專利名稱：羧酸酯酶的重組表達的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
羧酸酯酶能夠水解羧酸酯，從而產(chǎn)生羧酸(鹽)和醇。羧酸酯酶屬于水解酶超家 族。已經(jīng)在從原核細胞到真核細胞的多種物種中鑒定出了羧酸酯酶。

發(fā)明內(nèi)容
在一個方面中，本公開內(nèi)容提供了一種用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，包括將經(jīng)改造而 表達編碼羧酸酯酶或其變體之基因的真核細胞在適于表達該羧酸酯酶或其變體的條件下 進行培養(yǎng)。在另一個方面中，本公開內(nèi)容提供了一種用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，包括將經(jīng)改造 而表達編碼微生物羧酸酯酶或其變體之基因的真核細胞在適于表達該微生物羧酸酯酶或 其變體的條件下進行培養(yǎng)。在另一個方面中，本公開內(nèi)容提供了一種用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，包括將經(jīng)改造 而表達編碼羧酸酯酶或其變體之基因的絲狀真菌細胞在適于表達該羧酸酯酶或其變體的 條件下進行培養(yǎng)。在另一個方面中，本公開內(nèi)容提供了表達載體，其包含編碼羧酸酯酶或其變體的 基因以及能促進該羧酸酯酶或其變體在真核細胞中表達的調(diào)節(jié)序列，其中所述調(diào)節(jié)序列與 該基因可操縱地連接。在另一個方面中，本公開內(nèi)容提供了包含表達載體的真核細胞，所述表達載體包 含編碼羧酸酯酶或其變體的基因以及能促進該羧酸酯酶或其變體在真核細胞中表達的調(diào) 節(jié)序列，其中所述調(diào)節(jié)序列與該基因可操縱地連接。在另一個方面中，本公開內(nèi)容提供了組合物，其包含真核細胞以及該真核細胞所 表達的羧酸酯酶或其變體。在另一個方面中，本公開內(nèi)容提供了組合物，其包含絲狀真菌細胞以及該絲狀真 菌細胞所表達的羧酸酯酶或其變體。在另一個方面中，本公開內(nèi)容提供了組合物，其包含通過本公開內(nèi)容的方法所產(chǎn) 生的分離的羧酸酯酶或其變體。在另一個方面中，本公開內(nèi)容提供了使用本公開內(nèi)容之組合物的方法。以上概述僅用于說明，而并非旨在以任何方式進行限制。除了上述說明的各方面、 實施方案和特征以外，其它方面、實施方案和特征在參考附圖和下文的詳細說明之后將是 很明顯的。


圖1顯示質(zhì)粒pIGF的示意圖。
圖2顯示質(zhì)粒pYGl. 2的示意圖。圖3顯示來自以下菌株的培養(yǎng)基凝膠電泳結(jié)果轉(zhuǎn)化有pYGl. 2-CarE-his的黑曲 霉(Aspergillus niger)M54(L2)；轉(zhuǎn)化有pYGl. 2的黑曲霉M54(L3)；以及未轉(zhuǎn)化的黑曲霉 M54(L4)。蛋白分子量標(biāo)志物示于Li。L2中所示的約29. OKD的條帶是羧酸酯酶的條帶。圖4顯示以下菌株所表達的羧酸酯酶的Western印跡結(jié)果轉(zhuǎn)化有 pPIC9K-CarE-His 的巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115 (L4)；以及轉(zhuǎn)化有 pYGl. 2-CarE-His的黑曲霉M54(L5)。在以下陰性對照中未檢測到羧酸酯酶的表達轉(zhuǎn)化有 PPIC9K的巴斯德畢赤酵母GS115(L3)；未轉(zhuǎn)化的黑曲霉M54 (L6)；轉(zhuǎn)化有pYGl. 2的黑曲霉 M54(L7)。陽性對照(含有His標(biāo)簽的蛋白質(zhì))示于Li，蛋白標(biāo)志物示于L2。圖5顯示轉(zhuǎn)化有pPIC9K-CarE-His的巴斯德畢赤酵母GSl 15所表達羧酸酯酶的凝 膠電泳結(jié)果，其中在培養(yǎng)24小時(L3)、48小時(L4)和72小時(L5)后采樣。蛋白標(biāo)志物 示于Li，轉(zhuǎn)化有pPIC9K的巴斯德畢赤酵母GSl 15的培養(yǎng)基示于L2。圖6顯示在培養(yǎng)的不同時間點從培養(yǎng)基中分離的羧酸酯酶的酶活性。圖7顯示在不同pH值下測量的重組羧酸酯酶的相對酶活性。圖8顯示在以不同溫度將羧酸酯酶處理10或30分鐘后在37°C下測量的重組羧酸 酯酶的相對酶活性。圖9顯示在不同溫度下測量的重組羧酸酯酶的相對酶活性。 具體實施方案在下文的詳細描述中，將參考構(gòu)成本文一部分的附圖。在附圖中，相似的符號一般 指代相似的部分，除非其上下文有其他明確表述。在具體實施方案、附圖和權(quán)利要求中描述 的說明性實施方案并無限制之意。可以利用其他實施方案、進行其他改動，而不偏離本文之 主題的構(gòu)思或范圍。本公開內(nèi)容涉及用于產(chǎn)生羧酸酯酶及其變體的重組方法、可用于重組產(chǎn)生羧酸酯 酶及其變體的表達載體和宿主細胞。本公開內(nèi)容還涉及包含所述重組產(chǎn)生的羧酸酯酶及其 變體的組合物以及使用該組合物的方法。在一個方面中，本公開內(nèi)容提供了一種用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括將 經(jīng)改造而表達編碼羧酸酯酶或其變體之基因的真核細胞在適于表達該羧酸酯酶或其變體 的條件下進行培養(yǎng)。在另一個方面中，本公開內(nèi)容提供了一種用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括 將經(jīng)改造而表達編碼羧酸酯酶或其變體之基因的絲狀真菌細胞在適于表達該羧酸酯酶或 其變體的條件下進行培養(yǎng)。在另一個方面中，本公開內(nèi)容提供了一種用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括 將經(jīng)改造而表達編碼微生物羧酸酯酶或其變體之基因的真核細胞在適于表達該微生物羧 酸酯酶或其變體的條件下進行培養(yǎng)。在某些實施方案中，該方法還可包括從真核細胞培養(yǎng)物中分離所述羧酸酯酶或其 變體。在某些實施方案中，該方法還可包括將含有編碼羧酸酯酶或其變體之基因的表達載 體引入所述真核細胞中。真核細胞
