專利名稱：檢測(cè)炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌及嗜肺軍團(tuán)菌多重實(shí)時(shí)熒光pcr的引物、探針序列及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)病原微生物的PCR引物、探針序列及方法，尤其是一種同時(shí) 檢測(cè)炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌及嗜肺軍團(tuán)菌多重實(shí)時(shí)熒光PCR的引物、探針序列及方法，屬 于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
炭疽桿菌能引起羊、牛、馬等動(dòng)物及人類的炭疽病，嚴(yán)重威脅公眾財(cái)產(chǎn)、健康和生 命安全。鼠疫耶爾森菌可引起烈性傳染病鼠疫，疾病傳播快，病死率高(70% -100% )，歷 史上發(fā)生過多次毀滅性的流行，也是經(jīng)典的致死性細(xì)菌。嗜肺軍團(tuán)菌可由氣溶膠介導(dǎo)引起 軍團(tuán)菌病，流行致死率可高達(dá)30%以上，我國(guó)自1982年在南京首次證實(shí)軍團(tuán)菌病例以來， 全國(guó)已有多起散發(fā)與暴發(fā)流行的報(bào)道。炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌、嗜肺軍團(tuán)菌均可通過空氣 飛沫傳播，可形成氣溶膠，易引發(fā)突發(fā)公共衛(wèi)生事件。快速有效的病原檢測(cè)技術(shù)在炭疽、鼠 疫、軍團(tuán)菌病疫情的預(yù)防、控制及應(yīng)急反應(yīng)決策中起著極其關(guān)鍵的作用，對(duì)保障公眾的生命 財(cái)產(chǎn)安全具有重要意義。目前對(duì)炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌、嗜肺軍團(tuán)菌的檢測(cè)方法，主要基于對(duì)病原體的培 養(yǎng)、毒素檢測(cè)、染色鏡檢、血清學(xué)(抗原或抗體)檢測(cè)等，但這些方法均不適合早期快速偵 檢，難以適應(yīng)疫情控制的需要。雖然近年來也發(fā)展了常規(guī)PCR及DNA探針雜交技術(shù)、膠體金 技術(shù)、基因芯片技術(shù)等，但常規(guī)PCR及DNA探針雜交技術(shù)存在特異性和敏感性的問題；膠體 金技術(shù)敏感性較差，假陽性和假陰性偏高；基因芯片技術(shù)的檢測(cè)成本及硬件要求均較高，并 且重復(fù)性較差(一般一個(gè)樣品需重復(fù)3次才能做出綜合評(píng)價(jià))，難于推廣，目前僅適合學(xué)術(shù) 性科研。此外，這些檢測(cè)方法均屬開放式方法，檢測(cè)烈性傳染病病原體時(shí)均存在嚴(yán)重的生物 安全與傳播隱患，而且對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器和環(huán)境造成交叉污染的危險(xiǎn)性較大，易導(dǎo)致假陽性結(jié)果 等。目前文獻(xiàn)所報(bào)道的這些方法，除基因芯片外均為單重檢測(cè)方法，所需設(shè)備、試劑、反應(yīng)參 數(shù)迥異，難于整合，不能同時(shí)檢測(cè)和預(yù)警上述三種病原體，耗時(shí)較長(zhǎng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種封閉快速檢測(cè)技術(shù)，由光電倍增管(PMT)掃描擴(kuò)增產(chǎn)物， 經(jīng)計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理后得出結(jié)果，反應(yīng)在全封閉的條件下進(jìn)行，擴(kuò)增過程中可避免由于以前 基因擴(kuò)增產(chǎn)物如PCR產(chǎn)物氣溶膠等的污染而可能引起的假陽性結(jié)果，還可避免病原體核酸 片斷對(duì)人體產(chǎn)生的潛在危害，無須開蓋PCR后處理，具有實(shí)時(shí)、直觀、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，尤其在烈 性傳染病病原體的檢測(cè)上，有著明顯的優(yōu)勢(shì)，有示范推廣價(jià)值。