嗜肺軍團(tuán)菌檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明為一種嗜肺軍團(tuán)菌的快速檢測試劑盒，它采用一對軍團(tuán)菌特異引物擴(kuò)增16S?rRNA基因上的區(qū)域，在該擴(kuò)增片段內(nèi)針對嗜肺軍團(tuán)菌特異序列設(shè)計一對雜交探針，錨定探針3’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)；猝滅探針5'端標(biāo)記BHQ1，3’端磷酸化；通過實時熒光PCR熔解曲線分析來檢測樣本中的嗜肺軍團(tuán)菌。該檢測試劑盒主要包括DNA提取液、熒光PCR反應(yīng)液、陰性對照及陽性對照。其檢測方法包括DNA提取、熒光PCR反應(yīng)檢測、熔解曲線分析3步。該檢測試劑盒操作簡便快速，結(jié)果直觀，且靈敏度高，特異性好，穩(wěn)定性好，可以廣泛應(yīng)用于臨床及環(huán)境水樣本中嗜肺軍團(tuán)菌的快速鑒定。
【專利說明】嗜肺軍團(tuán)菌檢測試劑盒【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體是一種實時熒光PCR熔解曲線檢測嗜肺軍團(tuán)菌的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]軍團(tuán)菌是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，是引起人類軍團(tuán)菌病的重要病原體。近年來，軍團(tuán)菌病在世界各地時有爆發(fā)流行，我國已將其列入14種新發(fā)傳染病之一。據(jù)國外報道，院內(nèi)不明原因肺炎感染有10%是由軍團(tuán)菌引起。目前已知軍團(tuán)菌雖有52個種，70多個血清型。但臨床上80%以上軍團(tuán)菌感染是由嗜肺軍團(tuán)菌引起。因此，嗜肺軍團(tuán)菌的鑒定對于軍團(tuán)菌病診斷具有重大價值。
[0003]目前軍團(tuán)菌的檢測鑒定方法主要有分離培養(yǎng)、血清抗體檢測、尿抗原檢測、分子檢測技術(shù)等。但以上的檢測方法均存在不足，如直接分離培養(yǎng)，所需時間長達(dá)3~10天，且陽性率低；尿抗原檢測僅對嗜肺軍團(tuán)菌I型具有特異性；分子技術(shù)也存在各自的缺點，如傳統(tǒng)的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測操作繁瑣、耗時長、易污染；基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理的雜交探針標(biāo)記技術(shù)價格昂貴、操作復(fù)雜；DNA測序是最為準(zhǔn)確的軍團(tuán)菌種鑒定方法，但耗時較長，分析困難，不能適應(yīng)臨床上的快速要求，其他分子檢測方法均存在各種不足?；谶@些檢測方法建立的試劑盒，均也存在以上的各種不足。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，實時熒光定量PCR具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異等優(yōu)點，自發(fā)明以來在微生物檢測研究中得到廣泛應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]該檢測嗜肺軍團(tuán)菌的試劑盒具有簡便、快速、敏感性和特異性高，且成本低廉、可直接用于臨床標(biāo)本及環(huán)境水樣本檢測。
[0005]本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的:一種嗜肺軍團(tuán)菌核測試劑盒，基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，選取一種猝滅熒光基團(tuán)，采用由上游引物、下游引物組成的一對引物及由錨定探針、猝滅探針組成的一對標(biāo)記探針，建立新型的實時熒光PCR熔解曲線法對嗜肺軍團(tuán)菌進(jìn)行檢測；
[0006]所述上游引物為5’ -AGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3，，
`[0007]所述下游引物為5’ -CCAACAGCTAGTTGACATCG-3’，
[0008]所述錨定探針為5’ -CCCATACTCGAGTCAACC (FAM) -3，，
[0009]所述猝滅探針為5’ - (BHQl) TATTATCTGACCGTCCCAG (ph) -3，。
[0010]嗜肺軍團(tuán)菌檢測試劑盒，是基于實時熒光PCR方法建立的試劑盒，其組分為DNA提取液、熒光PCR緩沖液、陰性對照及陽性對照，其中，DNA提取液的成分包括5%CheleX-100溶液、IOmM三羥甲基氨甲烷鹽酸鹽、0.1mM乙二胺四乙酸二鈉、0.1%疊氮鈉、200 μ g/ml蛋白酶K，熒光PCR緩沖液包括上游引物0.1~0.3 μ Μ、下游引物I~3 μ Μ、錨定探針0.3~
0.5 μ Μ、猝滅探針0.1~0.3 μ Μ、三羥甲基氨甲烷鹽酸20mM、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸
0.3~0.6mM、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷0.3~0.6mM、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸0.3~0.6mM、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸0.3~禮、氯化鎂3~6mM、熱啟動酶I~5U，陰性對照0.5ml,為IXlO4個菌/ml的大腸桿菌培養(yǎng)物，陽性對照0.5ml，為I X IO4個菌/ml的嗜肺軍團(tuán)菌培養(yǎng)物。(此處中的mM為毫摩爾每升；μ M為微摩爾每升，下同)
