氧化銨，以便保持pH8.0。在38小時(shí)之后，通過(guò)HPLC分析測(cè)定，該溶液含有31.5克(0.140摩爾，100％收率)(S)-氨基-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸，并且不含氨基酸的R-對(duì)映體。
實(shí)施例10用來(lái)自重組大腸桿菌SC16496JM110[pBMS2000-PPFDH-PDHmod](ATCC保藏PTA-4520)的冷凍干燥的細(xì)胞進(jìn)行還原性氨基化作用該溶液在pH8.0的10.0ml的最終體積中含有(用NH4OH調(diào)節(jié)pH)0.50M甲酸銨，0.237M(3-羥基-金剛烷-1-基)-氧代-乙酸，1.00mM NAD，1.00mM二硫蘇糖醇和975mg冷凍干燥的重組大腸桿菌。將所述細(xì)胞干燥到濕重的26％。在干燥之前，所述細(xì)胞含有65.04單位/g(測(cè)定A)苯丙氨酸脫氫酶，(或通過(guò)測(cè)定C測(cè)定的12.79單位/g苯丙氨酸脫氫酶)，和133.32單位/g甲酸脫氫酶。在40℃下，在密封的50ml錐形瓶中，以100rpm的速度溫育所述溶液3天，然后通過(guò)HPLC進(jìn)行分析。該溶液含有49.06mg/ml(92.13.0％收率)(S)-氨基-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸。
實(shí)施例11使用支鏈轉(zhuǎn)氨酶的轉(zhuǎn)氨基作用在50mM磷酸鉀緩沖液，pH8.0中制備在1.0ml的最終體積中含有以下成分的溶液0.10M谷氨酸鈉，0.05M(3-羥基-金剛烷-1-基)-氧代-乙酸(用0.05M NaOH中和)，0.1mM磷酸吡哆醛和1mg支鏈轉(zhuǎn)氨酶(Biocatalytics)。在37℃下在微量離心管中溫育該溶液68小時(shí)，然后通過(guò)HPLC進(jìn)行分析。該溶液含有5.53mg/ml(49.2％收率)(S)-氨基-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸和7.05mg/ml殘余的(3-羥基-金剛烷-1-基)-氧代-乙酸。
實(shí)施例12(S)-氨基-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸對(duì)映體過(guò)量和總量的HPLC測(cè)定用水將樣品稀釋到大約2mg/ml的濃度，并且放入沸水浴中1分鐘，以便終止反應(yīng)，并且使蛋白沉淀。在冷卻之后，通過(guò)0.2微米的尼龍濾器將所述樣品過(guò)濾到HPLC小瓶中。
使用了兩種分離方法。
方法1柱Chiralpak WH 25×0.46cm(Daicel Industries，Ltd.)。
流動(dòng)相0.3mM CuSO4流速1ml/分鐘柱溫度50℃檢測(cè)二極管陣列檢測(cè)器(DAD)設(shè)定為240nm注射體積10μlS-對(duì)映體((＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸)保留時(shí)間79.9分鐘R-對(duì)映體保留時(shí)間32.8分鐘方法2柱Regis Davankov Ligand Exchange 15×0.46cm流動(dòng)相25％甲醇/75％6mM CuSO4流速1ml/分鐘柱溫度40℃檢測(cè)DAD設(shè)定為240nm注射體積10μlS-對(duì)映體(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸)保留時(shí)間3.2分鐘R-對(duì)映體保留時(shí)間11.2分鐘酮酸(3-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸)保留時(shí)間5.2分鐘實(shí)施例13苯丙氨酸脫氫酶測(cè)定A在40℃進(jìn)行的苯丙氨酸脫氫酶測(cè)定A在1ml中含有0.4mMNADH，5mM苯丙酮酸鈉，0.75M NH4OH，用HCl調(diào)節(jié)到pH8.75。在340nm下監(jiān)控吸收度的減弱。根據(jù)吸收度改變速度，以微摩爾/分鐘計(jì)算酶活性單位。
實(shí)施例14
苯丙氨酸脫氫酶測(cè)定B在40℃進(jìn)行的苯丙氨酸脫氫酶測(cè)定B在1ml中含有1mM NAD，10mM L-苯丙氨酸，0.1M K2HPO4，用1N NaOH調(diào)節(jié)到pH10.0。在340nm下監(jiān)控吸收度的提高。根據(jù)吸收度改變速度，以微摩爾/分鐘計(jì)算酶活性單位。
實(shí)施例15苯丙氨酸脫氫酶測(cè)定C在40℃進(jìn)行的苯丙氨酸脫氫酶測(cè)定C在1.0mL中含有0.4mMNADH，50mM 3-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(溶解在1當(dāng)量NaOH溶液中)，0.75M NH4OH，用HCl調(diào)節(jié)到pH8.75。在340nm下監(jiān)控吸收度的降低。根據(jù)吸收度改變速度，以微摩爾/分鐘計(jì)算酶活性單位。
實(shí)施例16甲酸脫氫酶測(cè)定在40℃進(jìn)行的甲酸脫氫酶測(cè)定在1.0ml中含有1mM NAD，100mM甲酸銨，100mM磷酸鉀緩沖液，pH8.0。在340nm下監(jiān)控吸收度的增加。根據(jù)吸收度改變速度，以微摩爾/分鐘計(jì)算酶活性單位。
實(shí)施例17將三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式N)溴化成α-溴代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式O)將固體三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式N)(288g；1.48摩爾)懸浮在三頸圓底燒瓶中的亞硫酰氯(465mL)中，該燒瓶裝有冷凝器。添加二甲基甲酰胺(DMF；0.3mL)，并且在室溫?cái)嚢柙搼腋∫?.5小時(shí)。通過(guò)氣相層析檢查反應(yīng)的完成。然后將固體NBS(307g)逐份地添加到所述反應(yīng)混合物中，并且將所述反應(yīng)混合物加熱到60℃。攪拌該反應(yīng)物3小時(shí)，同時(shí)將溫度保持在60-65℃。通過(guò)氣相層析進(jìn)行監(jiān)控，以便確保反應(yīng)的完成。將庚烷(900mL)添加到所述反應(yīng)混合物中。在78-80℃下將多余的亞硫酰氯蒸餾掉。然后小心地添加水(劇烈反應(yīng))，以便終止所述反應(yīng)(總體積1050mL)。然后添加庚烷(500mL)和水(600mL)，并且從所述有機(jī)層中分離水層。用額外的水(600mL)洗滌所述有機(jī)層并且再次將水層與有機(jī)層分離。將額外的水(150mL)添加到所述有機(jī)庚烷層中，并且將庚烷從所述水層中蒸餾掉。具體地講，使70mL的水與庚烷共餾。在蒸餾掉庚烷之后，將四氫呋喃(THF；1200mL)添加到水層中，并且在室溫下劇烈攪拌所得到的混合物16小時(shí)，以便緩慢水解。通過(guò)氣相層析進(jìn)行的監(jiān)控表明了某些未反應(yīng)的?；鹊拇嬖凇Ｈ缓筇砑宇~外的水(150mL)，以便加速水解，并且通過(guò)氣相層析監(jiān)控反應(yīng)，以便確保反應(yīng)的完成。然后將THF蒸餾掉，得到了雙相(水和油)反應(yīng)混合物。然后添加晶種，并且讓反應(yīng)物達(dá)到室溫，以便出現(xiàn)粗粒。添加水(250mL)和乙腈(500mL)，以便保持所述懸浮液可以攪拌，因?yàn)樵搼腋∫菏窃谑覝叵聰嚢?小時(shí)的。然后將固體過(guò)濾掉，并且用乙腈(2×250mL)洗滌。該濾液含有第一批α-溴代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式O)；在室溫下真空干燥之后得到264克，AP 95，收率為66％。然后在室溫下用水和乙腈(250mL/250mL)研磨母液(113克殘余物)1-2小時(shí)。然后過(guò)濾反應(yīng)物，并且使固體干燥，以便獲得第二批α-溴代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式O)；64克，AP 90，收率為16％。
實(shí)施例18用α-溴代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式O)制備α-溴代-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式Q)在錐形瓶裝入315ml的95-98％H2SO4，然后在冰浴中冷卻到8℃。然后添加HNO3(35ml的50％的溶液，通過(guò)將50ml的70％HNO3添加到30ml的水中制備)燒瓶中，同時(shí)在冰浴中將所述混合物保持在8℃。然后用大約30-60分鐘時(shí)間將固體α-溴代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式O)(92克，0.338摩爾)逐份地添加到所述混合物中，以便將溫度保持在28℃以下。然后攪拌所述反應(yīng)物，同時(shí)加熱到60℃，直到獲得清澈溶液。
通過(guò)薄層層析(TLC)或高效液相層析(HPLC)監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程。用硅膠進(jìn)行TLC，其中使用比例為9∶1∶10的乙酸乙酯/甲醇/己烷，具有KMnO4。用ODS柱，C18S-3 120A，4.6×50mm進(jìn)行HPLC，使用在7分鐘時(shí)間內(nèi)10％乙腈/H2O至100％乙腈的線性梯度，并且流速為2.5ml/分鐘。檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm。
在反應(yīng)完成時(shí)，將混合物冷卻到室溫，并且在該溫度下保持大約16小時(shí)。然后添加水(700mL)，以便終止所述反應(yīng)，直到不再產(chǎn)生棕色氣體。所得到的漿在冰浴中冷卻到大約5℃，然后過(guò)濾。用200mL水洗滌固體濾過(guò)物，并且風(fēng)干，以便得到90克的α-溴代-3羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式Q)淺黃色固體(92％收率)。
實(shí)施例19用α-溴代-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式Q)制備(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式V)將α-溴代-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式Q)(75克，0.278摩爾)溶解在225mL的30％氫氧化銨(4.08摩爾，14.6當(dāng)量)中。然后在65℃下加熱所述反應(yīng)混合物16小時(shí)。然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(rotovap)上將所述反應(yīng)混合物濃縮成固體。將EtOH(200mL)添加到所述濃縮的固體中，然后再次在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮。得到了71克的羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式V)的手性混合物黃色固體(90％)。