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)病毒 或細(xì)菌，其靈敏度比常規(guī)PCR高出10 100倍以上，整個(gè)檢測(cè)時(shí)間縮短至3 4小時(shí)內(nèi)，探 針的應(yīng)用使假陽性達(dá)到了最小化。多重實(shí)時(shí)熒光PCR是在同一反應(yīng)體系中加入多組引物對(duì)和多個(gè)探針，同時(shí)檢測(cè)多 個(gè)目的基因的方法。該方法在具有實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速、敏感的特性同時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)一管 多檢，達(dá)到省時(shí)省力的目的，提高了檢測(cè)速度和效率，尤其適合疫情早期預(yù)警、排除所必須 的同時(shí)篩查檢測(cè)的需要。
目前，還沒有一種能同時(shí)檢測(cè)炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌及嗜肺軍團(tuán)菌的多重實(shí)時(shí) 熒光PCR的引物、探針序列及方法，而這種引物、探針序列及方法對(duì)于應(yīng)對(duì)突發(fā)傳染病疫情 和流行病學(xué)調(diào)查、突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處置的早期檢測(cè)等具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種檢測(cè)炭疽桿 菌、鼠疫耶爾森菌及嗜肺軍團(tuán)菌多重實(shí)時(shí)熒光PCR的引物、探針序列及方法。本發(fā)明解決其技術(shù)問題的技術(shù)方案如下本發(fā)明提供一種檢測(cè)炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌及嗜肺軍團(tuán)菌多重實(shí)時(shí)熒光PCR的 引物、探針序列，其特征是，包括由capa引物對(duì)和capa探針、及pa引物對(duì)和pa探針構(gòu)成的 炭疽桿菌引物探針序列集；所述capa引物對(duì)包括兩組序列(l)capa-F :SEQ ID No 1 和 capa-R :SEQ ID No :2 ；(2) capa-Fc :SEQ ID No :19 禾口 capa-Rc :SEQ ID No :20 ;所述capa探針包括兩個(gè)序列(3) capa-probe :SEQ ID No :3 ；(4) capa-probec :SEQ ID No :21 ;所述pa引物對(duì)包括兩組序列(5)pa-F :SEQ ID No :4 和 pa_R :SEQ ID No :5 ;(6) pa-Fc :SEQ ID No :22 和 pa-Rc :SEQ ID No :23 ;所述pa探針包括兩個(gè)序列(7)pa-probe :SEQ ID No :6 ；(8)pa-probec :SEQ ID No :24。進(jìn)一步地，還包括由pla引物對(duì)和pla探針、及fl引物對(duì)和fl探針構(gòu)成的鼠疫耶 爾森菌引物探針序列集；所述pla引物對(duì)包括兩組序列(9)ρIa-F :SEQ ID No 7 和 ρIa-R :SEQ ID No :8 ；(lO)pla-Fc :SEQ ID No :25 和 pla-Rc :SEQ ID No :26 ；所述pla探針包括兩個(gè)序列(ll)pla-probe :SEQ ID No :9 ；(12)pla-probec :SEQ ID No :27 ；所述fl引物對(duì)包括兩組序列(13) fI-F :SEQ ID No :10 和 fl-R :SEQ ID No :11 ；(14) f I-Fc :SEQ ID No :28 和 fl-Rc :SEQ ID No :29 ；所述f 1探針包括兩個(gè)序列(15)fl-probe :SEQ ID No :12 ；(16)fl-probec :SEQ ID No :30。更進(jìn)一步地，還包括由mip引物對(duì)和mip探針、piIe引物對(duì)和pile探針構(gòu)成的嗜 肺軍團(tuán)菌引物探針序列集；