真核細胞是組織成包裹在膜中的復(fù)雜結(jié)構(gòu)(尤其包括含有遺傳物質(zhì)的與膜結(jié)合 的核)的細胞。本公開內(nèi)容的真核細胞包括但不限于真菌細胞、原生生物細胞、動物細胞和 植物細胞。真菌細胞可包括但不限于酵母細胞和絲狀真菌細胞。本公開內(nèi)容的酵母細胞可根據(jù)其系統(tǒng)發(fā)生特征而歸為子囊真菌亞門 (Ascomycota)和擔(dān)子真菌亞門(Basidiomycota)。酵母細胞的說明性實例包括但不僅 限于畢赤酵母屬物種如安格斯畢赤酵母(Pichia angusta)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、異常畢赤酵母(Pichia anomala)、樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)、甲 醇畢赤酵母(Pichia methanolica)和季也蒙畢赤酵母(Pichia guilliermondii)； 漢遜酵母屬(Hansenula)物種如異常漢遜酵母(Hansenula anomala)、多形漢遜酵母 (Hansenulapolymorpha)、溫奇漢遜酵母(Hansenula wingei)、杰丁漢遜酵母(Hansenula jadinii)禾口 土星漢遜酵母(Hansenula saturnus)；酵母屬(Saccharomyces)如酉良^ (Saccharomyces cerevisiae)、貝 _ BJ (Saccharomyces bayanus) > ^ ii
母(Saccharomyces boulardii)；假絲酵母屬(Candida)物種如白假絲酵母(Candida albicans)、Candidamethylica、波氏假絲酵母(Candida boidinii)、熱帶假絲酵母 (Candidatropicalis) ,Candida wickerhamii、麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)和光滑 假絲酵母(Candida glabrata)、光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)；以及克魯維酵母菌 屬(Kluyveromyces)物種禾口裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)物種。在一些實施方案中，所述酵母細胞為巴斯德畢赤酵母、多形漢遜酵母、釀酒酵母或 光滑球擬酵母中的一種或多種。在一些實施方案中，所述酵母細胞為巴斯德畢赤酵母。在 一些實施方案中，所述酵母細胞為巴斯德畢赤酵母菌株GS115細胞、巴斯德畢赤酵母菌株 KM71細胞或巴斯德畢赤酵母菌株MC100-3細胞中的一種或多種。在一些實施方案中，所述 酵母細胞為多形漢遜酵母菌株ATCC34438細胞。絲狀真菌可包括但不僅限于以多細胞絲的形式生長的任何微小真菌 (microscopic fungi)物種。在一些實施方案中，所述絲狀真菌細胞包括但不僅限 于支頂孢屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、鐮刀菌屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬 (Humicola) >(Mucor),^M (Myceliophthora) > βM (Neurospora) > # 霉屬(Penicillium)、梭孢殼菌屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)和木霉屬 (Trichoderma)中的多個物種。在一些實施方案中，所述絲狀真菌細胞為泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、臭曲 霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)細胞。在一個 說明性實施方案中，所述絲狀真菌細胞為黑曲霉ATCC 12049菌株細胞。在另一個說明性實 施方案中，所述絲狀真菌細胞為米曲霉RIB40菌株細胞。原生生物細胞可包括但不僅限于原生動物細胞和藻類細胞。動物細胞可包括但不僅限于哺乳動物細胞、鳥類細胞、兩棲類細胞和昆蟲細 胞。動物細胞的說明性實例包括豬肝細胞、人胚腎293(HEK293)細胞、中國倉鼠卵巢細 胞(CH0)、斑馬魚PAC2細胞、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)A6腎上皮細胞、秀麗隱桿線蟲 (Caenorhabditis elegans)細胞和果蠅細胞。