實(shí)施例20羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式V)的分離實(shí)施例19的手性混合物的Boc保護(hù)是用Boc酐和氫氧化鈉在四氫呋喃中進(jìn)行的。將所得到的化合物α-[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]]-]31-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(化合物R)(0.25M存在于EA中，80μl，＝6.52mg)與手性堿([1R，2S]-(-)-1，2-二苯基羥基乙胺)(0.25M，80μl)在小瓶中混合，并且在SpeedVac中將所述混合物蒸發(fā)至干燥。添加溶劑(200ul)。將裝有所述混合物的小瓶放置在搖床上，于50℃加熱1.5小時(shí)。然后將所述混合物冷卻到室溫，以便使(αS)-α-[[二甲基乙氧基]羰基]氨基]-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(化合物S)結(jié)晶。
實(shí)施例21
ZnCl2-催化的溴化金剛烷(式A)偶聯(lián)用7.5kg溴化金剛烷填充干燥的容器。然后在室溫下添加二氯甲烷(22.5升)，以便溶解固體溴化金剛烷。溶解是吸熱反應(yīng)，因此在下一個(gè)步驟之前，讓所述反應(yīng)混合物的溫度恢復(fù)到20℃。然后在所述反應(yīng)混合物中添加氯化鋅(1.05kg)，并在20℃下攪拌大約5分鐘。然后向所述反應(yīng)混合物中添加三(三甲基甲硅烷氧基)-乙烯(15.3kg)，同時(shí)將反應(yīng)溫度保持在20-25℃，并且將所得到的混合物攪拌2小時(shí)。在該混合之后，添加三(三甲基甲硅烷氧基)-乙烯(5.10kg)。在該添加期間，將溫度保持在低于30℃。在20-25℃下將所述反應(yīng)再維持12-15小時(shí)，此時(shí)，用二氯甲烷(15升)稀釋所述反應(yīng)混合物，并且冷卻到0-5℃。然后使用半飽和的NH4Cl溶液處理所述反應(yīng)混合物，開(kāi)始于逐滴的方式。在添加期間，將溫度保持在低于30℃。獲得了濃的懸浮液。向該懸浮液中添加乙酸乙酯(93.75升)。劇烈攪拌該混合物15分鐘，并且分離有機(jī)相和水相。保存所述有機(jī)層，并且用乙酸乙酯洗滌水層(每一次洗滌使用18.75升)。然后合并所述乙酸乙酯洗滌液和有機(jī)層，并且用水(37.5升)洗滌，然后用由鹽水半飽和的水(37.5升)洗滌。再次分離所述有機(jī)層，并且蒸發(fā)，以便形成結(jié)晶。然后將溶劑交換成庚烷，最終體積為22.5升。將所得到的懸浮液冷卻到5-10℃，保持1小時(shí)，并且通過(guò)過(guò)濾獲得了產(chǎn)物＜a-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式B)。＜a-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式B)的產(chǎn)量為6.96kg(33.11mol，95％)。
實(shí)施例21A＜a-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式B)的酯化首先在反應(yīng)器中形成了惰性氣氛，然后用甲醇(35.00升)填充所述反應(yīng)器，接著用＜a-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式B)(14.00kg)填充，以便形成懸浮液。將該懸浮液冷卻到0-5℃，并且以一定方式添加乙酰氯，從而將所述反應(yīng)混合物的溫度保持在5-10℃。在完成添加乙酰氯之后，將所述反應(yīng)混合物加熱到20-25℃并且在20-25℃下攪拌2小時(shí)。然后在40℃下在真空中濃縮所述反應(yīng)混合物，并且獲得了稀油。將所述油溶解在乙酸乙酯(71.96升)中，并且使溫度達(dá)到室溫。用水洗滌所得到的混合物兩次(每次洗滌使用28.78升)，并且在每次洗滌之后分離有機(jī)層和水層。保存所述有機(jī)層，同時(shí)合并所述水層，并且用3N NaOH溶液調(diào)節(jié)到pH9.5。然后用乙酸乙酯提取合并的水層兩次(每次提取使用14.39升)。在每一次提取之后，分離所述有機(jī)層，并且與保存的有機(jī)層合并。然后用飽和的碳酸氫鈉溶液(28.78升)洗滌所述合并的有機(jī)層，隨后用鹽水(43.18升)洗滌。在40℃下，在真空條件下去除所有揮發(fā)性物質(zhì)，并且獲得了無(wú)色至淺黃色的油狀物，其在靜置時(shí)可結(jié)晶。這種油狀物包括13.29kg(59.26mol，89％)＜a-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸甲酯(式C)。
實(shí)施例22＜a-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸甲酯(式C)的Swern氧化作用用氮?dú)馇逑慈i燒瓶(22升)過(guò)夜，該燒瓶裝有機(jī)械攪拌器，溫度探頭和附加漏斗。然后添加草酰氯(500ml，5.73摩爾)，接著添加CH2Cl2(8升)。用丙酮/干冰浴將所得到的溶液冷卻到-69℃。然后用大約30分鐘時(shí)間緩慢添加二甲亞砜(DMSO；700ml，9.86摩爾)溶液，同時(shí)保持內(nèi)部溫度低于-60℃。攪拌該溶液20分鐘，同時(shí)將溫度保持在-60至-70℃。然后用大約30分鐘時(shí)間緩慢添加存在于CH2Cl2(1.7升)中的＜a-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸甲酯(式C)(990克，4.42摩爾)溶液，同時(shí)保持內(nèi)部溫度低于-60℃。攪拌所得到的溶液30分鐘。然后添加NEt3(3升，21.5摩爾)，以便形成三乙胺鹽酸鹽的重的漿。將所述反應(yīng)混合物加熱到室溫，并且添加水(1升)，以便溶解三乙基銨鹽(TEA鹽)。然后將所述反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到圓底燒瓶中，并濃縮，以便去除二氯甲烷(DCM)和NEt3。添加EtOAc(12升)，并且分離所得到的水層和有機(jī)層。用水洗滌所述有機(jī)層三次(每次洗滌使用2升)，然后用鹽水洗滌(2升)。然后在無(wú)水Na2SO4上通過(guò)蒸發(fā)干燥所述有機(jī)相，以便產(chǎn)生＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸甲酯(式D)淺黃色固體。收率為大約104％。
實(shí)施例23
將＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸甲酯(式D)羥基化成3-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸甲酯(式I)用95-98％的H2SO4(495ml)填充錐形瓶，并且在冰浴中冷卻到8℃。然后將HNO3(47.5ml，濃度為50％，通過(guò)將50ml的70％HNO3添加到30ml水中制備)添加到所述燒瓶中，并且再次在冰浴中將該混合物冷卻到8℃。用30-60分鐘時(shí)間將固體＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸甲酯(式D)(100克，0.45摩爾)逐份地添加到所述混合物中，以保持溫度低于28℃。攪拌所述反應(yīng)混合物，同時(shí)在冰浴中冷卻。通過(guò)薄層層析(TLC)或高效液相層析(HPLC)監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程。對(duì)于TLC來(lái)說(shuō)，使用硅膠，并且溶劑是EtOAc/MeOH/己烷(9/1/10)；KMnO4。對(duì)于HPLC來(lái)說(shuō)，使用4.6×50mm，C18，3微米，120埃柱，使用在7分鐘時(shí)間內(nèi)10％乙腈/H2O至100％乙腈的梯度，流速為2.5ml/分鐘。監(jiān)控波長(zhǎng)為200nm。當(dāng)所述反應(yīng)完成(大約1小時(shí)之后)時(shí)，通過(guò)添加冷水(1.5升)和EtOAc(500ml)終止所述反應(yīng)。添加額外的水和EtOAc(各500ml)，以便幫助水層和有機(jī)層的分離。然后用3等分試樣的各500ml的EtOAc提取所述水層。合并所述有機(jī)層，并且用鹽水(400ml)洗滌。然后在對(duì)比壓(reducedpressure)下將洗滌過(guò)的有機(jī)層濃縮成130克的黃色油狀殘余物，它含有3-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸甲酯(式I)。
實(shí)施例24將3-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸甲酯(式I)水解成3-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式II)將實(shí)施例23中的黃色油狀殘余物溶解在四氫呋喃(300ml)中，并且在冰浴中冷卻到5℃。將一升的1N氫氧化鈉緩慢添加到該溶液中，以便將pH調(diào)節(jié)到大約7，同時(shí)保持溫度低于30℃。然后再添加500ml的1N NaOH，以便將pH調(diào)節(jié)到大約14。然后攪拌所述反應(yīng)混合物，同時(shí)在冰浴中冷卻，并且通過(guò)實(shí)施例23中所描述的TLC或HPLC監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程。在大約30分鐘之后反應(yīng)完成時(shí)，添加EtOAc(500ml)，并且分離水層和有機(jī)層。用另外500ml EtOAc洗滌水層。用濃HCl酸化所述水層。當(dāng)所述溶液達(dá)到pH7時(shí)，添加EtOAc(500ml)，然后添加濃度更高的HCl，直到pH達(dá)到0.7。所添加的濃HCl總計(jì)為150ml。然后用EtOAc提取所述水層(4×400ml)，并且用400ml水洗滌合并的有機(jī)層，然后用400ml鹽水洗滌。然后用MgSO4干燥洗滌過(guò)的有機(jī)層，并且濃縮。產(chǎn)物為88g的淺黃色固體。將該固體溶解在100ml EtOAc和300ml庚烷中，攪拌30分鐘，然后過(guò)濾，并且風(fēng)干，得到了85克的褐色固體(85％3-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式II))。