所述mip引物對(duì)包括兩組序列(17)mip-F :SEQ ID No :13 和 mip-R :SEQ ID No :14 ;(18)mip-Fc :SEQ ID No :31 禾口 mip-Rc :SEQ ID No :32 ；所述mip探針包括兩個(gè)序列(19)mip-probe :SEQ ID No :15 ；(20)mip-probec :SEQ ID No :33 ；所述pile引物對(duì)包括兩組序列(21)pile-F :SEQ ID No :16 和 pile-R :SEQ ID No :17 ;(2 piIe-Fc :SEQ ID No :34 和 piIe-Rc :SEQ ID No :35 ;所述pile探針包括兩個(gè)序列(23)pile-probe :SEQ ID No :18 ；(24)pile-probec :SEQ ID No :36。再進(jìn)一步地，所述capa探針、pla探針、fl探針、及mip探針序列中的第3位堿基、 所述Pa探針序列中的第4位堿基、所述pile探針序列中的第5位堿基均為RNA堿基。本發(fā)明還提供一種用于檢測(cè)炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌及嗜肺軍團(tuán)菌多重實(shí)時(shí)熒光 PCR方法，其特征是，包括如下步驟①選取引物對(duì)和探針從由SEQ ID No =I-SEQ ID No :36組成的引物、探針序列中 選取引物對(duì)和探針，用熒光染料在各探針序列的5'端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)，用非熒光染料在 各探針序列的3'端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)；所述熒光染料包括FAM、J0E、TRAMA、TET、R0X、HEX; 所述非熒光染料包括ECLIPSE、BHQ ；將所述各引物對(duì)分別制成引物對(duì)工作液，并將所述各 探針分別制成探針工作液；②制備目標(biāo)基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品從滅活的炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌及嗜肺軍團(tuán)菌 中提取基因組DNA;按常規(guī)方法，從由SEQ ID No =I-SEQ ID No :36組成的引物、探針序列 中分別選取一組capa引物對(duì)、一組pa引物對(duì)、一組pla引物對(duì)、一組fl引物對(duì)、一組mip 引物對(duì)、及一組pile引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得對(duì)應(yīng)的各目標(biāo)基因擴(kuò)增產(chǎn)物；將各擴(kuò)增產(chǎn) 物分別回收、純化，并分別連接到PGEM-T easy質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒DNA，從而獲得所述各 目標(biāo)基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；測(cè)定所述各目標(biāo)基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度后，根據(jù)需要稀釋分裝， 置-20°C備用；③建立反應(yīng)體系A(chǔ). dNTPs濃度的優(yōu)化；B.鎂離子濃度的優(yōu)化；C.耐熱性RNase H 酶——Tli RNase H II用量的優(yōu)化；D. Taq DNA聚合酶——ExTaq HS用量的優(yōu)化；E.引物 濃度的優(yōu)化；F.探針濃度的優(yōu)化；G.目標(biāo)基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品線性范圍的確定；④選擇熒光檢測(cè)通道根據(jù)標(biāo)記在步驟①所選各探針上的報(bào)告熒光基團(tuán)選擇熒光 檢測(cè)通道。本技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)如下1.所述步驟①中，選取的引物對(duì)和探針由六組引物對(duì)和六個(gè)探針構(gòu)成一組capa引物對(duì)和一個(gè)capa探針、一組pa引物對(duì)和一個(gè)pa探針、一組pla引物 對(duì)和一個(gè)Pla探針、一組fl引物對(duì)和一個(gè)fl探針、一組mip引物對(duì)和一個(gè)mip探針、及一 組pile引物對(duì)和一個(gè)pile探針。2.所述步驟①中，選取的引物對(duì)和探針由三組引物對(duì)和三個(gè)探針構(gòu)成