[0011]嗜肺軍團(tuán)菌檢測試劑盒，檢測結(jié)果判定時，熔解曲線分析程序為95°C Imin和40 0C 2min，以1°C /5s的速度，從40°C升溫至85°C ;嗜肺軍團(tuán)菌的Tm值均為57°C，其它非嗜肺軍團(tuán)菌及非軍團(tuán)菌均無57°C的Tm值。
[0012]本發(fā)明提供一種檢測嗜肺軍團(tuán)菌的試劑盒，其特征在于所描述的時熒光PCR熔解曲線法根據(jù)嗜肺軍團(tuán)菌16srRNA基因保守序列設(shè)計引物和探針，選取一種猝滅熒光基團(tuán)代替原有的雜交探針熒光標(biāo)記物，建立新型的嗜肺軍團(tuán)菌檢測試劑盒。該檢測嗜肺軍團(tuán)菌的試劑盒具有簡便、快速、敏感性和特異性高，且成本低廉、可直接用于臨床標(biāo)本及環(huán)境水樣本檢測。
[0013]本發(fā)明描述的嗜肺軍團(tuán)菌新檢測試劑盒，其主要特點如下:[0014](I)高特異性:本發(fā)明通過對16株嗜肺軍團(tuán)菌(包括15個血清型)、35株非嗜肺軍團(tuán)菌及12株其它非軍團(tuán)菌進(jìn)行基因分型檢測，該試劑盒能準(zhǔn)確的鑒定出嗜肺軍團(tuán)菌，說明該檢測試劑盒特異性很高；
[0015](2)高敏感性和穩(wěn)定性:本發(fā)明建立的熔解曲線分析法檢測嗜肺軍團(tuán)菌試劑盒，其最低檢測限度達(dá)到IOOfg/μ 1，且結(jié)果穩(wěn)定可靠；
[0016](3)檢測試劑盒操作簡便快速；
[0017](4)檢測范圍廣:作為一種嗜肺軍團(tuán)菌快速檢測試劑盒，本發(fā)明可以廣泛應(yīng)用于臨床及環(huán)境水樣本中嗜肺軍團(tuán)菌的快速鑒定。
【具體實施方式】
[0018]本發(fā)明的實時熒光PCR熔解曲線法快速檢測嗜肺軍團(tuán)菌試劑盒是一個整體。下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0019]1.本發(fā)明所需主要試劑的準(zhǔn)備
[0020](I)引物探針合成
[0021]通過對嗜肺軍團(tuán)菌、非嗜肺軍團(tuán)菌及其它非軍團(tuán)菌的16srRNA序列比對分析，尋找嗜肺軍團(tuán)菌高度保守且具有很好同源性的的序列，根據(jù)雜交探針熒光PCR設(shè)計的原則，設(shè)計一對嗜肺軍團(tuán)菌特異探針，錨定探針3’端標(biāo)記FAM，猝滅探針5’端標(biāo)記猝滅基團(tuán)BHQl，3’端磷酸化。比此序列長一些或短一些，但包含了該序列的核心部分即能鑒別嗜肺軍團(tuán)菌的特異堿基序列，另外，熒光基團(tuán)也并不限于此，可以是有相同作用的替代熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)。
[0022]委托商業(yè)序列合成公司合成一下引物和探針序列:
[0023]
【權(quán)利要求】
1.一種嗜肺軍團(tuán)菌核測試劑盒，其特征在于:基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，選取一種猝滅熒光基團(tuán)，采用由上游引物、下游引物組成的一對引物及由錨定探針、猝滅探針組成的一對標(biāo)記探針，建立新型的實時熒光PCR熔解曲線法對嗜肺軍團(tuán)菌進(jìn)行檢測；
2.如權(quán)利要求1所述的嗜肺軍團(tuán)菌檢測試劑盒，其特征在是基于實時熒光PCR方法建立的試劑盒，其組分為DNA提取液、熒光PCR緩沖液、陰性對照及陽性對照，其中，DNA提取液的成分包括5%Chelex-100溶液、IOmM三羥甲基氨甲烷鹽酸鹽、0.1mM乙二胺四乙酸二鈉、0.1%疊氮鈉、200μ g/ml蛋白酶K，熒光PCR緩沖液包括上游引物0.1~0.3 μ M、下游引物I~3 μ M、錨定探針0.3~0.5 μ Μ、猝滅探針0.1~0.3 μ Μ、三羥甲基氨甲烷鹽酸20mM、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸0.3~0.6mM、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷0.3~0.6mM、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸0.3~0.6mM、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸0.3~禮、氯化鎂3~6mM、熱啟動酶I~5U，陰性對照0.5ml,為IX IO4個菌/ml的大腸桿菌培養(yǎng)物，陽性對照0.5ml，為I X IO4個菌/ml的嗜肺軍團(tuán)菌培養(yǎng)物。
3.如權(quán)利要求1所述的嗜肺 軍團(tuán)菌檢測試劑盒，其特征在于檢測結(jié)果判定時，熔解曲線分析程序為95°C Imin和40 °C 2min,以1°C /5s的速度，從40°C升溫至85°C ;嗜肺軍團(tuán)菌的Tm值均為57°C，其它非嗜肺軍團(tuán)菌及非軍團(tuán)菌均無57°C的Tm值。
【文檔編號】C12R1/01GK103509853SQ201210346619
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月18日
【發(fā)明者】趙利偉, 胡朝暉, 朱慶義, 戈立秀 申請人:南京金域醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司