實(shí)施例25金剛烷-1-基-二氯-乙酸甲酯(式VII)的制備用鋅粉(78.0g，1.19摩爾)填充2-升三頸燒瓶，該燒瓶裝有機(jī)械攪拌器，溫度計(jì)，冷凝器，壓力均勻的附加漏斗和氬氣的入口，然后添加無(wú)水四氫呋喃(400ml)。向該混合物中添加1，2-二溴乙烷(2ml)，以便激活鋅。在柔和回流的條件下加熱所得到的混合物25分鐘。在冷卻到-55℃之后，添加三氯乙酸甲酯(100.3g，0.565摩爾)和三甲基氯硅烷(80ml，0.648摩爾)的溶液，添加速度為將反應(yīng)溫度保持在-55至-60℃(需要1小時(shí))。在添加完成之后，在室溫下攪拌所述混合物大約90分鐘。用庚烷(700ml)稀釋所得到的混合物，并且在氮?dú)鈼l件下通過(guò)Celite 545墊過(guò)濾。用額外的庚烷(1×300ml，3×200ml)洗滌濾餅。然后在對(duì)比壓下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮濾液(大約10-15mm Hg，使用22-27℃的水浴)，以得到濃油狀粗制產(chǎn)物(2，2-二氯-1-甲氧基-乙烯氧基)-三甲基硅烷(129.2g)。定量質(zhì)子NMR發(fā)現(xiàn)該粗制材料包括0.389mol(68.8％)的(2，2-二氯-1-甲氧基-乙烯氧基)-三甲基硅烷。
用粗制產(chǎn)物(2，2-二氯-1-甲氧基-乙烯氧基)-三甲基硅烷(129.1g，大約0.389摩爾)和無(wú)水二氯甲烷(100ml)填充裝有氬氣入口的1升燒瓶。向所得到的溶液中添加1-溴代金剛烷(75.2g，0.349摩爾)和無(wú)水氯化鋅(6.56g，48毫摩爾)。在室溫下攪拌所得到的混合物過(guò)夜。用庚烷(600ml)和水(300ml)稀釋所得到的棕紅色混合物。分離所述有機(jī)層，并且用水(2×100ml)，1N碳酸氫鈉(3×150ml)和水(2×200ml)洗滌。所得到的溶液通過(guò)Celite545墊過(guò)濾，并且在對(duì)比壓下濃縮濾液，以便得到無(wú)色固體。將該材料溶解在煮沸的甲醇(250ml)中。用1小時(shí)時(shí)間讓所得到的溶液冷卻到室溫。在冷卻到大約5℃保持2小時(shí)之后，通過(guò)過(guò)濾收集固體，并且用冰冷的甲醇∶水(94∶6；4×50ml)洗滌，以便得到金剛烷-1-基-二氯-乙酸甲酯(式VII)的無(wú)色固體75.0克(77.3％，基于1-溴代金剛烷)；熔點(diǎn)(mp)76.3℃。
元素分析C13H18Cl2O2計(jì)算結(jié)果C，56.33；H，6.55；Cl，25.58％測(cè)定結(jié)果C，56.49；H，6.59；Cl，25.72％1H NMR(500.16MHz，CDCl3)δ 3.855(s，3H)，2.069(br s，3H)，1.866(d，J＝2.75Hz，6H)，1.683，1.612(AB q，J＝12.1Hz)ppm13C NMR(127.78MHz，CDCl3)δ 166.130，95.805，53.969，43.980，36.842，36.256，28.309ppm實(shí)施例26二氯-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸甲酯(式VIII)的制備制備10N HNO3用濃HNO3(88.25g，大約62.58mL，大約1.0摩爾)填充100mL容量瓶，并且在冰浴中冷卻。添加水(35mL)。在混合的熱量消散之后，讓該溶液加溫到室溫。然后用水補(bǔ)足到所述燒瓶刻度線，以便得到10N HNO3。
用濃H2SO4(103g，大約56mL)填充250mL三頸燒瓶，該燒瓶裝有熱電偶溫度計(jì)。在冰浴中冷卻到0.4℃之后，用大約30分鐘時(shí)間添加10N HNO3(5.68mL，56.8毫摩爾)。當(dāng)該酸性混合物的溫度降低到大約1.0℃時(shí)，取消所述冷水浴。逐份地(每10分鐘1.25g；1小時(shí)50分鐘的添加時(shí)間)添加具有式VII的金剛烷-1-基-二氯-乙酸甲酯(15.0g，54.11毫摩爾；用研缽/研杵輕輕地研磨，以便將大的團(tuán)塊/晶體破碎)。經(jīng)過(guò)約5小時(shí)之后，所述反應(yīng)混合物是清澈的淺黃色溶液。
在攪拌大約24小時(shí)之后，所述反應(yīng)混合物是非常淺的黃色溶液。用水(250mL)和尿素(8.0g，0.133摩爾，相對(duì)于HNO3為大約2.34當(dāng)量)填充到四頸Morton燒瓶(1L)中，該燒瓶裝有機(jī)械攪拌器和熱電偶溫度計(jì)。向所得到的溶液添加乙酸乙酯(230mL)。在冰浴中將所得到的雙相混合物冷卻到大約1.0℃。用大約15分鐘時(shí)間將來(lái)自上面所述的反應(yīng)混合物添加到冰冷的EtOAc/水/尿素混合物中。所述轉(zhuǎn)移是使用額外的乙酸乙酯和水完成的(各自大約50mL)。在攪拌大約45分鐘之后，取消所述冷水浴，并且通過(guò)攪拌使所述混合物加溫。在攪拌4.5小時(shí)之后(從終止開(kāi)始計(jì)算)，將所得到的混合物使用額外的乙酸乙酯(大約100mL)轉(zhuǎn)移到分液漏斗(1L)中以完成所述轉(zhuǎn)移。取出含水級(jí)分，并且用乙酸乙酯提取(1×80mL)。合并有機(jī)級(jí)分，并且用水(2×90mL)，1N NaHCO3(4×90mL)和鹽水洗滌。在無(wú)水硫酸鎂上干燥，然后在對(duì)比壓下除去溶劑，以便得到具有式VIII的二氯-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸甲酯的幾乎無(wú)色固體15.67g(98.7％，粗制產(chǎn)物收率)?？梢詫⒃摯种撇牧嫌糜谥苽渚哂惺絀X的二氯-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸，而無(wú)需進(jìn)行純化。不過(guò)，如果需要的話，可以從甲醇(102mL)和水(85mL)中再結(jié)晶所述粗制材料(15.65g)，以便提供棉絮狀固體(熔點(diǎn)114.8-115.0℃)，回收率為91％。
元素分析C13H18Cl2O3計(jì)算結(jié)果C，53.25；H，6.18；Cl，24.18％測(cè)定結(jié)果C，53.24；H，6.24；Cl，24.31％1H NMR(500.16MHz，CDCl3)δ 3.857(s，3H)，2.298(br m，2H)，1.824(s，2H)，1.793(d，4H，＝2.75Hz)，1.682，1.629(br AB q，4H)，1.529(m，3H)ppm13C NMR(127.78MHz，CDCl3)δ 165.929，94.281，68.932，54.150，44.478，44.529，44.020，35.750，34.759，30.149ppm實(shí)驗(yàn)室HPLCYMC ODS-A S3 120(4.6×50mm)，λ＝200nm，2.5ml/分鐘溶劑A＝0.2％H3PO4，溶解在水中B＝90％CH3CN，溶解在水中梯度10分鐘時(shí)間內(nèi)20％A至100％B
實(shí)施例27二氯-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸(式IX)的制備用甲醇(200ml)和1N NaOH(194ml，194毫摩爾，相對(duì)于輸入的二氯-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸甲酯(式VIII)來(lái)說(shuō)大約1.36當(dāng)量)填充500ml圓底燒瓶。將所得到的溶液在冰浴中冷卻，直到溫度＜9℃。解除冷水浴，并且添加二氯-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸甲酯(式VIII)(41.68g，142.1毫摩爾)。在氮?dú)庵?，在環(huán)境溫度下攪拌所得到的懸浮液。在攪拌大約6小時(shí)之后，用額外部分的甲醇(10ml)漂洗所述容器壁。在攪拌大約17小時(shí)之后，對(duì)所述反應(yīng)混合物進(jìn)行過(guò)濾，以便除掉少量的顆粒狀材料。將所得到的溶液轉(zhuǎn)移到2-升三頸燒瓶中，該燒瓶裝有機(jī)械攪拌器。用水(900ml)稀釋所述反應(yīng)混合物，并且完成所述轉(zhuǎn)移。通過(guò)添加濃HCl(38ml，大約456毫摩爾)酸化所得到的溶液。很快形成了白色固體。輕柔地?cái)嚢杷龌旌衔锎蠹s20分鐘，然后放入冰浴中。在柔和攪拌大約90分鐘之后，停止攪拌器，并且將所述混合物在冰浴中再靜置2小時(shí)。對(duì)所得到的懸浮液進(jìn)行過(guò)濾，并且用冰冷的水洗滌濾餅。通過(guò)使空氣經(jīng)過(guò)所述濾餅抽吸使大量的水從所述固體中排出。然后在環(huán)境溫度下，在真空中干燥所述材料22小時(shí)，以便得到二氯-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸(式IX)的無(wú)色粉末狀固體39.19克(98.7％收率)；熔點(diǎn)238℃(dec)。
元素分析C12H16Cl2O3計(jì)算結(jié)果C，51.63；H，5.77；Cl，25.40％測(cè)定結(jié)果C，51.43；H，5.74；Cl，25.48％實(shí)驗(yàn)室HPLCYMC ODS-A S3 120(4.6×50mm)，λ200nm，2.5ml/分鐘溶劑A＝0.2％H3PO4，溶解在水中B＝90％CH3CN，溶解在水中梯度10分鐘時(shí)間內(nèi)20％A至100％B
1H NMR(500.16MHz，CD3OD)δ 2.258(br s，2H)，1.858(s，6H)，1.674，1.615(brAB q，J＝11.54Hz，4H))，1.588-1.526(m，2H)ppm13H NMR(125.77MHz，CD30D)δ 167.957，96.356，69.322，48.070，45.360，44.794，37.050，36.039，31.631ppm實(shí)施例283-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式II)的制備用二氯-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸(式IX)(38.67g，138.5毫摩爾)填充500ml三頸燒瓶。向該材料中添加水(160ml)和1NNaOH(138ml，138毫摩爾；用1N NaOH制備二氯-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸的鈉鹽，以避免使用固體NaHCO3時(shí)可能發(fā)生的起泡問(wèn)題)，以便得到渾濁的溶液。向該溶液中添加固體NaHCO3(29.10克，346毫摩爾，2.50當(dāng)量)。在添加NaHCO3之后，所述反應(yīng)混合物成為懸浮液，因?yàn)槎?(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸的鈉鹽被強(qiáng)制從所述溶液中析出。所述反應(yīng)容器裝有回流冷凝器/氬氣入口，并且加熱到大約80℃。在加熱大約6小時(shí)之后，讓所述混合物冷卻到室溫。通過(guò)添加濃HCl(需要32ml)將所述反應(yīng)混合物(pH7.22)小心地酸化(CO2放出)到pH0.15。用乙酸乙酯(4×300ml)提取所得到的混合物。在用乙酸乙酯進(jìn)行第一次提取之后，通過(guò)添加濃HCl(大約2ml)將水層(pH0.37)降低到pH0.18。合并乙酸乙酯級(jí)分，并且用鹽水(100ml)洗滌。在無(wú)水硫酸鎂上干燥，然后在對(duì)比壓下除去溶劑，以便得到3羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式II)的無(wú)色顆粒狀固體30.77克(99％)。