一組capa引物對(duì)和一個(gè)capa探針、或一組pa引物對(duì)和一個(gè)pa探針；以及，一組pla引物對(duì)和一個(gè)pla探針、或一組fl引物對(duì)和一個(gè)fl探針；以及，一組mip引物對(duì)和一個(gè)mip探針、或一組pile引物對(duì)和一個(gè)pile探針。3.所述步驟①中，選取的引物對(duì)和探針由兩組引物對(duì)和兩個(gè)探針構(gòu)成一組capa引物對(duì)和一個(gè)capa探針、及一組pa引物對(duì)和一個(gè)pa探針；或者，一組pla引物對(duì)和一個(gè)pla探針、及一組fl引物對(duì)和一個(gè)fl探針；或者，一組mip引物對(duì)和一個(gè)mip探針、及一組pile引物對(duì)和一個(gè)pile探針。4.所述步驟③中，所述反應(yīng)體系由以下組分構(gòu)成反應(yīng)體系終濃度為0. 3mmol/L 的各dNTP，反應(yīng)體系終濃度為5mmol/L的鎂離子，反應(yīng)體系終濃度為4U/ μ 1的Tli RNase ΗΙΙ，反應(yīng)體系終濃度為1.25υ/25μ 1的Ex Taq HS，反應(yīng)體系終濃度為0. 4 μ mol/L的各 引物，反應(yīng)體系終濃度為0.2 μ mol/L的各探針，各目標(biāo)基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)為IO1 IO8Copy/每反應(yīng)體系，CycleavePCR Buffer適量，雙蒸水適量；整個(gè)反應(yīng)體系的總體積 為 25 μ 1。5.還包括以下步驟⑤檢測(cè)待測(cè)樣品提取待測(cè)樣品的基因組DNA，得到待測(cè)液； 按步驟③的反應(yīng)體系加入除質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品外的所有組分，并加入4μ 1所述待測(cè)液；進(jìn)行實(shí)時(shí) 熒光定量PCR反應(yīng)程序第一階段初期變性，85_104°C 8-12秒；第二階段PCR反應(yīng)，為85-104 V變性4-6秒，45-65 °C退火8-12秒，然后 55-850C 20-30秒延伸同時(shí)監(jiān)測(cè)熒光曲線；重復(fù)40-60個(gè)循環(huán)；判斷陽性的標(biāo)準(zhǔn)是CT值在35個(gè)循環(huán)內(nèi)，且所述熒光曲線呈S形。炭疽桿菌致病性與其產(chǎn)生的外毒素和多肽莢膜有關(guān)，二者分別由2個(gè)質(zhì)粒(pXOl 及pX02)編碼。pXOl質(zhì)粒含有編碼保護(hù)性抗原的PA基因，PA結(jié)合于細(xì)胞表面受體，是形成 主要致病性的水腫毒素(ET)的關(guān)鍵因子。PX02含莢膜合成相關(guān)基因capA，編碼的莢膜有 抗吞噬作用，capA缺失的菌株不能形成莢膜，易被白細(xì)胞吞噬并殺死，因而沒有致病作用。 炭疽桿菌同時(shí)具有PXOl質(zhì)粒和pX02質(zhì)粒時(shí)才顯示病原性，如果只有其中一種質(zhì)粒，即為 弱毒株或無毒株。鼠疫耶爾森菌的基因組中，Pla基因和cafl基因是相當(dāng)穩(wěn)定和非常特異 的分子生物學(xué)特征，不論是典型的或是非典型的鼠疫菌均具有這兩種特征。pla基因表達(dá) 的含312個(gè)氨基酸的纖維蛋白溶酶原活性因子是一種多功能蛋白，可介導(dǎo)鼠疫菌對(duì)宿主上 皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及胞外基質(zhì)的黏附和侵襲，是一種關(guān)鍵的毒力因子，肺鼠疫引起的侵襲性 肺炎和快速死亡依賴于其活性。cafl基因表達(dá)的Fl莢膜抗原，為一種糖蛋白，有高度免疫 原性和特異性，是最重要的鼠疫保護(hù)性抗原。嗜肺軍團(tuán)菌基因組中PilE基因編碼的IV型 菌毛蛋白，參與細(xì)菌的黏附、活動(dòng)力以及對(duì)特異性靶細(xì)胞的識(shí)別等多種生物功能活動(dòng)，且與 軍團(tuán)菌的毒力緊密相關(guān)，為嗜肺軍團(tuán)菌1 15血清型所共有，具有種屬特異性和高度保守 性；此外，國(guó)外相關(guān)研究表明，某些嗜肺軍團(tuán)菌含有的巨噬細(xì)胞感染增強(qiáng)因子(mip)基因可 調(diào)控M 27kD外膜蛋白的形成，這種蛋白介導(dǎo)氣溶膠進(jìn)入肺泡巨噬細(xì)胞，可以使正常身強(qiáng) 體壯的人患病，這使過去認(rèn)為軍團(tuán)菌為條件致病菌的理論受到了極大沖擊。