一種羧酸酯酶D-1CarE3細胞表面展示系統(tǒng)及全細胞催化劑其制備方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種羧酸酯酶D-1CarE3細胞表面展示系統(tǒng)及全細胞催化劑其制備方法及應用，該表面展示體系構建方法為：利用來源丁香假單胞菌的人工合成截短冰核蛋白的NC端為錨定蛋白與靶蛋白羧酸酯酶D-1CarE3融合構建了原核表達載體pET28NCD3，并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，構建了羧酸酯酶D-1CarE3的大腸桿菌細胞表面展示工程菌BL21/pET28NCD3。在T7強啟動子作用下，經(jīng)IPTG誘導表達，成功實現(xiàn)了羧酸酯酶D-1CarE3細胞表面活性的展示，并使用超低溫冷凍干燥法制備全細胞催化劑D-1CarE3。全細胞催化劑D-1CarE3可應用于環(huán)境農(nóng)殘污染的處理。
【專利說明】一種羧酸酯酶D-1CarE3細胞表面展示系統(tǒng)及全細胞催化劑其制備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程技術和分析【技術領域】，涉及一種羧酸酯酶D-lCarE3細胞表面展示系統(tǒng)及全細胞催化劑其制備方法及應用。
【背景技術】
[0002]羧酸酯酶(Carboxylesterases, EC3.1.1.1)是一類能夠催化水解羧酸酯生成羧酸和醇的非特異性酯酶，廣泛存在于動物、植物、微生物體參與生命代謝活動，其與脂肪酶同屬于α/β水解酶家族成員，具有Ser-Asp-His三聯(lián)體結(jié)構催化活性中心。微生物來源的羧酸酯酶是一種重要的工業(yè)酶類，在催化酯水解、酯合成、酯交換上等具有重要應用價值，具有良好的區(qū)域選擇性和立體選擇性。這些獨特性質(zhì)使羧酸酯酶在食品、化工、制藥、能源開發(fā)和環(huán)境保護等領域具有廣闊的應用前景。
[0003]當今農(nóng)藥在控制農(nóng)作物病蟲害促進農(nóng)作物增產(chǎn)的同時也帶來了嚴重的環(huán)境污染問題。羧酸酯酶是一種重要的農(nóng)藥降解酶，對含有羧酸酯鍵的農(nóng)藥有水解作用，可以用于部分有機磷類農(nóng)藥、氨基甲酸酯類農(nóng)藥以及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的降解。微生物降解農(nóng)藥殘留多數(shù)是依靠胞內(nèi)酶的酶解作用，但由于野生菌株產(chǎn)酶能力有限、生長周期長、收集復雜、產(chǎn)量小，生產(chǎn)成本高，限制了其推廣應用。利用細胞表面展示技術可以將靶蛋白羧酸酯酶轉(zhuǎn)運和定位到細胞表面，無需分離純化，是一種開發(fā)高效、可再生全細胞催化劑的新思路，適合工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)應用。
[0004]冰核蛋白的N端具有表面定位功能，而C端具有細胞表面引導和定位功能,利用NC端則有利于提高其對外源蛋白的高效展示作用。本文利用來源丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)的人工合成截短的冰核蛋白(Genbank登錄號AF013159)的NC端為錨定蛋白與來源脂環(huán)酸芽抱桿菌 D_1 (Alicyclobacillus tengchongensis strainCGMCC1504)祀蛋白羧酸酯酶D-lCarE3 (Genbank登錄號JQ034612)融合構建了原核表達質(zhì)粒pET28NCD3，并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，構建了羧酸酯酶D-lCarE3的大腸桿菌細胞表面展示工程菌BL21 (DE3)/pET28NCD3。