元素分析C12H1604計(jì)算結(jié)果C，64.27；H，7.19％測(cè)定結(jié)果C，64.30；H，7.13％1H NMR(500.16MHz，D2O)δ 2.288(br s，1.33H)，2.227(br s，0.67H)，1.8]9-1.575(m，12H)ppm-部分水合物13C NMR(125.77MHz，D2O)δ 207.704，174.583，169.608，98.109，69.618，68.830，47.538，43.7]6，43.251，43.190，42.907，42.563，36.073，34.677，34.232，30.006，29.865ppm-部分水合物實(shí)驗(yàn)室HPLCYMC ODS-A S3 120(4.6×50mm)，λ＝200nm，2.5ml/分鐘溶劑A＝0.2％H3PO4，溶解在水中B＝90％CH3CN，溶解在水中梯度10分鐘時(shí)間內(nèi)10％A到60％B
實(shí)施例28A采用單罐的方法制備3-羥基-＜a氧代三環(huán)-[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式II)用按實(shí)施例26所述方法制備的二氯-(3-羥基-金剛烷-1-基)乙酸甲酯(式VIII)(15g，51.16毫摩爾)填充250-mL三頸燒瓶，該燒瓶裝有壓力相等的附加漏斗和氬氣入口，然后添加四氫呋喃(30mL，去穩(wěn)定化的)。在攪拌若干分鐘之后，溶解大部分式VIII甲酯，以便得到渾濁溶液。向該溶液中添加蒸餾水(30mL)，并且形成了疏松的懸浮液。用1N NaOH(69ml，69毫摩爾，相對(duì)于式VIII化合物輸入來(lái)說(shuō)為大約1.35當(dāng)量)填充到所述附加漏斗中。用70分鐘時(shí)間滴加NaOH，以便得到幾乎無(wú)色的溶液，在室溫下攪拌該溶液。
在大約16小時(shí)時(shí)進(jìn)行的HPLC分析證實(shí)了式VIII化合物水解的完成。通過(guò)添加大約6N HCl(2.8mL)將pH為13.24的所述反應(yīng)混合物的清澈無(wú)色溶液調(diào)節(jié)到pH7.40。添加固體NaHCO3(11.2g，0.133mol.，2.60當(dāng)量)，以便形成懸浮液。
在加熱4小時(shí)15分鐘之后進(jìn)行的HPLC分析顯示該反應(yīng)完成了。在加熱5小時(shí)之后，去掉熱源，并且讓所述反應(yīng)混合物(清澈的無(wú)色溶液)冷卻。在冷卻到室溫之后，將所述反應(yīng)混合物在冰箱(+4℃)保存4天。
在冰冷條件下保存4天之后，所述反應(yīng)混合物仍然是清澈的無(wú)色溶液，并且HPLC分析顯示在保存時(shí)幾乎沒(méi)有改變(如果有的話)。在加溫到室溫之后，通過(guò)小心添加濃HCl(需要11mL，CO2放出；當(dāng)pH大約為1.40時(shí)，無(wú)色固體開(kāi)始沉淀)將所述混合物(pH7.77)酸化到pH0.20。用EtOAc(x4，大約500mL總體積；在每一次EtOAc提取之后對(duì)含水級(jí)分進(jìn)行HPLC分析)提取所得到的懸浮液。在第一次EtOAc提取之后，通過(guò)添加濃HCl(需要大約1.6mL)將水層(pH0.38)調(diào)節(jié)到pH0.18。在第二次EtOAc提取之后，通過(guò)添加濃HCl(需要大約0.8mL)將水層(pH0.37)調(diào)節(jié)到pH0.17。在剩余的EtOAc提取(第三次提取，pH0.19；第四次提取，pH0.19)之后，所述水層不需要額外的pH調(diào)節(jié)。合并有機(jī)級(jí)分。在干燥(MgSO4)之后，在對(duì)比壓下除去溶劑，以便得到粗制的標(biāo)題式II化合物的幾乎無(wú)色的顆粒狀固體，在真空條件下(真空泵)將它干燥16小時(shí)11.42g(99.53％收率)；HPLC，100％(面積％)。
元素分析C12H16Cl2O3[55465-020-31，TR46373]計(jì)算結(jié)果C，64.27％；H，7.19％測(cè)定結(jié)果C，64.19％；H，7.09％通過(guò)加熱到大約85℃將粗制式II化合物(5.0g)溶解在蒸餾水(19mL)中，然后從所述熱源中取出，并且使其冷卻。在大約53℃下，所述材料開(kāi)始結(jié)晶。在室溫下放置大約2小時(shí)后，通過(guò)過(guò)濾收集所述固體，并且用冰冷的水洗滌。通過(guò)所述濾餅抽吸氮?dú)鈦?lái)排除大部分水。然后在真空條件(泵)下干燥所述材料17小時(shí)，以便得到標(biāo)題式II化合物的大的無(wú)色針狀物4.33g(回收率為86.6％)；熔點(diǎn)164.5-165.6℃(在Mettler FP800系統(tǒng)上)；HPLC，100％(面積％)。
元素分析C12H16Cl2O3[55465-023-15，TR46905]計(jì)算結(jié)果C，64.27％；H，7.19％測(cè)定結(jié)果C，64.42％；H，7.04％實(shí)施例29對(duì)L-焦谷氨酸(式E)進(jìn)行酯化，以便形成L-焦谷氨酸乙酯(式F)用乙醇(49.0升)填充反應(yīng)容器，并且冷卻到-5℃。以一定方式用亞硫酰氯(4.97kg)填充所述反應(yīng)容器，以便該混合物的溫度不會(huì)超過(guò)0℃。在完成添加亞硫酰氯之后，再次讓所述混合物冷卻到-5℃，并且逐份地添加L-焦谷氨酸(式E)，以便在添加期間將溫度保持在0至-5℃。在添加所述酸之后，將所述反應(yīng)混合物加熱到20-25℃，并且攪拌5小時(shí)。然后在真空條件下將所述反應(yīng)混合物蒸發(fā)(Tmax45℃)，直到其原始體積的大約15％。然后將剩余的油狀物溶解在甲苯(49升)中。然后將所述甲苯溶液冷卻到大約10℃，并且緩慢添加三乙胺(8.45kg)，以便最高溫度在20-25℃。攪拌所得到的懸浮液30分鐘，然后過(guò)濾。用甲苯(大約5升)洗滌濾餅。在50℃下，在真空條件下使濾液的體積縮小到總體積為大約10升。通過(guò)在50℃下緩慢添加環(huán)己烷(8升)啟動(dòng)結(jié)晶，并且隨后冷卻到大約30℃。在晶種形成之后，讓該混合物冷卻到20-25℃，并且填充第二個(gè)8升部分的環(huán)己烷。然后將該混合物冷卻到6-8℃，攪拌1小時(shí)，并且將所得到的晶體濾出。用環(huán)己烷洗滌所述晶體2次(每次洗滌使用4升)。所得到的產(chǎn)物是4.89kg(82％)L-焦谷氨酸乙酯(式F)的無(wú)色針狀物。
實(shí)施例30L-焦谷氨酸乙酯(式F)的BOC-保護(hù)在室溫下將L-焦谷氨酸乙酯(式F)(5.00kg)溶解在甲苯(24.97升)中。然后將4-二甲基氨基吡啶(0.19kg)添加到所述溶液中。以一定方式用溶解在甲苯(24.97升)中的BOC-酐(7.29kg)的溶液填充所述反應(yīng)混合物，以便反應(yīng)溫度不超過(guò)25℃。在完成添加之后，在25℃下攪拌反應(yīng)混合物3小時(shí)。然后用半飽和的NaHCO3-溶液(49.94升)填充所述反應(yīng)混合物，并且劇烈攪拌10分鐘，然后分離有機(jī)相和水相。分離的有機(jī)層用水洗滌兩次(每次用24.97升)。然后在真空條件下，在50℃下的最高溫度下將有機(jī)層從溶劑中蒸發(fā)出來(lái)。剩余的無(wú)色至淺黃色油狀物在靜置時(shí)結(jié)晶。理論產(chǎn)量為8.18kg(31.81摩爾)的(5S)-2-氧代吡咯烷-1，5-二羧酸[1-(1，1-二甲基乙基)，5-乙基]酯(式G)。
實(shí)施例31SuperHydride還原和消除將(5S)-2-氧代吡咯烷-1，5-二羧酸[1-(1，1-二甲基乙基)，5-乙基]酯(式G)(4.80kg)溶解在甲苯(30.97升；Kf max 0.01％水)中，并且冷卻到-50℃。以一定方式用SuperHydride(存在于THF中的LiEt3BH 1M；19.96升)填充該溶液，以便反應(yīng)溫度不超過(guò)-45℃。在完成添加之后，在-45至-50℃下攪拌該混合物30分鐘。然后以一定方式將N-乙基二異丙胺(DIPEA；14.47升)添加到所述反應(yīng)混合物中，以使得溫度不超過(guò)-45℃。將固體形式的二甲基氨基吡啶(0.030kg)添加到所述混合物中。然后以一定方式用三氟乙酸酐(TFAA)(4.70kg)填充所述反應(yīng)混合物，以使反應(yīng)溫度不超過(guò)-45℃。在完成添加之后，用1小時(shí)時(shí)間讓所述反應(yīng)混合物加溫到20-25℃，并且在該溫度下再保持2小時(shí)。然后讓所述反應(yīng)混合物冷卻到0℃，并且緩慢填充水(48.00升)以便反應(yīng)溫度不超過(guò)5℃。然后分離水相和有機(jī)相，并且用48升水(0-5℃)再次洗滌有機(jī)相。隨后蒸發(fā)有機(jī)層，并且在40℃下脫氣。獲得了黃色油狀物，產(chǎn)量為4.5kg(18.66mol，100％)的4，5-二氫-1H-吡咯-1，5-二羧酸[1-(1-二甲基乙基)，5-乙基]酯(BOC-DHPEE)(式III)。
實(shí)施例32BOC-DHPEE(式III)的水解將用4，5-二氫-1H-吡咯-1，5-二羧酸[1-(1，1-二甲基乙基)，5-乙基]酯(BOC-DHPEE)(式III)(6.00kg)和乙醇(24.00升)制備的溶液冷卻到0-5℃，并且在該溫度下用存在于水(20.87升)中的氫氧化鋰水合物(2.09kg)的溶液緩慢處理，以便產(chǎn)生渾濁的溶液。然后將該渾濁溶液加溫到20-25℃，并且在該溫度下攪拌2小時(shí)。在40℃的最高溫度下，在真空下將所述反應(yīng)混合物蒸發(fā)到大約10.5升的體積，并且用水(24.00升)和叔丁基甲醚(TBME或MTBE)(24升)填充，并且混合10分鐘。分離所得到的有機(jī)相和水相，并且用24升TMBE再次填充水相。然后將混合物冷卻到5-10℃，并且用H3PO485％-水(1∶4)將pH調(diào)節(jié)到2.3-2.3，同時(shí)劇烈攪拌。在該過(guò)程中，將溫度保持在5-10℃以保持其穩(wěn)定性。分離所得到的有機(jī)層和水層。保存所述有機(jī)層，并且用24升預(yù)先在5-10℃冷卻的TBME再次提取水層。將所得到的有機(jī)層與保存的有機(jī)層合并，并且用二異丙基乙胺(DIPEA)(4.82kg)填充。在30℃的最高溫度下，在真空條件下蒸發(fā)所述溶液并且脫氣。產(chǎn)量為7.84kg(22.88摩爾，92％)[N-BOC脫氫脯氨酸*DIPEA(BOC-DHP)]。
