一種軍團菌毒力基因分型檢測試劑盒及其使用方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種軍團菌毒力基因分型檢測試劑盒，具體為一種不僅能檢測臨床和 環(huán)境水標本中軍團菌，而且可以對軍團菌中的10個毒力基因進一步作出基因分型的快速 檢測試劑盒；本發(fā)明還涉及其使用方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，軍團菌檢測試劑盒主要分為兩大類：一是利用抗原抗體反應(yīng)檢測軍團菌特 異性抗體或抗原，此類試劑盒包括軍團菌ELISA法試劑盒以及嗜肺軍團菌尿抗原檢測試劑 盒。因為軍團菌相關(guān)抗原或抗體在軍團菌感染病人體內(nèi)出現(xiàn)較晚，一般需要一周及以上的 時間才能檢測到，而且只能檢測嗜肺軍團菌，并有一定的交叉反應(yīng)，所以該類型的試劑盒具 有一定的局限性；第二類是利用分子生物學方法檢測軍團菌，如熒光定量PCR和PCR酶切 分型檢測軍團菌或嗜肺軍團菌種試劑盒，該試劑盒可用以檢測嗜肺軍團菌和非嗜肺軍團菌 種，但不能對軍團菌毒力基因進行分型檢測。雖然臨床上80%以上的軍團菌感染是由嗜肺 軍團菌引起的，水環(huán)境也廣泛存在嗜肺軍團菌，但是非嗜肺軍團菌也具有較為廣泛的存在 性和一定的感染力，目前已知至少有24種軍團菌與人類疾病相關(guān)。因此，一種既能檢測軍 團菌種又能對軍團菌毒力基因進行分型檢測的試劑盒是很必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對現(xiàn)有技術(shù)中軍團菌檢測試劑盒存在的不足，本發(fā)明提供了一種軍團菌毒力基 因分型檢測試劑盒，該試劑盒不僅能夠檢測臨床和環(huán)境水標本中的軍團菌，而且能夠快速 的對軍團菌中存在的毒力基因進一步分型檢測；本發(fā)明還提供該試劑盒的使用方法和應(yīng) 用。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 本發(fā)明提供一種軍團菌毒力基因分型檢測試劑盒，所述試劑盒包括細菌基因組DNA提 取液、PCR反應(yīng)混合液和PCR上下游引物混合液；其中，所述PCR上下游引物混合液為10對 引物，具體為： (1) iraA-F :5' -CCTGTAGCGCAACAACAACT-3' ； iraA-R:5' -CCAGGTGCCCTCTATTCCAA-3' ； (2) iraB-F :5' -CGCATCCAGTATGGTTTCTC-3' ； iraB-R:5' -AACGTTTCGCAAAATTCAAG-3' ； (3) IvrA-F :5' -CAAAGAACAACGCACAAGCA-3' ； IvrA-R :5' -GCAAGCCAATTTGCTGGGT-3' ； (4) IvrB-F :5' -TAAAACGATGGAGCCAATC-3' ； IvrB-R :5' -ACCTGCAATGATGATGCAAG-3' ； (5) IvhD-F :5' -CAAAATTCAACGCCTGACCG-3' ； IvhD-R :5' -AGGCCAGCCAATCATCAAATC-3' ； (6) cpxR-F :5' -AAAATCCCAACTCCCAAAC-3' ； cpxR-R:5' -CGATACTGCGGTCATAAGC-3' ； (7) cpxA-F :5' -ACAACCAGCTCGAGAGGA-3' ； cpxA-R:5' -GCCATCACTTGGGAGTTC-3' ； (8) dotA-F :5' -TTGGTGCAGCCGATAAAAT-3' ； dotA-R:5' -ACCCCACAAGGTGGACTCTT-3' ； (9) icmC-F :5' -ATGGAGAAGCCAGGACAA-3' ； icmC-R:5' -ACCCGGATAATCATCACCA-3' ； (10) icmD-F :5' -GGCTAGTAAGCGCAGCTTG-3' ； icmD-R :5' -CCCAATCCAGCCAAGTAAG-3'。
[0005] 本發(fā)明根據(jù)嗜肺軍團菌特有的65 kb毒力基因及其他有關(guān)毒力基因，設(shè)計了 10對 檢測毒力基因的特異性引物，制作成10種不同的PCR引物混合液，還設(shè)計了細菌基因組DNA 的提取和PCR反應(yīng)體系混合液，用于檢測軍團菌毒力基因。
[0006] 優(yōu)選地，所述細菌基因組DNA提取液的典型的配方為：Chelex 100 resin 5%; Tris-HCl 10 mM，pH8.3;乙二胺四乙酸二鈉 0.1 mM;疊氮鈉 0.1 %;蛋白酶 K 200 μg/ml。
[0007] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括陽性對照液，所述陽性對照液包含軍團菌基因組 DNA 和特異引物，所述特異引物為：Leg386F: 5' -ACGGTTGATAGGTTAAGAGC-3' ；Leg386R: 5' -CCAACAGCTAGTTGACATCG-3'。所述軍團菌基因組DNA提取自嗜肺軍團菌標準菌株 ATCC33152,序列在NCBI基因庫編號為NC_002942. 5 ;引物擴增序列為軍團菌屬16S riWJ基 因一段保守序列，具體序列如下： AGGGTTGATAGGTTAAGAGCTGATTAACTGGACGTTACCCACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAG CAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGTGGTTGATTAAG TTATCTGTGAAATTCCTGGGCTTAACCTGGGACGGTCAGATAATACTGGTTGACTCGAGTATGGGAGAGGGTAGTGG AATTTCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGCCTAATACT GACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCAACTA GCTGTTGG。