利用低溫冷凍干燥法制備了全細胞催化劑D_lCarE3，并將其應用于氟氯氰菊酯的降解實驗中，結(jié)果表明該全細胞催化劑對擬除蟲菊酯農(nóng)藥氟氯氰菊酯有降解作用，此外發(fā)明專利“一種羧酸酯酶及其在農(nóng)藥馬拉硫磷和西維因的降解中的應用”(申請?zhí)?201210401222.4)還公開了該羧酸酯酶D-lCarE3具有降解有機磷類農(nóng)藥中的馬拉硫磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥中的西維因，這些表明細胞表面展示羧酸酯酶D-lCarE3的全細胞催化劑可應用于環(huán)境多種農(nóng)殘污染的處理。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服現(xiàn)有 技術中存在的缺陷，本發(fā)明提供一種環(huán)境友好、操作方便的羧酸酯酶D-lCarE3細胞表面展示系統(tǒng)及全細胞催化劑其制備方法及應用。其技術方案如下:
[0006]—種羧酸酯酶D_lCarE3細胞表面展不系統(tǒng),該細胞表面展不系統(tǒng)中利用了人工合成截短的冰核蛋白inaK的NC端作為錨定蛋白并與革巴蛋白羧酸酯酶D-lCarE3融合構建了重組質(zhì)粒PET28NCD3。
[0007]一種羧酸酯酶D_lCarE3細胞表面展示工程菌，利用本發(fā)明所述中的重組質(zhì)粒PET28NCD3轉(zhuǎn)化到表達宿主BL21 (DE3)構建了細胞表面展示工程菌BL21 (DE3)/pET28NCD3。
[0008]一種包含本發(fā)明所述工程菌BL21 (DE3) /pET28NCD3全細胞催化劑D_lCarE3的制備方法，其特征在于，取本發(fā)明所述工程菌株以0.1%的體積比接種量接種于含50μ g/mL卡那抗性的LB培養(yǎng)液中，37°C快速振蕩12h，然后將此活化的菌液再以1%體積比接種量接種到新鮮的LB誘導培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)4h，待菌體密度0D600=0.5左右，加入終濃度
0.05mMIPTG20°C誘導培養(yǎng)20h，12000rpm離心5min，收集菌體，置于超低溫冷凍真空干燥機上凍成細胞干粉即為全細胞催化劑D-lCarE3。
[0009]全細胞催化劑D_lCarE3在環(huán)境農(nóng)殘污染處理中的應用。稱取Img權利要求3所述全細胞催化劑D-lCarE3加入100 μ 1100mg/ml的氟氯氰菊酯丙酮溶液中室溫震蕩反應60min,加入等體積的正己烷抽提，離心取上層液適量于硅膠G板上進行簿層層析分析催化產(chǎn)物，結(jié)果顯示全細胞催化劑D-lCarE3能夠降解擬除蟲菊酯農(nóng)藥氟氯氰菊酯，可應用于環(huán)境農(nóng)殘污染的處理。[0010]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明利用inaK-NC錨定蛋白成功將具有幾種農(nóng)藥降解功能的羧酸酯酶D-lCarE3定位到細胞表面并具有生物催化活性，解決了細胞內(nèi)提取其羧酸酯酶D-lCarE3難的問題，其全細胞催化劑D_lCarE3催化活性達到540U/g細胞干重，是張紅星等人只利用inaK-N端錨定有機磷水解酶所獲得的活性表達870倍以上。本發(fā)明所制備的全細胞催化劑D-lCarE3具有活細胞固定化酶的作用，將全細胞催化劑D_lCarE3放入甲醇溶液中耐受Ih回收細胞測定其催化活性無損失，將全細胞催化劑D-lCarE3常溫放置42d，全細胞催化劑D-lCarE3催化活性損失不到3%，全細胞催化劑D_lCarE3克服了原始酶的不穩(wěn)定性，不易回收利用的問題。本發(fā)明所制備的全細胞催化劑D-lCarE3可以直接噴灑到農(nóng)殘污染區(qū)，其制備方法和使用都很簡單，具有廣泛的應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1是PET28NCD3質(zhì)粒構建圖譜；
[0012]圖2是BL21(DE3)/pET28NCD3細胞組分的Western blot分析圖:1，為細胞質(zhì)成分；2，為細胞內(nèi)膜；3，為細胞外膜；4，為空質(zhì)粒對照；5，為蛋白質(zhì)Marker ；