實(shí)施例33在BOC-DHP上形成酰胺通過(guò)按照實(shí)施例32所述皂化合成的BOC-DHP可能含有水。因此，在進(jìn)行反應(yīng)之前，用甲苯進(jìn)行共沸蒸餾。不過(guò)，由于試劑過(guò)量，對(duì)原材料的計(jì)算是以除去任何水之前的BOC-DHP量為基礎(chǔ)的。為了進(jìn)行共沸蒸餾，用甲苯將BOC-DHP稀釋成大約30％的溶液。在40℃下在真空中除去甲苯。然后將處理的BOC-DHP(6.00kg)溶解在THF(48.0升)中。用DIPEA(2.26kg)填充該溶液，并且將所述反應(yīng)混合物冷卻到-20至-25℃。然后緩慢添加甲磺酰氯(3.01kg)。在該添加過(guò)程中，DIPEA氫氯化物沉淀。然后在-20℃下攪拌所得到的懸浮液2小時(shí)，然后通過(guò)表面下氣體入口用氨飽和。在添加氨的同時(shí)，將反應(yīng)物加熱到0℃。在飽和之后，將所述反應(yīng)混合物加熱到20℃，并且攪拌3小時(shí)。在攪拌之后，對(duì)所述反應(yīng)混合物進(jìn)行過(guò)濾，以便除去氫氯化物。用THF(12升)分若干部分洗滌濾餅。將所得到的濾液在真空條件下，在40℃的最高溫度下濃縮，并且溶解在二氯甲烷(33.33升)中。用水(26.66升)洗滌所述溶液。分離所得到的有機(jī)相和水相，并且用二氯甲烷提取水相2次(每次20升)。合并所得到的有機(jī)層，并且在真空條件下濃縮，并且脫氣，以便除去任何多余的Hünigs堿。產(chǎn)量為3.35kg(15.77mol，90％)的(5S)-5-氨基羰基-4，5-二氫-1H-吡咯-1-羧酸1-(1，1-二甲基乙基)酯(BOC-DHPA)(式IV)。
實(shí)施例34(5S)-5-氨基羰基-4，5-二氫-1H-吡咯-1-羧酸1-(1，1-二甲基乙基)酯(式IV)的環(huán)丙烷化用溶解在二氯甲烷(18.0升)中的BOC-DHPA(式IV)(4kg)填充第一個(gè)反應(yīng)器，反應(yīng)器A，并且保持在20℃。用二氯甲烷(18.00升)填充第二個(gè)反應(yīng)器，反應(yīng)器B，并且冷卻到-30℃。然后用二甲氧基乙烷(DME)(3.36kg)填充反應(yīng)器B，然后用存在于甲苯中的30％的二乙基鋅(15.36kg)溶液填充，同時(shí)將溫度保持在-30至-25℃。然后用二碘甲烷(19.99kg)填充反應(yīng)器B，同時(shí)將反應(yīng)溫度保持在-30和-25℃。在完成二碘甲烷添加之后，在-30至-25℃下攪拌該混合物45分鐘。然后通過(guò)冷卻管(-20至-25℃)將該混合物填充到反應(yīng)器A中。填充是以大約5％的部分緩慢進(jìn)行的，以便反應(yīng)器A的反應(yīng)溫度保持在22-24℃，直到反應(yīng)完成。在反應(yīng)完成之后，將反應(yīng)器A的反應(yīng)物冷卻到5-10℃。然后用飽和的碳酸氫鹽溶液(21.6升)以一定方式緩慢填充所述反應(yīng)混合物，以便反應(yīng)溫度不超過(guò)15℃。在這一添加過(guò)程之后，攪拌所述反應(yīng)混合物至少1小時(shí)，同時(shí)形成沉淀物。對(duì)所述懸浮液進(jìn)行過(guò)濾。將所得到的濾餅重新轉(zhuǎn)移到所述容器中，再次用二氯甲烷(14.4升)制成漿30分鐘，然后再次過(guò)濾。在第二次過(guò)濾之后，通過(guò)添加二氯甲烷(7.2升)洗滌所述濾餅。然后將所述濾液分離成水相和有機(jī)相，并且用半飽和的鹽水(21.6升)洗滌所述有機(jī)相。然后在最高30℃的溫度下通過(guò)真空除去溶劑，并且通過(guò)庚烷進(jìn)行交換。獲得了存在于庚烷中的粗制產(chǎn)物的漿。在溶劑交換之后的懸浮液的最終體積為14.4升。通過(guò)過(guò)濾分離粗制產(chǎn)物。用庚烷(2.9升)洗滌所述濾餅，并且在真空條件下干燥到恒定重量。粗制產(chǎn)物的產(chǎn)量為2.76kg(12.2mol，72％)[1S-(1＜a，3＜b，5＜a)-3-氨基羰基]-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-2-羧酸1，1-二甲基乙酯(式H)。為了純化，在20-22℃下，將所述粗制材料在8倍用量的1∶1的乙酸丁酯/庚烷的混合物中制成漿4小時(shí)。過(guò)濾所述材料，并且用合適的1倍量的庚烷洗滌所述濾餅。產(chǎn)量為2.11kg(9.33mol，55％)[1S-(1＜a，3＜b，5＜a)-3-氨基羰基]-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-2-羧酸1，1-二甲基乙酯(式H)。
實(shí)施例35對(duì)[1S-(1＜a，3＜b，5＜a)1-3-(氨基羰基)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-2-羧酸1，1-二甲基乙酯(式H)脫保護(hù)，以便形成(1S，3S，5S)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-3-甲酰胺(式J)用[1S-(1＜a，3＜b，5＜a)-3-氨基羰基]-2氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-2-羧酸1，1-二甲基乙酯(式H)(5.0克，22.1毫摩爾)和THF(20ml)填充100ml的2頸燒瓶，該燒瓶裝有機(jī)械攪拌器和熱電偶。然后將HCl(2.5M，存在于EtOAc中，25ml，62.5毫摩爾)添加到所述懸浮液中。在室溫下攪拌所得到的溶液18小時(shí)，在此期間，觀察到了沉淀。通過(guò)HPLC監(jiān)控反應(yīng)的完成。將甲基叔丁醚(MTBE)(30ml)添加到該懸浮液中，并且再繼續(xù)攪拌30分鐘。然后在N2保護(hù)下過(guò)濾所述懸浮液，以便產(chǎn)生白色固體，所述固體用MTBE(20ml)洗滌。在對(duì)比壓條件下，在烘箱中干燥所述固體48小時(shí)，以便提供(1S，3S，5S)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-3-甲酰胺(式J；3.6克，100％)的鹽酸鹽。
實(shí)施例35A(5S)-5-氨基羰基-4，5-二氫-1H-吡咯-1-羧酸1-(1，1-二甲基乙基)酯(式IV)的其他制備方法A.4，5-二氫-1H-吡咯-1，5-二羧酸1-(1，1-二甲基乙基)的轉(zhuǎn)化向10.4g(25.86毫摩爾)固體二環(huán)己基胺(DCHA)鹽在30mL水，40mL甲苯和10mL MTBE的混合物中制備的懸浮液中添加2.7mL的10N含水NaOH(27毫摩爾)(過(guò)量的NaOH應(yīng)當(dāng)限制為1.05當(dāng)量或更少)。在攪拌時(shí)，產(chǎn)生了具有清澈的層的雙相混合物，并且分離所有固體溶解的相。用4mL水提取含有4，5-二氫-1H-吡咯-1，5-二羧酸1-(1，1-二甲基乙基)鈉鹽的廢棄的有機(jī)相，將所述水添加到最初的水相中。HPLC定量得到了12.55％(w/w)的在水相中的“游離烯烴-酸”含量或96％的回收率。
B.DMT-MM的制備將4mL(36.38毫摩爾)的純N-甲基嗎啉(MM)添加到保持在室溫水浴中的溶解在70mL EtOAc中的2-氯-4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪(CDMT)(6.2mg，35毫摩爾；1.5當(dāng)量)的溶液中。固體4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鎓氯化物(DMT-MM)開(kāi)始沉淀出來(lái)。在室溫下攪拌含有DMT-MM的懸浮液30分鐘，此時(shí)它變成稠的糊狀物。在反應(yīng)期間，溫度從23℃上升到28-29℃。保持所述反應(yīng)的溫度較低，以便使競(jìng)爭(zhēng)性脫甲基化最小化，以便形成二甲氧基-N甲基嗎啉-三嗪(DMMT)。
C.將4，5-二氫-1H-吡咯-1，5-二羧酸1-(1，1-二甲基乙基)的鈉鹽轉(zhuǎn)化成(5S)-5-氨基羰基-4，5-二氫-1H-吡咯-1-羧酸1-(1，1-二甲基乙基)酯IV向通過(guò)HPLC定量(V＝25mL)相當(dāng)于5g(23.5毫摩爾)游離烯烴酸的A部分鈉鹽的鈉鹽溶液中添加固體NH4Cl(3.75g，70毫摩爾，3當(dāng)量)，此時(shí)pH從14降低到8.9。向該溶液中添加足夠的NaH2PO4×H2O以便將pH調(diào)節(jié)到pH＝6.20。注意磷酸的用量可以根據(jù)用于將DCHA鹽轉(zhuǎn)化成鈉鹽的最初過(guò)量的NaOH而改變。將緩沖過(guò)的鈉鹽溶液添加到按上面的B部分制備的DMT-MM懸浮液中。
在室溫下攪拌所述雙相混合物4小時(shí)，此時(shí)，最初的乳狀液成為懸浮液，并且某些DMHT沉淀出來(lái)。通過(guò)HPLC分析證實(shí)，所述反應(yīng)完成了，并且在任何相中既沒(méi)有出現(xiàn)活化的DMT-酯，又沒(méi)有出現(xiàn)酸。
在所述反應(yīng)條件下，通過(guò)DMT-MM和DMHT反應(yīng)，還形成了重量百分比為12-15％的4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪醚(DMT-醚)。對(duì)該懸浮液進(jìn)行過(guò)濾，以便除掉4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪(DMHT)，并且分離不同的相。用2N含水的NaH2PO4×H2O(2×25mL)洗滌富有機(jī)相，或直到pH(含水的(aq.))＜6，這意味著大部分N-甲基嗎啉被從所述有機(jī)相中除掉。分離所述相，并且用25mL鹽水洗滌所述富有機(jī)相。
標(biāo)題化合物IV的一般的溶液收率為87-90％；未反應(yīng)的起始烯烴-酸為1-0％。對(duì)所述富有機(jī)相進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)并且用新鮮的EtOAc(2×250mL)進(jìn)行共沸干燥。所述材料是部分結(jié)晶的。將所述混合物溶解在8mL的熱EtOAc中，并且與10mL的正庚烷混合。固體開(kāi)始形成。在50℃下攪拌所述懸浮液30分鐘，并且添加另外10mL的正庚烷。在從加熱的水浴中取出之后，在室溫下攪拌所述懸浮液30分鐘，并且每30分鐘2次填充額外的庚烷，并且在室溫下攪拌所述懸浮液過(guò)夜，以便完成結(jié)晶。將所述固體過(guò)濾并且干燥。一般的結(jié)晶收率接近90％；標(biāo)題化合物IV的效力為90％，并且DMT-醚占重量的其余10％。
發(fā)現(xiàn)形成的固體是標(biāo)題化合物IV和DMT-醚的真共晶體(trueco-crystal)，通過(guò)DSC測(cè)定它們能產(chǎn)生單一的尖銳的97.4℃的熔點(diǎn)，與酰胺的89.7℃的熔點(diǎn)形成對(duì)比。所述共晶體形式更具有晶態(tài)并且更方便地從溶液中結(jié)晶出來(lái)。
實(shí)施例35B制備4，5-二氫-1H-吡咯-1，5-二羧酸1-(1，1-二甲基乙基)的二環(huán)己基胺鹽A.制備4，5-二氫-1H-吡咯-1，5-二羧酸1-(1，1-二甲基乙基)的鈉鹽將3倍體積的乙醇添加到4，5-二氫-1H-吡咯-1，5-二羧酸1-(1，1-二甲基乙基)(大約15wt％-25wt％)(1g/mL)的甲苯溶液中。將該溶液冷卻到0-5℃。緩慢向該溶液中添加5N NaOH-水溶液(2當(dāng)量)，同時(shí)保持溫度＜5℃(輕度放熱)。將所述反應(yīng)混合物加溫到20-25℃，并且攪拌直到反應(yīng)完成。
將4倍體積的水添加到所述反應(yīng)混合物中，并且在真空條件下蒸餾所述反應(yīng)混合物(水浴溫度為40℃)，以便除掉乙醇。向所述殘余物中添加0.5倍體積的甲苯(0.865g/mL)，并且攪拌所述混合物10分鐘。形成了水層和有機(jī)層。分離包括鈉鹽的水層，并且用于B部分。