由此可見，在疫情和突發(fā)公共衛(wèi)生事件(例如疫區(qū)空氣、水源污染，公眾收到裝 有不明粉末的信件，研究機(jī)構(gòu)中病原菌的意外散播等等)中，因預(yù)警、控制及應(yīng)急反應(yīng)決策 的需要，對(duì)于炭疽桿菌，需同時(shí)檢測(cè)PA和capA，以區(qū)分是否存在強(qiáng)毒株或弱毒、無毒株；對(duì)于鼠疫耶爾森菌，因涉及國(guó)家法定甲類傳染病(最高級(jí)別)，應(yīng)盡可能準(zhǔn)確可靠定性，所以 宜同時(shí)檢測(cè)Pla基因和cafl基因，這樣即可雙重復(fù)核又可避免漏診；對(duì)于嗜肺軍團(tuán)菌，因亞 型較多，如能同時(shí)檢測(cè)其特異性結(jié)構(gòu)分子PilE基因和主要毒力因子Mip基因，將提高檢出 率和增強(qiáng)預(yù)警水平。本發(fā)明采用實(shí)時(shí)熒光Cyc IeavePCR方法，其中包括由RNA和DNA構(gòu)成的雜合 Cycling探針、及核糖核酸酶H(RNaSe H)，本方法靈敏度高，能夠高效率地檢出目的基因。 當(dāng)探針與擴(kuò)增產(chǎn)物中的互補(bǔ)序列雜交后，RNase H在RNA部分將探針切斷，淬滅抑制作用解 除，熒光物質(zhì)發(fā)出熒光，通過測(cè)定熒光強(qiáng)度，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物量。如果探針的RNA部 分或與其相鄰的2-3個(gè)堿基部分，與模板間有一個(gè)堿基不互補(bǔ)，RNase H就不能在RNA部分 將探針切斷。與實(shí)時(shí)熒光PCR的常規(guī)標(biāo)記方法如STOR、Taqman探針法相比，本發(fā)明方法的熒光 背景更低，信噪比更高，穩(wěn)定性更好，特異性非常強(qiáng)(可識(shí)別一個(gè)堿基的差異)，非常適合炭 疽桿菌、鼠疫耶爾森菌、及嗜肺軍團(tuán)菌的快速偵檢。本發(fā)明充分利用PCR技術(shù)的高效擴(kuò)增性、核酸雜交的良好特異性和熒光檢測(cè)技術(shù) 的快速敏感性，對(duì)一個(gè)樣品僅需進(jìn)行一個(gè)批次的檢測(cè)操作，就可以完成對(duì)樣品中炭疽桿菌、 鼠疫耶爾森菌、嗜肺軍團(tuán)菌的檢測(cè)，并同時(shí)確定強(qiáng)毒株、弱毒株等信息，具有結(jié)果可靠和準(zhǔn) 確靈敏、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)省力、成本低、效率高等優(yōu)點(diǎn)。


圖1為本發(fā)明多重實(shí)時(shí)熒光PCR方法的檢測(cè)原理圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例1第一反應(yīng)體系的熒光曲線圖。圖3為圖2實(shí)施例第二反應(yīng)體系的熒光曲線圖。圖4為本發(fā)明實(shí)施例2反應(yīng)體系的熒光曲線圖。圖5為本發(fā)明實(shí)施例3反應(yīng)體系的熒光曲線圖。圖6為本發(fā)明實(shí)施例4反應(yīng)體系的熒光曲線圖。
具體實(shí)施例方式1.引物對(duì)、探針序列的設(shè)計(jì)通過分析NCBI (美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中炭疽桿菌的PA和 capA基因序列，鼠疫耶爾森菌的pla和cafl基因序列，嗜肺軍團(tuán)菌的pilE和Mip基因序 列，使用Beacon Designer等多種生物學(xué)軟件，結(jié)合經(jīng)驗(yàn)判斷和人工比對(duì)、修正，進(jìn)行比較分 析，選擇無二級(jí)結(jié)構(gòu)且高度保守的核苷酸區(qū)域設(shè)計(jì)多對(duì)引物和探針，引物長(zhǎng)度一般為20個(gè) 堿基左右。探針的長(zhǎng)度一般為11個(gè)堿基，內(nèi)嵌合一個(gè)RNA堿基，其余為DNA堿基。引物間 和引物內(nèi)無互補(bǔ)序列，而且應(yīng)分別特異性地針對(duì)各靶基因，相互間不存在交叉反應(yīng)，可以在 同一套反應(yīng)體系中同時(shí)應(yīng)用于檢測(cè)和區(qū)分炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌、嗜肺軍團(tuán)菌。具體的引 物對(duì)、探針序列見表1。表1引物對(duì)、探針序列