[0013]圖3是全細胞催化劑D_lCarE3催化氟氯氰菊酯降解產(chǎn)物的簿層層析圖，I, 2，3，為實驗組；CK為對照組；產(chǎn)物I和產(chǎn)物2為氟氯氰菊酯水解的兩種產(chǎn)物；
[0014]圖4是全細胞催化劑D_lCarE3穩(wěn)定性。
【具體實施方式】
[0015]下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明的技術方案作進一步詳細地說明。
[0016]實驗材料和試劑
[0017]1、菌株、載體或基因:脂環(huán)酸芽抱桿菌 D_1 (Alicyclobacillus tengchongensisstrain CGMCC1504)為實驗室保藏菌株。大腸桿菌Escherichia coliBL21 (DE3)和表達載體pET_28a (+)購于Novagen公司，大腸桿菌Escherichia coli TransTl購自全式金公司，ianK-NC為來源丁香假單胞菌Pseudomonas syringae的人工合成冰核蛋白(inaK)且去除中間重復序列只剩冰核蛋白的N端和C端核苷酸序列，二者連接處人為設計了“GTCGAC”Sal I酶切位點，以備用于切除C端序列。人工合成的ianK-NC由載體pGH攜帶，為上海捷瑞公司完成。
[0018]2、酶類及其它生化試劑:CIAP、限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶和dNTP均購自TaKaRa公司；T4連接酶購自Promega公司；p_nitrophenyl butyrate (簡稱pNPB)和氟氯氰菊酯購自Sigma公司；其它試劑均購自國藥集團。
[0019]3、培養(yǎng)基:
[0020]LB培養(yǎng)基:蛋白胨1%，酵母粉0.5%，氯化鈉1%，ρΗ自然(約為7.0)。固體培養(yǎng)基在此基礎上加2.0% (w/v)瓊脂。
[0021]說明:以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進行。
[0022]實施例1:pET28NCD3質(zhì)粒的構建
[0023]提取脂環(huán)酸芽孢桿菌D-1基因組DNA:CTAB裂解法，具體步驟為:將液體培養(yǎng)12h的新鮮菌液離心取菌體，加入800 μ L溶液I (20mMTris，pH8.0, 2mMNa2-EDTA,終濃度20mg/mL溶菌酶)，37°C保溫30min，加100 μ L10%SDS上下顛倒混勻，再加10 μ L10mg/mL的蛋白酶K，37°C保溫30min，加150μ L5MNaCl和150 μ L10%CTAB溶液上下顛倒混勻，65°C保溫20min,加 入等體積的酹/氯仿/異丙醇(體積比25:24:1)進行抽提,在4°C下12000rpm離心10min，取上清于氯仿/異丙醇(體積比24:1)中再次抽提除去雜蛋白，4°C下12000rpm離心10min，再取上清并加入2倍體積無水乙醇和1/10體積的pH5.23MNaAc，_70°C沉淀lh，4?下13500rpm離心20min,棄上清，再用70%的乙醇洗漆兩次,真空干燥,加入適量TE溶解，置于-20°C備用。
[0024]根據(jù)脂環(huán)酸芽孢桿菌D-1全基因組測序及基因注釋分析羧酸酯酶基因D_lCarE3并設計引物CarF和CarR:
[0025]上游引物CarF: 5，CGCGGATCCATGAACGTTAACTTGAACCGCGTG3 ’(劃線部分為 BamH I酶切位點)
[0026]下游引物CarR: 5’ CCGCTCGAGGCCCCGAAGGCCCGGCCACT3’ (劃線部分為 Xho I 酶切位點)
[0027]上游引物T7:5 ’ TAATACGACTCACTATAGGG3 ’
[0028]下游引物T7ter:5’ TGCTAGTTATTGCTCAGCGG3’為PCR檢測陽性克隆子引物。