B.制備4，5-二氫-1H-吡咯-1，5-二羧酸1-(1，1-二甲基乙基)的二環(huán)己基胺鹽將1倍體積的MTBE(0.74g/mL)添加到4，5-二氫-1H-吡咯-1，5-二羧酸1-(1，1-二甲基乙基)-鈉鹽的水溶液中。將0.2倍體積的庚烷(0.684g/mL)添加到上述溶液中，并且將所得到的溶液冷卻到0-5℃。將85％H3PO4(1g/mL)緩慢添加到所述溶液中，使pH為大約2.5-3，同時(shí)保持溫度＜5℃(輕度放熱的)。分離所得到的層，并且向包括所述產(chǎn)物的有機(jī)層中添加1倍體積的75％的鹽水。攪拌該混合物10分鐘，并且分離所得到的層。所述產(chǎn)物包含在所述有機(jī)層中。
將所述有機(jī)溶液冷卻到0-5℃，并且緩慢添加二環(huán)己基胺(0.91g/mL)(輕度放熱)同時(shí)保持溫度＜10℃。在0-5℃下，攪拌所述反應(yīng)混合物3小時(shí)。將所述固體過(guò)濾出來(lái)，并且用0.5倍體積的1∶1MTBE/庚烷洗滌。干燥并且回收所得到的DCHA鹽(1g/mL)。
實(shí)施例35C[1S-(1＜a，3＜b，5＜a)]-3-(氨基羰基)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-2-羧酸[1，1-二甲基乙基，乙基]酯(式H)(又被稱為順-N-BOC-4，5-亞甲基脯氨酸)的其他制備方法A.制備(s)-BOC-4，5-亞甲基脯氨酸乙酯 用2.2g的4，5-二氫-1H-吡咯-1，5-二羧酸[1-(1，1-二甲基乙基)，5-乙基]酯(2.20g，9.12毫摩爾，1當(dāng)量)和22ml的無(wú)水甲苯裝入火焰干燥的3頸燒瓶中(磁力攪拌)。將所得到的溶液冷卻到-30℃，并且進(jìn)一步滴加16.58ml(18.24毫摩爾)的二乙基鋅(存在于甲苯中的1.1m溶液)。
滴加存在于2.2ml甲苯中的2.66ml(6.43g，36.47毫摩爾)的氯碘甲烷溶液，同時(shí)將反應(yīng)溫度保持在-25℃至-30℃。將反應(yīng)物保持在-20℃下16小時(shí)。然后用22ml的半飽和的碳酸氫鹽溶液終止所述反應(yīng)，并且加溫到室溫。形成了白色沉淀物，用Hyflow(過(guò)濾器輔助裝置)過(guò)濾掉所述沉淀，并且用甲苯(大約10ml)洗滌。將所述有機(jī)層與所述雙相濾液分離，并且用水洗滌兩次(每次使用11ml)。將所述有機(jī)層蒸發(fā)到干燥，以便得到微黃色油狀物(2.33g)，它是N-BOC-亞甲基脯氨酸乙酯(順式-和反式-(8∶1)同分異構(gòu)體的混合物)。
用上述方法制備大量上述同分異構(gòu)體的混合物，這些混合物足以在下一個(gè)步驟中使用。在20-25℃下，將3.40kg的N-BOC 4，5-亞甲基脯氨酸乙酯(順式-和反式-同分異構(gòu)體的混合物)與5.17kg(66.59gmol)40.0％甲胺(水溶液)一起在氮?dú)夥罩袆×覕嚢琛?br> 在完成反應(yīng)之后，用5.17升水和5.17升MTBE稀釋所述混合物，并且再攪拌5分鐘，然后進(jìn)行相分離。用5.17升水洗滌所述有機(jī)層。將所得到的有機(jī)層蒸發(fā)(真空，Tmax 40℃)到恒定重量。
獲得了2.52kg產(chǎn)量的順-N-Boc-4，5-亞甲基脯氨酸乙酯(9.85mol，74％)。
B.制備s-BOC-4，5-亞甲基脯氨酸 制備存在于10.28升乙醇中的2.57kg順-N-BOC 4，5-亞甲基脯氨酸乙酯(s-BOC-MPEE)的溶液。在20-28℃向該溶液中添加用5.07升水中的0.51kg氫氧化鋰水合物制備的溶液。反應(yīng)是在惰性氣體保護(hù)(氮?dú)?下進(jìn)行的，在20-25℃下攪拌所述反應(yīng)混合物14小時(shí)(IPC)。在完成反應(yīng)之后，在40℃下蒸發(fā)所述混合物(真空)。將所得到的油狀物加入25.70升水和25.70升MTBE中，并且攪拌30分鐘。分離有機(jī)相，并且用12.85升MTBE再次提取水層，向水相中添加25.70升MTBE，并且通過(guò)添加1N HCl(大約12升)將所述混合物的pH調(diào)節(jié)到pH2。分離有機(jī)層，并且用12.85升MTBE再次提取水相。將來(lái)自前面步驟的合并的有機(jī)層蒸發(fā)至干燥，以便得到1.88kg順-N-BOC 4，5-亞甲基脯氨酸(8.25mol％，82％)。
C.制備[1S-(1＜a，3＜b，5＜a)]-3-(氨基羰基)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-2-羧酸1，1-二甲基乙酯 將2.00kg順-N-BOC-4，5-亞甲基脯氨酸溶解在40.00升THF中，并且冷卻到-15℃。向該混合物中添加1.07kgN-甲基嗎啉(P0)。以一定方式向所述反應(yīng)混合物中填充1.32kg氯甲酸異丁酯，以使反應(yīng)溫度不超過(guò)-8℃。在完成添加之后，在-10℃下攪拌所述混合物30分鐘(P1，IPC1)。N-甲基嗎啉氫氯化物從所述反應(yīng)混合物中沉淀出來(lái)。
將所述反應(yīng)混合物加溫到-5℃，然后通過(guò)氣體入口管用氨(0.79kg，理論值5.00當(dāng)量)進(jìn)行清洗。然后將所述反應(yīng)混合物加溫到20-25℃，并且在該溫度下攪拌4小時(shí)(P2，IPC2)。向所述反應(yīng)混合物中添加40.00升飽和鹽水。然后通過(guò)添加飽和硫酸氫鉀溶液將所述混合物的pH調(diào)節(jié)到pH4-4.5。然后分離有機(jī)層，并且再次用20.00升MTBE提取水相。將合并的有機(jī)層蒸發(fā)至干燥。在回流溫度下將粗制產(chǎn)物溶解在8.00升乙酸丁酯中。產(chǎn)物在大約30℃下沉淀。在結(jié)晶開(kāi)始時(shí)，用20.00升庚烷緩慢處理所述混合物，并且再繼續(xù)攪拌2小時(shí)。通過(guò)過(guò)濾分離所述產(chǎn)物。用兩部分冰冷的乙酸丁酯/庚烷(1∶4)洗滌所述濾餅，每次使用1.6升，并且分別用2.00升庚烷洗滌2次，并且在30-35℃(真空)下干燥，以便得到1.64kg(7.22mol，82％)順-N-BOC 4，5-亞甲基脯氨酸酰胺(s-BOC-MPA)。
實(shí)施例36
BOC保護(hù)(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式V)，以便形成(＜aS)-＜a[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(VI)式VI酸將(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式V)(469克，2.08摩爾)溶解在相分離器(phase splitter)中的1NNaOH(5升，5摩爾，2.4當(dāng)量)中，該分離器裝有溫度探頭和pH探頭。將THF(2.5升)添加到該溶液中。然后添加固體Boc2O，并且在環(huán)境溫度下將所述反應(yīng)混合物攪拌約1小時(shí)。然后添加EtOAc(4升)，同時(shí)攪拌，并且分離所得到的有機(jī)層和水層。用濃HCl將水層的pH調(diào)節(jié)到7。然后添加EtOAc(4升)，并且添加額外的HCl，以便將pH降低到大約1。所添加的濃HCl的總體積為510ml。再次分離有機(jī)層和水層，并且用EtOAc(3×3升)提取水層。然后合并所述有機(jī)層，并用水(3升)和鹽水(3升)洗滌。然后用Na2SO4干燥洗滌過(guò)的有機(jī)層，并且在室溫下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮直到干燥。產(chǎn)量為542克的(＜aS)-＜a[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式K)。
實(shí)施例37偶聯(lián)反應(yīng)，以便產(chǎn)生3-氰基-(＜aS)-＜a-(3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-1-基)-＜b-氧代-(1S，3S，5S)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-2-乙烷氨基甲酸1，1-二甲基乙酯(式K)用(＜aS)-＜a[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式VI)(50克，153.8毫摩爾)填充2L三頸燒瓶，該燒瓶裝有溫度計(jì)，機(jī)械攪拌器和氣體入口。添加THF(200ml)并且攪拌，以便產(chǎn)生清澈的溶液。在丙酮-干冰-水浴中將該溶液冷卻到-6℃。然后作為一個(gè)部分添加甲磺酰氯(Mes-Cl)(13.1ml，169毫摩爾，1.1當(dāng)量)，然后添加二異丙基乙胺(94ml，539毫摩爾，1.1當(dāng)量)。用大約4分鐘時(shí)間緩慢添加二異丙基乙胺，以便將內(nèi)部溫度保持在低于8℃。在0℃下攪拌所述反應(yīng)混合物，直到所有酸被轉(zhuǎn)化成混合的酐。然后作為一個(gè)部分添加(1S，3S，5S)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-3-甲酰胺鹽酸鹽(32.5克，200毫摩爾，1.1當(dāng)量)和羥基苯并三唑(HOBT)(1.04克，7.6毫摩爾，0.05當(dāng)量)，并且將燒瓶中從冷水浴中取出。在室溫下攪拌所述反應(yīng)混合物2小時(shí)，然后在室溫下放置過(guò)夜。
實(shí)施例38BOC保護(hù)(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式V)，以便形成(＜aS)-＜a[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸1，4-二氮雜二環(huán)[2.2.2]辛烷鹽(式VIA)式VIA(DABCO鹽)將1，4-二氮雜二環(huán)[2.2.2]辛烷(DABCO)(15g；125.1毫摩爾)填充到由大約30g(135毫摩爾)的實(shí)施例36的式VI酸溶解在300ml的乙酸異丙酯中構(gòu)成的溶液中。將乙酸乙酯(150mL)填充到上述反應(yīng)混合物中(乙酸乙酯∶乙酸異丙酯的體積比為(150mL/300mL))。用式VIA DABCO鹽(200mg)接種所述反應(yīng)混合物。在室溫下劇烈攪拌所述反應(yīng)混合物。將水(5mL)緩慢填充到所述反應(yīng)混合物中，并且在室溫下劇烈攪拌所述反應(yīng)混合物，以便在15-20分鐘之后誘導(dǎo)晶體形成。在室溫下攪拌所述反應(yīng)混合物16小時(shí)，并且用布氏漏斗過(guò)濾反應(yīng)產(chǎn)物。在室溫下用乙酸乙酯洗滌所述固體，并且在50℃下在真空中干燥，以便得到47g(79％)的式VIA DABCO鹽。