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌及嗜肺軍團(tuán)菌多重實(shí)時(shí)熒光PCR的引物、探針序 列，其特征是，包括由capa引物對(duì)和capa探針、及pa引物對(duì)和pa探針構(gòu)成的炭疽桿菌引 物探針序列集；所述capa引物對(duì)包括兩組序列 (Dcapa-F :SEQ ID No 1 和 capa-R :SEQ ID No :2 ；(2)capa-Fc:SEQ ID No :19 禾口 capa-Rc :SEQ ID No :20 ； 所述capa探針包括兩個(gè)序列(3)capa-probe:SEQ ID No :3 ；(4)capa-probec:SEQ ID No :21 ; 所述pa引物對(duì)包括兩組序列(5)pa-F:SEQ ID No :4和 pa-R :SEQ ID No :5 ;(6)pa-Fc:SEQ ID No :22和 pa-Rc :SEQ ID No :23 ; 所述pa探針包括兩個(gè)序列(7)pa-probe:SEQ ID No :6 ；(8)pa-probec:SEQ ID No :24。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌及嗜肺軍團(tuán)菌多重實(shí)時(shí)熒光 PCR的引物、探針序列，其特征是，還包括由pla引物對(duì)和pla探針、及fl引物對(duì)和fl探針 構(gòu)成的鼠疫耶爾森菌引物探針序列集；所述Pla引物對(duì)包括兩組序列(9)ρIa-F=SEQID No 7和 pla_R :SEQ ID No :8 ；(10)pla-Fc:SEQ ID No :25 和 pla-Rc :SEQ ID No :26 ； 所述Pla探針包括兩個(gè)序列(11)pla-probe:SEQ ID No :9 ；(12)pla-probec:SEQ ID No :27 ； 所述fl引物對(duì)包括兩組序列(13)fI-F=SEQID No :10 和 fl-R :SEQ ID No :11 ；(14)fI-Fc:SEQ ID No :28 和 fl-Rc :SEQ ID No :29 ； 所述Π探針包括兩個(gè)序列(15)fl-probe:SEQ ID No :12 ；(16)fl-probec:SEQ ID No :30。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌及嗜肺軍團(tuán)菌多重實(shí)時(shí)熒光 PCR的引物、探針序列，其特征是，還包括由mip引物對(duì)和mip探針、pile引物對(duì)和pile探 針構(gòu)成的嗜肺軍團(tuán)菌引物探針序列集；所述mip引物對(duì)包括兩組序列(17)mip-F:SEQ ID No :13和 mip-R :SEQ ID No :14 ;(18)mip-Fc:SEQ ID No :31和 mip-Rc :SEQ ID No :32 ； 所述mip探針包括兩個(gè)序列(19)mip-probe:SEQ ID No :15 ；(20)mip-probec:SEQ ID No :33 ；所述pile引物對(duì)包括兩組序列(21)pile-F:SEQ ID No :16 和 pile-R :SEQ ID No :17 ；(22)pile-Fc:SEQ ID No :34和 pile-Rc :SEQ ID No :35 ；所述Pile探針包括兩個(gè)序列(23)pile-probe:SEQ ID No :18 ；(24)pile-probec:SEQ ID No :36。