[0029]以脂環(huán)酸芽孢桿菌D-1基因組DNA為模板進行PCR擴增獲得目的基因D_lCarE3。PCR反應參數(shù)為:94°C預變性5min ;然后94°C變性30sec ;48°C退火30sec ;72°C延伸lmin30sec ;30個循環(huán)后72°C保溫5min。PCR純化產(chǎn)物經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切，回收目的片段，再與經(jīng)過同樣酶切處理過的表達載體pET-28a(+)連接構建質(zhì)粒pET28D3，4°C過夜。取10 μ I連接產(chǎn)物pET28D3轉(zhuǎn)化到100 μ IEscherichia coli TransTl感受態(tài)細胞中，涂布于含Kan的LB固體平板上，37°C溫箱培養(yǎng)13h，從轉(zhuǎn)化板上挑取幾株單菌落，使用引物(T7，T7ter)進行菌落PCR擴增篩選陽性克隆子，從而獲得重組大腸桿菌菌株TransTl/pET28D3。
[0030]根據(jù)人工合成的ianK-NC核苷酸序列設計不帶終止密碼子的引物inaK_NF和inaK-CR:
[0031 ]上游引物 inaK-NF: 5’ GCAGGATCCATGACTCTCGACAAGGCGT3’(劃線部分為 BamH I 酶切位點)
[0032]下游引物inaK-CR: 5，GCAGGATCCCTTTACCTCTATCCAGTCATCGTCC3 ’(劃線部分為BamH I酶切位點)
[0033]以ianK-NC/pGH質(zhì)粒DNA為模板進行PCR擴增獲得目的基因ianK-NC。PCR反應參數(shù)為:94°C預變性5min ;然后94°C變性30sec ;55°C退火30sec ;72°C延伸30sec ；30個循環(huán)后72°C保溫Smin15PCR純化產(chǎn)物經(jīng)BamH I酶切，回收目的片段，再與經(jīng)過同樣酶切處理并去磷酸化的質(zhì)粒PET28D3連接構建質(zhì)粒pET28NCD3，4°C過夜。取10 μ I連接產(chǎn)物pET28NCD3轉(zhuǎn)化到100μ lEscherichiacoliBL21(DE3)感受態(tài)細胞中，涂布于含Kan的LB固體平板上，37°C溫箱培養(yǎng)13h，從轉(zhuǎn)化板上挑取幾株單菌落，使用引物(T7，inaK-CR)進行菌落PCR擴增篩選陽性克隆子，從而獲得工程菌BL21 (DE3)/pET28NCD3。
[0034]實施例2:工程菌BL21 (DE3) /NCD3全細胞催化劑的制備
[0035]取工程菌BL21(DE3)/NCD3 和只含有 pET_28a(+)的空質(zhì)粒 EscherichiacoliBL21(DE3)菌株，以0.1%的體積比接種量接種于含50 μ g/mL卡那抗性的LB培養(yǎng)液中，37°C快速振蕩12h，然后將此活化的菌液再以1%體積比接種量接種到新鮮的LB誘導培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)3-4h，待菌體密度0D600=0.5左右，加入終濃度0.05mMIPTG20°C誘導培養(yǎng)20h, 12000rpm離心5min，收集菌體，置于超低溫冷凍真空干燥機上凍成干粉即為全細胞催化劑 D-lCarE30
[0036]細胞組分的分離，取適量上述離心收集菌體，PBS懸浮離心洗滌3次，再用適量的PBS懸浮于冰水混合物下超聲波破碎菌體，115000g離心lh，上清即為細胞質(zhì)組分，沉淀用含有0.01mMMgCl2和2%TritonX_100PBS重懸沉淀，室溫放置30min溶解細胞內(nèi)膜成分，115000g離心lh，上清即為細胞內(nèi)膜組分，而沉淀即為細胞外膜成分，將相同蛋白含量的細胞組分進行Westen blot (圖2)驗證，結(jié)果顯示細胞質(zhì)和細胞內(nèi)膜中均無融合蛋白，只有細胞外膜出現(xiàn)融合蛋白，大小約82kDa，與預期大小相當，表明重組羧酸酯酶D-lCarE3被成功錨定到了大腸桿菌BL21(DE3)的細胞表面。