實(shí)施例39偶聯(lián)反應(yīng)，以便產(chǎn)生3-氰基-(＜aS)-＜a-(3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-1-基)-＜b-氧代-(1S，3S，5S)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-2-乙烷氨基甲酸1，1-二甲基乙酯(式K)用按照實(shí)施例38所述制備的(＜aS)-＜a[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸1，4-二氮雜二環(huán)[2.2.2]辛烷鹽(式VIA)(5克，11.44毫摩爾)填充250L三頸燒瓶，該燒瓶裝有溫度計(jì)，機(jī)械攪拌器和氣體入口。添加THF(25ml)并且攪拌，以便產(chǎn)生漿。在冰水浴中將所述漿冷卻到0℃。然后作為一個(gè)部分添加甲磺酰氯(Mes-Cl)(1.15ml，14.85毫摩爾，1.3當(dāng)量)，然后添加二異丙基乙胺(94ml，40毫摩爾，3.5當(dāng)量)。用大約4分鐘時(shí)間緩慢添加二異丙基乙胺，以便保持內(nèi)部溫度低于5℃。在0℃下攪拌所述反應(yīng)混合物10分鐘，直到所有的酸被轉(zhuǎn)化成混合的酐。然后作為一個(gè)部分添加(1S，3S，5S)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-3-甲酰胺鹽酸鹽(2.42克，14.9毫摩爾，1.3當(dāng)量)和羥基苯并三唑(HOBT)(77mg，0.57毫摩爾，0.05當(dāng)量)，并且將燒瓶從冷水浴中取出。在室溫下攪拌所述反應(yīng)混合物2小時(shí)，并且在室溫下放置過(guò)夜。
實(shí)施例40脫水和水解，以便產(chǎn)生3-氰基-(＜aS)-＜a-(3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-1-基]-＜b-氧代-(1S，3S，5S)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-2-乙烷氨基甲酸1，1-二甲基乙酯(式L)將吡啶(6當(dāng)量，922毫摩爾，74.6ml)添加到實(shí)施例39的反應(yīng)混合物中，并且在冷水浴中將所述反應(yīng)混合物冷卻到-8℃。然后用6分鐘時(shí)間緩慢添加三氟乙酸酐(TFAA)(4當(dāng)量，616毫摩爾，87ml)，同時(shí)保持溫度低于10℃。在24℃下攪拌該反應(yīng)物0.5小時(shí)，并且通過(guò)HPLC(30ml，0.5ml AcN，0.5ml H2O)檢查實(shí)施例37的化合物K的消失。
然后在冷水浴中將所述反應(yīng)物冷卻到大約-3℃。用10分鐘時(shí)間將NaOH(5N，6當(dāng)量，0.925mol，185ml)添加到所述反應(yīng)物中(含水，pH＝9.9)，同時(shí)保持反應(yīng)溫度低于10℃。用5分鐘時(shí)間添加K2CO3水溶液(319克，15當(dāng)量，溶解在510ml H2O中)(溫度＝8℃，含水的pH11.1)。讓所述反應(yīng)進(jìn)行7小時(shí)40分鐘。當(dāng)通過(guò)HPLC(30μl，0.5ml AcN，0.5ml H2O)測(cè)定所有中間體被水解成倒數(shù)第二種時(shí)反應(yīng)就完成了。
然后將EtOAc(500ml)添加到所述反應(yīng)混合物中，并且分離所得到的水層和有機(jī)層。用500ml緩沖溶液(2M H3PO4，1M NaH2PO4)洗滌所述有機(jī)層。溫度從15℃上升到23℃；添加時(shí)間5分鐘，水層V＝560ml，pH＝4.5，通過(guò)HPLC分析得到了32mg產(chǎn)物；有機(jī)層V＝1080ml。用另外500ml緩沖液洗滌所述有機(jī)層；水層V＝780ml，pH＝2.5，通過(guò)HPLC分析得到了415mg產(chǎn)物；有機(jī)層V＝800ml，1.02v/v％吡啶。用300ml鹽水洗滌有機(jī)層；水層V＝350ml，pH＝1.8，通過(guò)HPLC分析得到了20mg產(chǎn)物。用130ml飽和NaHCO3溶液洗滌有機(jī)層；水層V＝176ml，pH＝6.0，780mg產(chǎn)物。用300ml半飽和鹽水洗滌有機(jī)層；水層V＝330ml，pH＝5.2，25mg產(chǎn)物；有機(jī)層V＝650ml，吡啶0.045v/v％。將5g Darco添加到有機(jī)層中，并且攪拌5分鐘，通過(guò)50g硅石過(guò)濾，用4×25ml EtOAc洗滌，有機(jī)層V＝750ml，吡啶0.04v/v％。
然后將所述有機(jī)層蒸餾到大約133ml。將所述有機(jī)層攪拌1小時(shí)，直到溶液變渾濁。用15分鐘時(shí)間添加133ml庚烷，并且攪拌所述漿過(guò)夜。添加133ml庚烷過(guò)夜。通過(guò)機(jī)械攪拌劇烈攪拌所述混合物20分鐘。將固體過(guò)濾掉，并且用50ml 5％EtOAc/庚烷洗滌濾餅；在從母液中除去溶劑之后，在8.86g粗制產(chǎn)物中得到了3.4g產(chǎn)物。在50℃下，在真空條件下干燥產(chǎn)物晶體過(guò)夜。獲得了467g產(chǎn)物，大約73％，96.6AP。
實(shí)施例41脫保護(hù)，以便產(chǎn)生(1S，3S，5S)-2-[(2S)-2-氨基-2-(3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-1-基]-1-氧代乙基)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-3-腈苯甲酸鹽(1∶1)(式M)將3-氰基-(＜aS)-＜a-(3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-1-基)-＜b-氧代-(1S，3S，5S)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-2-乙烷氨基甲酸1，1-二甲基乙酯(式L)(5.0克，12.04毫摩爾)填充到三頸燒瓶中，該燒瓶裝有溫度計(jì)，機(jī)械攪拌器和氣體入口。添加大約45-50mlEtOAc，以便獲得清澈溶液。在室溫下添加濃HCl(3.00ml，37％w/w％，36.14毫摩爾，3當(dāng)量)，并且攪拌所述反應(yīng)混合物，直到產(chǎn)生固體。然后添加水(30ml)，并且攪拌該混合物1-2分鐘。將該反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到分液漏斗上，并且讓所述反應(yīng)混合物的各個(gè)層分離成明確的相分離物。用25％NaOH將水層調(diào)節(jié)到大約6的較低pH，同時(shí)保持溫度低于25℃。
通過(guò)以下方法進(jìn)行鹽交換將異丙醇(IPA；2-3ml)添加到水層中，然后添加苯甲酸鈉(0.65ml的苯甲酸鈉溶液，通過(guò)將2.6克苯甲酸鈉溶解在6.5ml水中制備)。然后通過(guò)附加漏斗以滴加方式添加剩余的苯甲酸鈉溶液。在室溫下攪拌所得到的反應(yīng)混合物16-24小時(shí)。然后在布氏漏斗上過(guò)濾所述反應(yīng)混合物中的固體，并且用水洗滌，直到固體在用AgNO3測(cè)試時(shí)對(duì)Cl-呈陰性。然后用庚烷(10ml)洗滌所述固體，以便排除水，在漏斗上風(fēng)干，并且在真空烘箱中在35℃下干燥，直到KF≤5％。收率為79％，4.1克。
實(shí)施例42L的脫保護(hù) 以便產(chǎn)生游離堿M′ 將實(shí)施例38的化合物(L)(300g，0.723mol，效力為90.6％)，二氯甲烷(3L)，甲醇(288ml，7.23摩爾)和濃(36％)鹽酸(288ml，7.23摩爾)填充到3頸12L燒瓶中，該燒瓶裝有機(jī)械攪拌器，溫度探頭和N2氣體入口。進(jìn)行反應(yīng)，同時(shí)將反應(yīng)溫度保持在大約20至大約25℃范圍內(nèi)。攪拌所述反應(yīng)混合物18小時(shí)，分離成兩相，并且收集上部水層。向水層中添加二氯甲烷(6L)和水(720ml)，并且滴加5N NaOH(大約600ml)，以便將pH調(diào)節(jié)到9.0-10.5。
有機(jī)相含有鹽酸鹽 (通過(guò)HPLC鑒定)(式L′)，用二氯甲烷(6L)和水(720ml)處理，并且滴加5N氫氧化鈉溶液(大約600ml)，同時(shí)將反應(yīng)溫度保持在20-25℃，以便將pH調(diào)節(jié)到9-10.5。添加NaCl(120g)，并且攪拌所述混合物20分鐘，以便產(chǎn)生相分離物。收集所述有機(jī)層(6.2L)(含有大約174g的化合物M′)，并且棄掉水層(1.75L)(含有6.5g化合物M′)。
用1％NH4Cl鹽水溶液(450ml)洗滌所述有機(jī)層。(1％NH4Cl鹽水溶液含有1g NH4Cl，25g NaCl和74g H2O)。從所得到的相分離物中回收了6.0L有機(jī)層(在溶液中含有大約176g化合物M′)，并且棄掉含有1.4g化合物M′(～0.4％)的水層(0.45L)。
將乙酸乙酯(大約4L)添加到所述有機(jī)層中，同時(shí)在25℃/50mmHg條件下將CH2Cl2蒸餾掉。當(dāng)達(dá)到2.5L的最終體積時(shí)終止蒸餾。對(duì)所述有機(jī)層進(jìn)行精煉過(guò)濾，以便除掉固體NaCl，并且濃縮到大約1Kg(大約170g化合物M′存在于1L乙酸乙酯中)。GC分析DCM＜0.1％。滴加水(17ml)，并且在10分鐘之后開(kāi)始結(jié)晶。添加17ml水，并且攪拌所得到的漿30分鐘，過(guò)濾，用乙酸乙酯洗滌濾餅，并且在室溫下，在真空條件下干燥，以便得到186g的化合物M′，收率為81％。
序列表<110>Bristol-Myers Squibb Company<120>用于生產(chǎn)二肽基肽酶IV抑制劑和它的中間體的方法和化合物<130>LA0084<150>60/431,814<151>2002-09-12<160>5<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>26<212>DNA<213>合成的<400>1tcgtcatgaa aatcgttctc gttttg 26<210>2<211>28<212>DNA<213>合成的<400>2tactgttttt ccagcgtatt cctaggct28<210>3<211>33<212>DNA<213>合成的<400>3gatgctcata tgcgcgacgt gtttgaaatg atg 33<210>4<211>30<212>DNA<213>合成的<400>4gatcccgggc taaggcgaat taataattcg 30<210>5<211>17<212>PRT<213>合成的
<400>5Asn Ser A1a Glu Gly Tyr Leu Glu Pro Arg Arg Pro Arg Ile Asn Ser1 5 10 15Pro
權(quán)利要求
1.一種化合物，包括具有式IA的結(jié)構(gòu) 或它的可以藥用的鹽，其中R1選自H和OH；R2選自-C(＝O)-COR4、-C(＝O)NR5R6、-C(X)n-COR4和C-NR7R8COR4，其中X是鹵素；n是1-2R4選自O(shè)-烷基、NH2和OH；和R5、R6、R7和R8分別選自H和COOR9，其中，R9是取代過(guò)的或未取代過(guò)的烷基；和R3選自H、OH和R10，其中，R10是NHR11C(＝O)R12，R11是R13COOH，R12是 且R13是烷基或芳基.