[0008] 本發(fā)明的第二個目的是提供上述試劑盒的使用方法，應(yīng)用細菌基因組DNA提取液 提取待測樣品中的細菌基因組DNA ;以細菌基因組DNA為模板，用對應(yīng)的PCR上下游引物混 合液進行PCR擴增，同時對陽性對照和陰性對照進行PCR擴增，將所得的PCR產(chǎn)物進行瓊脂 糖凝膠電泳，若出現(xiàn)條帶，則說明標本中含有與PCR上下游引物混合液對應(yīng)的軍團菌毒力 基因；反之，則說明標本中不含與PCR上下游引物混合液對應(yīng)的軍團菌毒力基因。
[0009] 優(yōu)選地，所述 PCR 擴增條件為：94 °C 3 min, 94 °C 30 s, 57 °C 30s, 72 °C 20 s，35個循環(huán)，72 °C 5 min, 4°C貯存。本發(fā)明所設(shè)計的11對引物(包括陽性對照液使用的 特異引物）均能夠在此條件下完成擴增。
[0010] 本發(fā)明的第三個目的是提供上述的試劑盒在檢測和分型軍團菌毒力基因中的應(yīng) 用。
[0011] 優(yōu)選地，所述軍團菌毒力基因為：ira兒 irai?，//-以，/κτΖ?，/fAA c/λ??， ic/nCy icmDo
[0012] 本發(fā)明的第四個目的是提供PCR擴增引物在檢測軍團菌毒力基因中的應(yīng)用，所述 PCR擴增引物為： (1) iraA-F :5' -CCTGTAGCGCAACAACAACT-3' ； iraA-R:5' -CCAGGTGCCCTCTATTCCAA-3' ； (2) iraB-F :5' -CGCATCCAGTATGGTTTCTC-3' ； iraB-R:5' -AACGTTTCGCAAAATTCAAG-3' ； (3) IvrA-F :5' -CAAAGAACAACGCACAAGCT-3' ； IvrA-R :5' -GCAAGCCAATTTGCTGGGT-3' ； (4) IvrB-F :5' -TAAAACGATGGAGCCAATC-3' ； IvrB-R :5' -ACCTGCAATGATGATGCAAG-3' (5) IvhD-F :5' -CAAAATTCAACGCCTGACCG-3' ； IvhD-R :5' -AGGCCAGCCAATCATCAAATC-3' ； (6) cpxR-F :5' -AAAATCCCAACTCCCAAAC-3' ； cpxR-R:5' -CGATACTGCGGTCATAAGC-3' ； (7) cpxA-F :5' -ACAACCAGCTCGAGAGGA-3' ； cpxA-R:5' -GCCATCACTTGGGAGTTC-3' ； (8) dotA-F :5' -TTGGTGCAGCCGATAAAAT-3' ； dotA-R:5' -ACCCCACAAGGTGGACTCTT-3' ； (9) icmC-F :5' -ATGGAGAAGCCAGGACAA-3' ； icmC-R:5' -ACCCGGATAATCATCACCA-3' ； (10) icmD-F :5' -GGCTAGTAAGCGCAGCTTG-3' ； icmD-R :5' -CCCAATCCAGCCAAGTAAG-3'。
[0013] 本發(fā)明的第五個目的是提供一種軍團菌專用的痰消化液，所述痰消化液由以下組 分組成：每100g水中含有二硫蘇糖醇2.0 g，乙二胺四乙酸0.894 g，氯化鉀0.4 g，磷酸氫 二鉀3.6 g，磷酸二氫鉀0.4 g。
[0014] 本發(fā)明的試劑盒不僅可用于臨床標本如痰液、支氣管灌洗液中軍團菌的毒力基因 檢測，也可用于環(huán)境水標本(如江河湖泊水、空調(diào)冷凝水）中軍團菌毒力基因檢測，具有快 速，簡便，易于使用的優(yōu)點。同時本試劑盒還可以對軍團菌中10個毒力基因進行分型，即通 過本試劑盒的檢測，可以獲知臨床標本與水環(huán)境標本中軍團菌的毒力基因分布形式。最低 檢測限度達1-10個軍團菌DNA，特異性在95%以上。
[0015] 本試劑盒整個檢測過程只需要4 h，較傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法（3-10天）節(jié)省了大量時 間。同時，減少了核酸產(chǎn)物純化步驟，使試驗方法更為簡便。
【附圖說明】
[0016] 附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中： 圖1為軍團菌10個毒力基因凝膠電泳圖；其中，M為分子量標準；從下到上分別為：100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp。1-10 分別為各個毒力基因（ira兒 ira漢 /κτΖ?，c/λ??，PC 為陽性對照，NC 為陰性對照。
【具體實施方式】
[0017] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為市 售。
[0018] 實施例1 一、本發(fā)明的軍團菌毒力基因分型快速檢測試劑盒 本發(fā)明的試劑盒包括細菌基因組DNA提取液，PCR反應(yīng)體系混合液和毒力基因引物混 合液以及其他一些必要試劑，以上液體分別