[0037]全細胞催化劑D-lCarE3活性的測定采用pNPG法:取420 μ ll/15mol/LpH7.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液(含0.4%TritonX-100,0.1%阿拉伯膠)，加入底物30 μ IlOmMpNPG乙腈溶液，37°C預熱5min，再加入50 μ I適當稀釋全細胞催化劑D_lCarE3反應5min，立即加入50 μ 10.1MNa2CO3終止反應。以不加全細胞催化劑D_lCarE3為對照，在酶標儀405nm下測定吸光度值。1個酶活單位(U/mL)定義為一定條件下，每分鐘分解底物pNPG生成I μ moLp-硝基苯酚所需要的酶量。
[0038]實施例3:工程菌BL21 (DE3) /NCD3全細胞催化劑的應用
[0039]稱取1mg實施例2所述全細胞催化劑D_lCarE3加入100 μ I 100mg/ml的氟氯氰菊酯丙酮溶液中室溫震蕩反應60min，加入等體積的正己烷抽提，離心取上層液適量于硅膠G板上進行簿層層析分析，以正己烷:丙酮體積比4:1為展開劑展開，自然風干硅膠G板于溴蒸汽熏5s，噴灑0.1%聯(lián)甲苯胺丙酮溶液，風干后陽光下紫外照射2min顯色(圖3)，結(jié)果顯示全細胞催化劑D-lCarE3能夠催化擬除蟲菊酯農(nóng)藥氟氯氰菊酯形成兩種產(chǎn)物I和產(chǎn)物2，可以用在擬除蟲菊酯農(nóng)藥污染上的處理。[0040]將實施例2所述全細胞催化劑D_lCarE3放入甲醇溶液中耐受Ih回收細胞測定其催化活性無損失，將全細胞催化劑D-lCarE3常溫放置42d，測定全細胞催化劑D_lCarE3催化活性損失不到3% (圖4)，全細胞催化劑D-lCarE3克服了原始酶的不穩(wěn)定性，不易回收利用的問題。本發(fā)明所制備的全細胞催化劑D-lCarE3具有降解馬拉硫磷、西維因和氟氯氰菊酯的作用，可以將其直接噴灑到這些農(nóng)殘污染區(qū)，使用簡單，具有廣泛的應用前景。[0041]以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實施方式】，本發(fā)明的保護范圍不限于此，任何熟悉本【技術領域】的技術人員在本發(fā)明披露的技術范圍內(nèi)，可顯而易見地得到的技術方案的簡單變化或等效替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0042]
【權利要求】
1.一種羧酸酯酶D-lCarE3細胞表面展示系統(tǒng)，其特征在于，該細胞表面展示系統(tǒng)中利用了人工合成截短的冰核蛋白inaK的NC端作為錨定蛋白并與靶蛋白羧酸酯酶D-lCarE3融合構建了重組質(zhì)粒PET28NCD3。
2.一種羧酸酯酶D-lCarE3細胞表面展示工程菌，其特征在于，利用權利要求1所述中的重組質(zhì)粒PET28NCD3轉(zhuǎn)化到表達宿主BL21構建了細胞表面展示工程菌BL21/pET28NCD3。
3.一種包含權利要求2所述工程菌BL21/pET28NCD3全細胞催化劑D_lCarE3的制備方法，其特征在于，取權利要求2所述工程菌株以0.1%的體積比接種量接種于含50 μ g/mL卡那抗性的LB培養(yǎng)液中，37°C快速振蕩12h，然后將此活化的菌液再以1%體積比接種量接種到新鮮的LB誘導培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)4h，待菌體密度0D600=0.5，加入終濃度0.05mMIPTG20°C誘導培養(yǎng)20h，12000rpm離心5min，收集菌體，置于超低溫冷凍真空干燥機上凍成細胞干粉即為全細胞催化劑D-lCarE3。
4.全細胞催化劑D-lCarE3在環(huán)境農(nóng)`殘污染處理中的應用。
【文檔編號】A62D101/04GK103882046SQ201410030552
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年1月23日 優(yōu)先權日:2014年1月23日
【發(fā)明者】黃遵錫, 謝振榮, 丁俊美, 唐湘華, 李俊俊, 許波, 楊云娟, 周峻沛 申請人:云南師范大學