一種對米克戴德軍團菌wzx的特異的核苷酸及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種對米克戴德軍團菌的wzx基因特異的核苷酸及其應用，所述核苷酸為：SEQIDNO:1所示的核苷酸和/或SEQIDNO:2所示的核苷酸；與上述的核苷酸互補的核苷酸。這些核苷酸可用于制備檢測米克戴得軍團菌的PCR試劑盒、基因芯片或微陣列。本發(fā)明的對米克戴得軍團菌的wzx基因特異的核苷酸及包含該核苷酸的PCR試劑盒、基因芯片或微陣列的實用性強，PCR試劑盒配制方法簡便，檢測周期短、速度快，可操作性強，易于商品化生產(chǎn)，而檢測成本卻相對較低；準確性高；靈敏度高。
【專利說明】—種對米克戴德軍團菌WZX的特異的核苷酸及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種核苷酸及其應用，尤其涉及一種對米克戴得軍團菌ilegionella
micdadei)的wzx(LPS O-抗原轉(zhuǎn)運酶Wzx, transportase of LPS Ο-antigen,以下簡稱》
基因特異的核苷酸及其應用。
【背景技術】
[0002]軍團菌是一種需氧型的革蘭氏陰性桿菌，長約1.2飛μ m，直徑約0.3、.5 μ m，沒有芽孢和莢膜，不產(chǎn)酸，不產(chǎn)氣，菌體有一至數(shù)根端鞭毛或側鞭毛，可以運動。該菌可在藻類、原生動物(阿米巴)內(nèi)寄居，也可在人類單核細胞和巨噬細胞內(nèi)以兼性胞內(nèi)寄生方式生存。由于該菌的細胞壁具有獨特的泛醌和脂肪酸譜結構，因此常用Dieterle鍍銀染料(呈黑褐色)或Giemsa染色(呈紅色)對其進行鑒定。
軍團菌在厭氧條件下生長，在含有2%~5%的CO2環(huán)境中生長良好，最適生長溫度為35V~36°C，最適pH為6.7~7.0，具有一定的耐熱性和耐酸性。該菌在普通瓊脂、血平板、巧克力瓊脂的培養(yǎng)基上均不生長，生長時需要L-半胱氨酸、甲硫氨酸和三價鐵離子等，在活性炭-酵母浸出液瓊脂(BCYE)培養(yǎng)基上可形成整齊、表面光滑的菌落。菌落顏色可見白色、紫色、藍色、綠色、深褐色、灰綠色、深紅色等，在紫外燈照射下，菌落可發(fā)出熒光。軍團菌一直未被發(fā)現(xiàn)，原因之一就在于該菌有較高的營養(yǎng)要求，人工培養(yǎng)及其困難，被成為“苛養(yǎng)菌”。
軍團菌最初是在美國發(fā)現(xiàn)的，對自然環(huán)境因素抵抗力較強，主要是引起呼吸道傳染疾病，可通過氣溶膠的方式在空氣中散布，人類會因為吸入含菌的氣溶膠而感染，引起軍團病(Legionnaires disease, LD)。目前已知軍團菌有52個種70多個血清型，能引起人類疾病的約有20種。常見的有嗜肺軍團菌iLegi one I lapneumophi la, LP)>米氏軍團菌 iLegionella micdadei )、博氏軍團菌{Legionella bozemanii )、菲氏軍思麗iLegionellafeeleiH杜莫夫軍團菌(Z6^io/?<977a dumoffi1、熱長灘軍團菌iLegionella 1ngbeachae)等。
嗜肺軍團菌是引起軍團病的主要病原菌，而米克戴德軍團菌位列第二。米克戴德軍團菌是一種兼性胞內(nèi)致病菌，廣泛存在于天然淡水環(huán)境或人工水域中，能入侵阿米巴原蟲和人體巨噬細胞，是引起軍團病的重要病原體。吸入肺部的米克戴德軍團菌，被巨噬細胞吞噬并在其胞內(nèi)增殖，破出后再感染其他巨噬細胞，反復感染可引起嚴重的非典型肺炎。