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌及嗜肺軍團(tuán)菌多重實(shí)時(shí)熒光 PCR的引物、探針序列，其特征是，所述capa探針、pla探針、fl探針、及mip探針序列中的第 3位堿基、所述pa探針序列中的第4位堿基、所述pile探針序列中的第5位堿基均為RNA堿基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌及嗜肺軍團(tuán)菌多重實(shí)時(shí)熒光 PCR的引物、探針序列，用于檢測(cè)炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌及嗜肺軍團(tuán)菌多重實(shí)時(shí)熒光PCR 方法，其特征是，包括如下步驟①選取引物對(duì)和探針從由SEQID No =I-SEQ ID No :36組成的引物、探針序列中選取 引物對(duì)和探針，用熒光染料在各探針序列的5'端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)，用非熒光染料在各探 針序列的3'端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)；所述熒光染料包括FAM、JOE、TRAMA、ΤΕΤ、ROX、HEX ；所 述非熒光染料包括ECLIPSE、BHQ ；將所述各引物對(duì)分別制成引物對(duì)工作液，并將所述各探 針分別制成探針工作液；②制備目標(biāo)基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品從滅活的炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌及嗜肺軍團(tuán)菌中提 取基因組DNA;按常規(guī)方法，從由SEQ ID No =I-SEQ ID No :36組成的引物、探針序列中分別 選取一組capa弓丨物對(duì)、一組pa引物對(duì)、一組ρIa引物對(duì)、一組f 1引物對(duì)、一組mip引物對(duì)、 及一組pile引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得對(duì)應(yīng)的各目標(biāo)基因擴(kuò)增產(chǎn)物；將各擴(kuò)增產(chǎn)物分別回 收、純化，并分別連接到PGEM-T easy質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒DNA，從而獲得所述各目標(biāo)基因 的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；測(cè)定所述各目標(biāo)基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度后，根據(jù)需要稀釋分裝，置-20°C③建立反應(yīng)體系A(chǔ).dNIPs濃度的優(yōu)化；B.鎂離子濃度的優(yōu)化；C.耐熱性RNase H 酶——Tli RNase H II用量的優(yōu)化；D. Taq DNA聚合酶——Ex TaqHS用量的優(yōu)化；E.引物 濃度的優(yōu)化；F.探針濃度的優(yōu)化；G.目標(biāo)基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品線性范圍的確定；④選擇熒光檢測(cè)通道根據(jù)標(biāo)記在步驟①所選各探針上的報(bào)告熒光基團(tuán)選擇熒光檢測(cè) 通道。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌及嗜肺軍團(tuán)菌多重實(shí)時(shí)熒光 PCR方法，其特征是，所述步驟①中，選取的引物對(duì)和探針由六組引物對(duì)和六個(gè)探針構(gòu)成一組capa引物對(duì)和一個(gè)capa探針、一組pa引物對(duì)和一個(gè)pa探針、一組pla引物對(duì) 和一個(gè)pla探針、一組fl引物對(duì)和一個(gè)fl探針、一組mip引物對(duì)和一個(gè)mip探針、及一組 pile引物對(duì)和一個(gè)pile探針。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌及嗜肺軍團(tuán)菌多重實(shí)時(shí)熒光 PCR方法，其特征是，所述步驟①中，選取的引物對(duì)和探針由三組引物對(duì)和三個(gè)探針構(gòu)成一組capa引物對(duì)和一個(gè)capa探針、或一組pa引物對(duì)和一個(gè)pa探針；以及，一組Pla引物對(duì)和一個(gè)pla探針、或一組fl引物對(duì)和一個(gè)fl探針；以及，一組mip引物對(duì)和一個(gè)mip探針、或一組pile引物對(duì)和一個(gè)pile探針。