植物細胞可包括但不限于薄壁組織細胞、厚角細胞和厚壁組織細胞。植物細胞的 說明性實例為煙草BY-2細胞、毛曼陀羅(Datura innoxia)細胞系和SB-I細胞系。在一些實施方案中，本公開內(nèi)容的真核細胞可帶有導(dǎo)致與野生型菌株相比發(fā) 生表型改變的一種或多種突變。真核細胞中的突變可以是天然或非天然的。天然突變 可在進化過程中自發(fā)形成。非天然突變可以使用本領(lǐng)域已知方法人工產(chǎn)生。在一個說 明性實例中，可以通過使細胞接觸物理誘變劑(如UV照射)或化學(xué)誘變劑(如羥胺和 漠化乙,定)來產(chǎn)生突變(參閱如 Hopwood， The Isolation of Mutants in Methods in Microbiology (J. R. Norris 禾口 D. W. Ribbons 編輯)1970，363—433，Academic Press, New York)。在另一個說明性實例中，可通過基因缺失技術(shù)(如同源重組)來產(chǎn)生突變，以破 壞一種或多種靶基因的表達(參閱如Alberts等，Chapter 5 DNAR印Ii cat ion，Repair, and Recombination, Molecular biology of the cell,2002,845, Garland Science. New York) 0在另一個說明性實例中，可以通過基因修飾技術(shù)(如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR))來產(chǎn)生突變(參閱如 Botstein 等，Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 1985, vol 229, No.4719,1193-1201 ；Lo 等，Specific amino acid substitutions in bacterioopsin !Replacement of a restriction fragment in the structural gene by syntheticDNA fragments containing altered codons,Proc. Natl. Acad.Sci. USA 1985, vol 81, No. 8,2285-2289 ；Youngman 等，Genetic transposition and insertionalmutagenesis in Bacillus subtilis with Streptococcus faecalis transposon Tn917, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1983, vol 80，No. 8，2305-2309)。在一些實施方案中，本公開內(nèi)容的真核細胞可帶有使其無法合成細胞生長所必需 物質(zhì)的一種或多種突變。突變可發(fā)生在參與氨基酸、核苷酸、糖、脂肪酸、維生素和其它必需 物質(zhì)的合成和/或代謝的基因中。在一些實施方案中，所述真核細胞可以是突變體酵母細胞，其在分別參與尿苷、色 氨酸、腺苷和亮氨酸合成的ura、trp、ade和Ieu基因中帶有突變(Agaphonov等，Isolation and characterization of the LEU2 gene ofHansenula polymorpha, Yeast 1994, vol 10, 509-513 ；Bogdanova等, Plasmideorganization during integrative transformation in Hansenula polymorpha, Yeast 1995, vol 11, 343-353 ;Merckelbach 等，Cloning and sequencing of theura3 locus of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha and its use forthe generation of a deletion by gene replacement,Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993，vol 40,361—364)。在一些實施方案中，所述真核細胞可以是缺失pyrG基因功能的突變體絲狀 真菌細胞(例如黑曲霉菌株)，它們無法合成尿苷，因此不能在無尿苷的培養(yǎng)基上生長 (Liu 等，Construction of pyrG auxotrophic Aspergi1lusniger strain, Journal of microbiology 2001, vol 21，No. 3，15-16)。在一個說明性實施方案中，所述真核細胞是黑 曲霉M54，該菌株在2009年6月14日按照《國際承認用于專利程序的微生物保存布達佩 斯條約》(布達佩斯條約)的規(guī)定和條件保藏于中國武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)，保藏號為 CCTCC M 209121。