隨著分子技術特別是PCR技術的發(fā)展，許多分子生物學方法被用于軍團菌分子分型和流行病學研究。目前已用于軍團菌分型的4種常用分子分型技術為:隨機擴增多態(tài)性 DNA (Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)、脈沖場凝膠電泳(Pulsed-FieldGel Electrophoresis, PFGE)、擴增片段長度多態(tài)性(Amplified fragment lengthpolymorphism, AFLP)、核酸測序分型(Sequence-based typing, SBT)。由于其一次即可分離出大量DNA片段，且具有操作簡便，重復率好等優(yōu)勢，先后用于軍團菌分子分型和流行病學調(diào)查。聚合酶鏈式反應技術(Polymerase chain reaction,簡稱PCR技術)作為微生物檢測的技術目前正在得到認同和推廣，該技術相對于傳統(tǒng)的方法有高通量、檢測速度快、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，只需對樣品進行簡單的預增菌或增菌過程，再通過離心及裂解制備細菌DNA模板，就可以在高特異性引物介導下的PCR過程中擴增目標序列，達到檢測樣品中是否含有待測的致病性微生物的目的。PCR的擴增過程僅需2個小時。這對檢驗檢疫部門和臨床檢驗無疑極大提高了工作速度和降低了工作成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種對米克戴德軍團菌的壓基因特異的核苷酸，所述核苷酸為:
1）SEQ ID NO:1所示的核苷酸和/或SEQ ID N0:2所示的核苷酸；
2)與1)所示的核苷酸互補的核苷酸。其中與SEQ ID N0:1互補的序列SEQ ID N0:3,其核酸序列為:TAAAGCATTTGGAAACTGAAGG ;與 SEQ ID N0:2 互補的序列 SEQ ID NO:4 (互補)，其核酸序列為:CTTGGGCTTATGCACTGA。
上述核苷酸可以用于制備檢測米克戴德軍團菌的wzx基因的PCR試劑盒、基因芯片或微陣列；所述米克戴德軍團菌可以取樣于自來水、礦泉水、空調(diào)冷卻水的培養(yǎng)物的粗提液，或是米克戴德軍團菌的純培養(yǎng)物的粗提液等，均采用常規(guī)的酚氯仿法制備。
本發(fā)明進一步公開了 PCR試劑盒在制備用于檢測米克戴得軍團菌方面的應用。其主要指的是軍團菌目軍團菌屬中的一個種，即Legi onella mi cdei da。
本發(fā)明還提供一種PCR試劑盒，包括PCR引物、dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，所述PCR引物包括上述的核苷酸；其中所述的PCR引物優(yōu)選為如SEQ ID N0:1和/或SEQ ID N0:2所示的核苷酸。
SEQ NO:1 ATTTCGTAAACCTTTGACTTCC特異擴增米克戴德軍團菌的似義基因上游引物 SEQ NO: 2 GAACCCGAATACGTGACT特異擴增米克戴德軍團菌的似義基因下游引物 上述多重PCR檢測試劑盒可以包括如下試劑:
10 mM dNTP 20 μ L ;10X酶特異性反應緩沖液50 μ L ;
5U/μ L耐熱DNA聚合酶8yL;引物各IOyL;
陽性對照品IOyL,陰性對照品10 μ L ；ddH20 5mL。
上述針對米克戴德軍團菌的PCR試劑盒，整個檢測步驟包括樣品預處理一擴增一電泳檢測結果。引物和PCR反應體系所需要的試劑已預先加入擴增管中，使用者只需將預處理后的樣本加入擴增管啟動擴增反應即可，簡單快速的完成檢測工作。
本發(fā)明還提供一種基因芯片，包括固相載體和固定在固相載體上的寡核苷酸探針，其中所述寡核苷酸探針包括上述的核苷酸；其中所述核苷酸優(yōu)選為如SEQ ID NO:1和/或SEQID N0:2所示的核苷酸(見實例4)。
由上述的技術方案可見，本發(fā)明建立的一種PCR反應體系，可檢測米克戴德軍團菌，該試劑盒有如下優(yōu)點:
(I)方法簡便，周期短、速度快、可操作性強:本發(fā)明所配制的PCR試劑盒配制方法簡便，檢測速度快、周期短，可操作性強，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，而檢測成本卻較低，市場應用前景廣。本發(fā)明PCR試劑盒若用米克戴德軍團菌的懸液進行PCR擴增，與經(jīng)提取得到的DNA作為模板擴增所得結果一致，且敏感度和特異性無差別，可省去模板DNA的提取步驟，使操作方法得以簡化。同時，相比常規(guī)生化檢測方法而言，本方法所采用的待測樣品可以直接是臨床樣品培養(yǎng)液，或者對檢測樣品進行簡單分離培養(yǎng)就可進行檢測，因而節(jié)省了物力人力。
(2)檢測靈敏度高:本發(fā)明提供的PCR檢測試劑盒及其檢測方法敏感性高，檢測精度高，可以檢測到Ing/μ L的DNA模板。對常見致病菌可以進行全面、系統(tǒng)、準確的檢測與鑒定。
(3)檢測成本相對較低:可以推廣應用于食品衛(wèi)生監(jiān)督、環(huán)境監(jiān)測、商品檢驗檢疫等領域，并為其他不同致病菌檢測組合提供技術模式。
(4)準確性高:本發(fā)明根據(jù)米克戴德軍團菌的》基因的特異核苷酸序列，設計出引物。從而利用引物組合成復合PCR檢測體系，能夠直接將米克戴德軍團菌與其他近源菌分開。
[0004]【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1為本發(fā)明的試劑盒檢測兩株米克戴得軍團菌結果圖，其中:1為米克戴得軍團菌G2823 ；2 為米克戴得軍團菌 G3415 ；Μ 為 DL2000 DNA marker ；
圖2為本發(fā)明試劑盒檢測軍團菌屬非米克戴得軍團菌電泳結果圖，其中:1，米克戴得軍團菌G2823 ;2，長灘軍團菌G3416 ;3，博茲曼軍團菌G3417 ;4，邁氏軍團菌G4759 ;5，費菲軍團菌G4642 ;6，杜莫夫軍團菌G3418 ;7，嗜肺軍團菌G2817 ;8，安氏軍團菌G28626 ;9，戈爾曼軍團菌 G2827 ;10，喬丹河軍團菌 G4758 ； M, DL2000 DNA marker ；
圖3為本發(fā)明試劑盒檢測其它種屬近源菌種標準菌株電泳結果圖，其中:1，米克戴得軍團菌G2823;2，志賀氏菌；3，銅綠色假單胞菌；4，沙門氏菌；5，奇異變形桿菌；6金黃色葡萄球菌；M, DL2000 DNA marker ；
圖4為芯片點制不意圖。
[0005]【具體實施方式】:
為保證本發(fā)明的上述和其它目的特征和優(yōu)點更明白易懂，下面特舉較佳實施例，同時結合說明書附圖及具體實例對本發(fā)明進一步詳細描述。
實施例1:
基因組的提取
(O在超凈工作臺中，從菌種保藏管中吸取少量菌液，劃線接種到軍團菌BCYE生長平板上，37 0C，5.0% CO2 培養(yǎng) 5-7 天。
(2)向BCYE生長平板中加入2mL無菌水，用無菌圓頭玻璃棒輕輕刮起菌苔，然后將菌懸液吸到1.5 mL離心管中,8000 rpm離心5分鐘,棄上清,重復洗一次。
(3)加入250 yL 50 mM Tris-HCl 緩沖液(pH 8.0)重懸，12000 rpm 離心 5 分鐘，棄上清。
(4)加入250 μ L 50 mM Tris-HCl 緩沖液(pH 8.0)重懸，再加 10 μ L 0.45Μ EDTA (pH
8.0)，充分懸浮，37°C溫浴20分鐘。
(5)加入10UL 20 mg/mL溶菌酶，37°C溫浴20分鐘。
(6)加入1.5UL 20 mg/mL蛋白酶K，輕柔混勻。
(7)加入15μ L 10%SDS, 50°C水浴2小時至溶液澄清，期間輕輕顛倒混勻若干次。
(8)加2 μ L 20 mg/mL RNAse，65°C水浴 30 分鐘。(9)用剪去尖頭的槍頭將上述溶液移到新的潔凈離心管中。