2.如權(quán)利要求1的化合物，其中，所述結(jié)構(gòu)包括式I，
3.如權(quán)利要求1的化合物，其中，所述結(jié)構(gòu)包括式II，
4.如權(quán)利要求1的化合物，其中，所述結(jié)構(gòu)包括式V，
5.如權(quán)利要求1的化合物，其中，所述結(jié)構(gòu)包括式VI， 或它的DABCO鹽VIA
6.如權(quán)利要求1的化合物，其中，所述結(jié)構(gòu)包括式VII，
7.如權(quán)利要求1的化合物，其中，所述結(jié)構(gòu)包括式VIII，
8.如權(quán)利要求1的化合物，其中，所述結(jié)構(gòu)包括式IX
9.一種化合物，包括具有式IV的結(jié)構(gòu)，
10.一種用于生產(chǎn)基于環(huán)丙基-稠合的吡咯烷的二肽基肽酶IV抑制劑的方法，包括(a)將(＜aS)-＜a[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸或它的1，4-二氮雜二環(huán)[2.2.2]辛烷鹽偶聯(lián)在(1S，3S，5S)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-3-甲酰胺上，以便產(chǎn)生3-(氨基羰基)-＜aS)-＜a-(3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-1-基)-＜b-氧代-(1S，3S，5S)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-2-乙烷氨基甲酸1，1-二甲基乙酯；(b)使3-(氨基羰基)-＜aS)-＜a-(3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-1-基)-＜b-氧代-(1S，3S，5S)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-2-乙烷氨基甲酸1，1-二甲基乙酯脫水，以便產(chǎn)生3-氰基-(＜aS)-＜a-(3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-1-基)-＜b-氧代-(1S，3S，5S)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-2-乙烷氨基甲酸1，1-二甲基乙酯；和(c)水解3-氰基-(＜aS)-＜a-(3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-1-基)-＜b-氧代-(1S，3S，5S)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-2-乙烷氨基甲酸1，1-二甲基乙酯，以便形成二肽基肽酶IV抑制劑。
11.如權(quán)利要求10的方法，其中，步驟(a)的(＜aS)-＜a[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸是通過(guò)用BOC保護(hù)(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸生產(chǎn)的。
12.如權(quán)利要求10的方法，還包括通過(guò)氨基化作用或轉(zhuǎn)氨基作用不對(duì)稱地還原3-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸，以便產(chǎn)生(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸。
13.如權(quán)利要求10的方法，還包括用三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸化學(xué)合成(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸。
14.如權(quán)利要求10的方法，其中，步驟(a)的(1S，3S，5S)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-3-甲酰胺是通過(guò)從[1S-(1＜a，3＜b，5＜a)-3-氨基羰基]-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-2-羧酸1，1-二甲基乙酯上除掉BOC生產(chǎn)的。
15.如權(quán)利要求14的方法，其中，[1S-(1＜a，3＜b，5＜a)-3-氨基羰基]-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-2-羧酸1，1-二甲基乙酯是通過(guò)Simmons-Smith反應(yīng)使(5S)-5-氨基羰基-4，5-二氫-1H-吡咯-1-羧酸1，1-二甲酯環(huán)丙烷化產(chǎn)生的。
16.一種用于生產(chǎn)如權(quán)利要求4所限定的(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸的方法，包括通過(guò)酶促氨基化作用或轉(zhuǎn)氨基作用來(lái)不對(duì)稱地還原3-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸。
17.一種用于生產(chǎn)如權(quán)利要求4所限定的(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸的方法，包括(a)將三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸水解成α-溴代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸；(b)讓?duì)?溴代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸與H2SO4和HNO3起反應(yīng)，以便產(chǎn)生α-溴代-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸；(c)將α-溴代-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸溶解在氫氧化銨中，并且對(duì)所述反應(yīng)混合物加熱；(d)濃縮所述反應(yīng)混合物，以便產(chǎn)生手性混合物(＜aS)-＜a-氨基-3羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸；和(e)從手性混合物中分離(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式V)。
18.如權(quán)利要求15的方法，其中，(5S)-5-氨基羰基-4，5-二氫-1H-吡咯-1-羧酸1，1-二甲酯是通過(guò)以下方法生產(chǎn)的通過(guò)用氫氧化鋰皂化來(lái)水解4，5-二氫-1H-吡咯-1，5-二羧酸[1-(1，1-二甲基乙基)，5-乙基]酯，并且與混合的酐和甲磺酰氯形成酰胺。
19.一種細(xì)胞系，其能夠通過(guò)對(duì)3-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式II)進(jìn)行不對(duì)稱還原性氨基化作用或轉(zhuǎn)氨基作用，生產(chǎn)如權(quán)利要求4所限定的(＜aS)-＜a-氨基-3-羥基三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸(式V)。
20.一種用于生產(chǎn)如權(quán)利要求3所限定的3-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸的方法，包括在存在有機(jī)溶劑的條件下用堿金屬堿處理二氯-(3-羥基-金剛烷-1-基)-乙酸烷基酯，以便形成含有相應(yīng)的堿金屬鹽的反應(yīng)混合物，用酸處理所述反應(yīng)混合物，以便形成相應(yīng)的3-羥基-＜a-氧代三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷-1-乙酸產(chǎn)物。
21.如權(quán)利要求20所限定的方法，其中，所述產(chǎn)物的形成是通過(guò)單罐方法完成的。
22.如權(quán)利要求20所限定的方法，其中，所述堿金屬堿是氫氧化鈉，而所述酸是鹽酸。
23.一種用于生產(chǎn)如權(quán)利要求9所限定的(5S)-5-氨基羰基-4，5-二氫-1H-吡咯-1-羧酸1-(1，1-二甲基乙基)酯(IV)的方法，包括提供4，5-二氫-1H-吡咯-1，5-二羧酸1-(1，1-二甲基乙基)酯的堿金屬鹽，和用4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鎓氯化物和堿處理pH低于7的所述堿金屬鹽的溶液，以便形成(5S)-5-氨基羰基-4，5-二氫-1H-吡咯-1-羧酸1-(1，1-二甲基乙基)酯(IV)。
24.如權(quán)利要求23所限定的方法，其中，所述堿金屬鹽是用作為堿的氨處理的。
25.如權(quán)利要求23所限定的方法，其中，所述堿金屬鹽是通過(guò)用堿金屬堿處理4，5-二氫-1H-吡咯-1，5-二羧酸1-(1，1-二甲基乙基)酯的二環(huán)己基胺鹽，以便形成相應(yīng)的堿金屬鹽而形成的。
26.如權(quán)利要求23所限定的方法，其中，所述堿金屬鹽是通過(guò)提供4，5-二氫-1H-吡咯-1，5-二羧酸1-(1，1-二甲基乙基)酯XI的乙酯，并且用乙醇和氫氧化鈉處理所述乙酯形成的。
27.如權(quán)利要求25所限定的方法，其中，所述二環(huán)己基胺鹽是通過(guò)以下方法制備的用氫氧化鈉處理存在于乙醇和甲苯中的4，5-二氫-1H-吡咯-1，5-二羧酸1-(1，1-二甲基乙基)酯的溶液，以便形成相應(yīng)的鈉鹽，并且用叔丁基甲醚和庚烷處理所述鈉鹽，以便形成鈉鹽的溶液，將所述鈉鹽溶液的pH降低到大約2.5-大約3，同時(shí)保持溫度＜5℃，分離出所得到的有機(jī)層，并且用二環(huán)己基胺處理所述有機(jī)層，以便形成相應(yīng)的二環(huán)己基胺鹽。
28.一種制備具有以下結(jié)構(gòu)的[1S-(1＜a，3＜b，5＜a)]-3-(氨基羰基)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-2-羧酸1，1-二甲基乙酯的方法， 包括用二乙基鋅和氯碘甲烷處理4，5-二氫-1H-吡咯-1，5-二羧酸[1-(1，1-二甲基乙基)，5-乙基]酯溶液，并且將溫度降低到大約-20℃或更低，以便形成N-BOC-亞甲基脯氨酸乙酯的順式-和反式-同分異構(gòu)體的混合物，用甲胺的水溶液處理上述同分異構(gòu)體的混合物，以便分離出順-BOC-4，5-亞甲基脯氨酸乙酯同分異構(gòu)體，用強(qiáng)堿處理順式同分異構(gòu)體，以便產(chǎn)生順-N-BOC-4，5-亞甲基脯氨酸，并且用N-甲基嗎啉和氯甲酸異丁酯、鹽水和氨處理順-N-BOC-4，5-亞甲基脯氨酸，以便形成[1S-(1＜a，3＜b，5＜a)-3-(氨基羰基)-2-氮雜二環(huán)[3.1.0]己烷-2-羧酸1，1-二甲基乙基乙酯。
29.一種用于生產(chǎn)具有以下結(jié)構(gòu)的中間體K的方法 該方法包括提供受保護(hù)的化合物VI 用甲磺酰氯和Hunig堿以及具有以下結(jié)構(gòu) 的化合物J和1-羥基苯并三唑(HOBT)一起處理化合物VI，以便形成化合物K。
30.一種用于制備具有結(jié)構(gòu)M′的游離堿化合物的方法 其包括提供具有結(jié)構(gòu)L的受保護(hù)的化合物 并且用鹽酸處理化合物L(fēng)，以便形成相應(yīng)的鹽酸鹽L′ 用鹽酸和氫氧化鈉處理化合物L(fēng)′，以便形成游離堿化合物M′。
31.如權(quán)利要求30所限定的方法，其中，化合物L(fēng)是通過(guò)以下步驟形成的在存在吡啶和三氟乙酸酐的條件下，使中間體K 脫水，然后在存在強(qiáng)堿的情況下水解所述反應(yīng)產(chǎn)物，以便形成化合物L(fēng)。
全文摘要
提供了用于生產(chǎn)基于環(huán)丙基－稠合的吡咯烷的二肽基肽酶IV抑制劑的方法和化合物。
文檔編號(hào)C07D209/02GK1791401SQ200380109631
公開(kāi)日2006年6月21日 申請(qǐng)日期2003年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月9日
發(fā)明者T·C·伍, D·B·布爾佐佐夫斯基, R·?？怂? J·D·小戈德弗里, R·L·漢森, S·V·科洛塔欽, J·A·小馬祖洛, R·N·帕特爾, J·王, K·王, J·于, J·朱, D·R·馬尼安, D·J·奧格里, L·G·哈曼 申請(qǐng)人:布里斯托爾-邁爾斯斯奎布公司