在另一個說明性實施方案中，所述真核細胞是營養(yǎng)缺陷型米曲霉突變體菌 株，例如缺失argB基因的米曲霉M-2-3，該菌株無法合成精氨酸，因此不能在無精氨酸的培養(yǎng)基上生長(Gomi 等，Integrative transformation ofAspergillus oryzae with a plasmid containing the Aspergillus nidulans argBgene.Agric Biol Chem. 1987，vol 51，2549-2555)，還例如缺失niaD基因的米曲霉，其缺少硝酸還原酶，因 此無法在以硝酸鹽作為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長(Unkles等，The development of a homologous transformation systemfor Aspergillus oryzae based on the nitrate assimilation pathway :Aconvenient and general selection system for filamentous fungaltransformation,Molecular and General Geneticsl989,vol 218, No. 1,99-104)。羧酸酯酶及其變體本文使用的術(shù)語“羧酸酯酶”指能將羧酸酯水解成羧酸(鹽)和醇的酶多肽。羧 酸酯酶可以是野生型羧酸酯酶或其任何變體。野生型羧酸酯酶的變體與野生型羧酸酯酶 的氨基酸序列和/或氨基酸修飾不同，但仍有將羧酸酯水解成羧酸(鹽)和醇的能力。變 體可具有野生型羧酸酯酶的一個或多個氨基酸替換、添加、缺失、插入、截短、修飾(如磷酸 化、糖基化、標(biāo)記等)或其任何組合。變體可包括野生型羧酸酯酶的天然變體以及人工多肽 序列，例如通過化學(xué)合成或重組方法獲得的多肽序列。變體可包括野生型羧酸酯酶的片段、 突變體、雜合體、類似物和衍生物。變體可含有非天然氨基酸殘基。已經(jīng)從大量物種(包括但不僅限于動物、昆蟲、植物和微生物)中鑒定和分離了羧 酸酯酶。已經(jīng)鑒定了來自許多物種的羧酸酯酶的核苷酸序列和氨基酸序列。在一個實施方案中，所述羧酸酯酶來自微生物。術(shù)語“微生物”指除人、動物和植 物以外的任何有生命的生物。微生物可包括但不限于原核生物如細菌、原生動物、真菌、原 生生物和古細菌。微生物的說明性實例為大腸桿菌(Escherichia coli)、嗜熱脂肪地芽孢 木干胃(Geobaci 1 lusstearothermophilus) >(Bacillus cereus) Λ^ΜΨχ^Μ 母(Candida rugosa)、惡性皰原蟲(Plasmodium falciparum)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、腸道沙門氏菌(Salmonella enterica)禾口煙曲霉(Aspergillus fumigatus)。已經(jīng)從許多微生物中分離了羧酸酯酶，并獲得了其相應(yīng)的核苷酸序列和氨基酸序 列。表1列出了微生物羧酸酯酶的說明性實例以及以GenBank登記號標(biāo)明的其核苷酸及多 肽序列。表1.不同微生物的羧酸酯酶的說明性實例
權(quán)利要求
1.一種用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括將經(jīng)改造而表達編碼來自微生物的羧酸酯酶或其變體之基因的真核細胞在適于表達 該羧酸酯酶或其變體的條件下進行培養(yǎng)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述真核細胞是酵母細胞。
3.一種用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括將經(jīng)改造而表達編碼羧酸酯酶或其變體之基因的真核細胞在適于表達該羧酸酯酶或 其變體的條件下進行培養(yǎng)，其中所述真核細胞是絲狀真菌細胞。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述絲狀真菌細胞來自曲霉(Aspergillus)屬。
5.一種表達載體，其包含編碼微生物羧酸酯酶或其變體的基因； 禾口能促進該微生物羧酸酯酶或其變體在真核細胞中表達的調(diào)節(jié)序列，其中所述調(diào)節(jié)序列 與該基因可操縱地連接。
6.一種表達載體，其包含編碼羧酸酯酶或其變體的基因； 禾口能促進該羧酸酯酶或其變體在絲狀真菌細胞中表達的調(diào)節(jié)序列，其中所述調(diào)節(jié)序列與 該基因可操縱地連接。
7.一種包含權(quán)利要求5和6中任一項的表達載體的真核細胞。
8.一種組合物，其包含 真核細胞；和該真核細胞所表達的微生物羧酸酯酶或其變體。
9.一種組合物，其包含 絲狀真菌細胞；和該絲狀真菌細胞所表達的微生物羧酸酯酶或其變體。
10.一種將含有羧酸酯基團的化合物轉(zhuǎn)化成無羧酸酯基團的化合物的方法，包括 將該化合物與通過權(quán)利要求1和3中任一項的方法所產(chǎn)生的羧酸酯酶或其變體一起孵
全文摘要
本公開內(nèi)容提供了在真核細胞中產(chǎn)生羧酸酯酶或其變體的方法。本公開內(nèi)容還提供了用于高水平表達羧酸酯酶的表達載體、包含所述表達載體的真核細胞以及它們的用途。本公開內(nèi)容還提供了包含通過本申請所述方法所產(chǎn)生的羧酸酯酶或其變體的組合物，以及該組合物的用途。
文檔編號C12N5/10GK101993861SQ200910166839
公開日2011年3月30日 申請日期2009年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月31日
發(fā)明者劉鐘濱 申請人:同濟大學(xué)