(10)在通風櫥中加入250μ L苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，充分混勻，12000 rpm,4°C離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管，重復一次。
(11)在通風櫥中加入250UL氯仿:異戊醇(24:1)，充分混勻，12000 rpm，4°C離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管。
(12)加入2.5倍體積的提前預冷的無水乙醇，輕搖，于-80°C沉淀DNA。12000 rpm，
4。。離心 15 min。
(13)用ImL 70%冰乙醇洗滌DNA沉淀，然后在65°C，10 min烘干。
(14)用30 UL TE溶解，并于-20 ° C冰箱備用。
用1.0 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取效果，同時用NanoDrop2000 OD儀測量DNA的純度和濃度。
實施例2:
引物的設計
米克戴得軍團菌全基因組是由本實驗室破譯的，同時其O-抗原基因簇序列也是本實驗室自測的，通過比對分析，選取基因作為該菌的特異靶基因，針對米克戴得軍團菌的wzx基因的特異區(qū)設計引物；如表1所示，上游引物是5’- ATTTCGTAAACCTTTGACTTCC -3’，見序列 SEQ ID NO:1 ;下游引物是 5’ - GAACCCGAATACGTGACT-3’，見序列 SEQ ID N0:2。
表1米克戴得軍團菌的特異引物序列
【權利要求】
1.一種對米克戴德軍團菌的WZX基因特異的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸具有: O SEQ ID NO:1所示的核苷酸和/或SEQ ID N0:2所示的核苷酸； 2)與I)所示的核苷酸互補的核苷酸:SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4。
2.—種PCR試劑盒，包括PCR引物、dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，所述PCR引物包括上述的核苷酸；其中所述的PCR引物為如SEQ ID N0:1和/或SEQ ID N0:2所示的核苷酸。
3.權利要求2所述的試劑盒，其中的SEQNO:1 ATTTCGTAAACCTTTGACTTCC為特異擴增米克戴得軍團菌的WZX基因上游引物；SEQ NO: 2 GAACCCGAATACGTGACT為特異擴增米克戴得軍團菌的wzx基因下游引物。
4.權利要求2所述的試劑盒，其中還包括如下試劑: 10 mM dNTP 20 μ L ;10X酶特異性反應緩沖液50 μ L ; 5 U/μ L耐熱DNA聚合酶8μ L ；SEQ NO:1引物和SEQ NO: 2引物各10 μ L ； 陽性對照品IOyL,陰性對照品10 μ L ；ddH20 5mL。
5.一種基因芯片，包括固相載體和固定在固相載體上的寡核苷酸探針，其中所述寡核苷酸探針為如SEQ ID ΝΟ:1和/或SEQ ID NO:2所示的核苷酸。
6.權利要求2所述 PCR試劑盒在制備用于檢測米克戴得軍團菌方面的應用。
7.權利要求6所述的應用，其中的米克戴得軍團菌指的是軍團菌目軍團菌屬中的一個f中，即 Legionella micdeida。
【文檔編號】C40B40/06GK103757092SQ201310508634
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年10月24日 優(yōu)先權日:2013年10月24日
【發(fā)明者】王磊, 曹勃陽, 徐洋洋, 馮露 申請人:南開大學