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌及嗜肺軍團(tuán)菌多重實(shí)時(shí)熒光 PCR方法，其特征是，所述步驟①中，選取的引物對(duì)和探針由兩組引物對(duì)和兩個(gè)探針構(gòu)成一組capa引物對(duì)和一個(gè)capa探針、及一組pa引物對(duì)和一個(gè)pa探針；或者，一組Pla引物對(duì)和一個(gè)pla探針、及一組fl引物對(duì)和一個(gè)fl探針；或者，一組mip引物對(duì)和一個(gè)mip探針、及一組pile引物對(duì)和一個(gè)pile探針。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌及嗜肺軍團(tuán)菌多重實(shí)時(shí)熒 光PCR方法，其特征是，所述步驟③中，所述反應(yīng)體系由以下組分構(gòu)成反應(yīng)體系終濃度 為0. 3mmol/L的各dNTP，反應(yīng)體系終濃度為5mmol/L的鎂離子，反應(yīng)體系終濃度為4U/ μ 1的Tli RNase ΗΙΙ，反應(yīng)體系終濃度為1. 25U/25 μ 1的Ex Taq HS，反應(yīng)體系終濃度為 0.4umol/L的各引物，反應(yīng)體系終濃度為0. 2ymol/L的各探針，各目標(biāo)基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷 貝數(shù)為IO1 IO8copy/每反應(yīng)體系，CycleavePCR Buffer適量，雙蒸水適量；整個(gè)反應(yīng)體 系的總體積為25 μ 1。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測(cè)炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌及嗜肺軍團(tuán)菌多重實(shí)時(shí)熒光 PCR方法，其特征是，還包括以下步驟⑤檢測(cè)待測(cè)樣品提取待測(cè)樣品的基因組DNA，得到 待測(cè)液；按步驟③的反應(yīng)體系加入除質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品外的所有組分，并加入4 μ 1所述待測(cè)液； 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序第一階段初期變性，85-104°C 8-12秒；第二階段PCR反應(yīng)，為85-104°C變性4-6秒，45-65°C退火8-12秒，然后55-85°C20-30 秒延伸同時(shí)監(jiān)測(cè)熒光曲線；重復(fù)40-60個(gè)循環(huán)；判斷陽性的標(biāo)準(zhǔn)是CT值在35個(gè)循環(huán)內(nèi)，且所述熒光曲線呈S形。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌及嗜肺軍團(tuán)菌多重實(shí)時(shí)熒光PCR的引物、探針序列及方法，該引物、探針序列包括炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌及嗜肺軍團(tuán)菌引物探針序列集；該方法的步驟包括選取引物對(duì)和探針、制備目標(biāo)基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品、建立反應(yīng)體系和選擇熒光檢測(cè)通道。本發(fā)明涉及的各引物對(duì)和探針特異性和工作性能良好，可建立檢測(cè)炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌及嗜肺軍團(tuán)菌的多重實(shí)時(shí)熒光PCR方法，具有結(jié)果可靠和準(zhǔn)確靈敏、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)省力、成本低、效率高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102134594SQ20101060303
公開日2011年7月27日 申請(qǐng)日期2010年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月23日
發(fā)明者張錦海, 王忠燦, 王長(zhǎng)軍, 鄧小昭 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所