用于從微藻提取角鯊烯的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于不使用有機溶劑提取通過使屬于破囊壺菌目物種家族的微藻發(fā)酵而產(chǎn)生的角鯊烯的方法，其特征在于它包括以下步驟：1)制備屬于破囊壺菌目家族的微藻的生物質(zhì)以降低間質(zhì)可溶物質(zhì)的濃度，并且因此獲得30%至99%的純度，表述為相比發(fā)酵介質(zhì)總干重的生物質(zhì)干重；2)使用選自中性或堿性蛋白酶的組的蛋白酶處理產(chǎn)生的生物質(zhì)以破壞所述微藻的細胞壁同時阻止由所述酶處理產(chǎn)生的乳液形成；3)離心所產(chǎn)生的反應混合物以將油與水相分離；以及4)回收由此產(chǎn)生的富集角鯊烯的粗制油。
【專利說明】用于從微藻提取角鯊烯的方法
[0001]本發(fā)明涉及在不存在有機溶劑下，從破囊壺菌屬家族的微藻最優(yōu)化提取角鯊烯的方法。
[0002]對于本發(fā)明的目的，表述“破囊壺菌目物種家族的微藻”意在是指屬于裂殖壺菌屬、Aurantiochytrium sp.和破囊壺菌屬物種的微藻。
[0003]角鯊烯是一種三萜，包括30個碳原子和50個氫原子的類異戊二烯，化學式為:2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22- 二十四碳六烯。
[0004]這是一類由所有高等生物，包括在人類(在皮脂中發(fā)現(xiàn))中自然產(chǎn)生的脂類。角鯊烯事實上是在膽固醇、類固醇激素和維生素D生物合成中一種必需中間體(一種膽固醇代謝途徑的酶，角鯊烯單加氧酶，通過氧化角鯊烯分子的一個末端將誘導其環(huán)化作用并產(chǎn)生羊毛脂留醇，后者將轉(zhuǎn)變?yōu)槟懝檀蓟蚱渌惞檀?。
[0005]在工業(yè)上，角鯊烯特別地應用于食品部門、化妝品領域和制藥領域。
[0006]作為食品增補劑，角鯊烯通常被配制為膠囊劑或油類。
[0007]在化妝品領域，這一分子可以被用作保濕霜中的抗氧化劑、抗靜電劑和軟化劑，迅速滲透皮膚而不留下脂肪痕跡或感覺，并且與其他油類和維生素混合良好。
[0008]在這個領域應當注意的是，考慮到角鯊烯極不穩(wěn)定性(6不飽和的)，它是飽和形式角鯊烷(通過氫化作用獲得)，與角鯊烯相比是更好的抗氧化劑，角鯊烷在市場上可以找到，通常來講有非常高的純度( 99%)。
[0009]毒理學研究表明，按照在化妝品中使用的濃度，角鯊烯和角鯊烷并不顯示任何毒性并且對人類皮膚無刺激、不致敏。
[0010]在制藥領域中，角鯊烯被用作疫苗的佐劑。
[0011]這些佐劑是刺激免疫系統(tǒng)并增加對疫苗相應的物質(zhì)。
[0012]角鯊烯的純度水平在應用領域是必要的。
[0013]事實上，如果口服，角鯊烯被認為是完全安全的，但是注射途徑是爭論的主題。
[0014]事實上，在醫(yī)學領域，在角鯊烯被雜質(zhì)污染的情況下會增加人類受試者傷害的風險，因為根據(jù)定義，這一佐劑也可以因其自身雜質(zhì)誘導一種強烈的免疫反應。
[0015]因此必須獲得高質(zhì)量、無雜質(zhì)的角鯊烯(雜質(zhì)是指痕量金屬，尤其是指汞和其他毒素)。
[0016]文獻中提出了幾種生產(chǎn)和提取角鯊烯的途徑。
[0017]它是通常在軟骨魚類的肝臟中發(fā)現(xiàn)貯藏的一種化合物，例如深海鯊魚(角鯊烯因此得名)。
[0018]因此這就是它們被過度捕撈的原因之一，鯊魚已經(jīng)因其鰭而被捕殺。鯊魚肝臟因此被出售以生產(chǎn)被譽為“有益健康”的膠囊。
[0019]然而，即使出售的角鯊烯主要從鯊魚肝臟中提取，也不能排除健康問題。
[0020]這是因為鯊魚可以感染病原體，這些病原體可以產(chǎn)生對人類有害的物質(zhì)。此外，鯊魚肝臟(生物體的消除和凈化器官)可以包含對人類有害的毒素，例如carchatoxin。
[0021]這些令人擔憂的環(huán)境問題(鯊魚數(shù)量的大量減少)和令人擔憂的健康問題(魚肝也貯藏令人擔憂的有關(guān)健康的毒素)，促使人們從植物中提取角鯊烯。
[0022]因此將它從橄欖油、棕櫚油進行提取，以及在來自谷類或源自莧屬植物、種子、米糠或小麥胚芽的油中進行分離是可能的。
[0023]然而，在這種情況中一個主要缺點是提取的角鯊烯量很小，按重量計大約從0.1%至 0.7%。
[0024]作為從鯊魚肝臟中或從植物中這些提取方法的第一替代方案，通常由于需要實質(zhì)上的富集和純化方法的實施而成本昂貴，人們提出了用于從微生物(天然酵母或重組酵母，特別地是酵母屬類型)中生產(chǎn)角鯊烯的第一方法。
[0025]因此，釀酒酵母因其生產(chǎn)角鯊烯的能力而被熟知，盡管量很小:大約0.041mg/g 生物質(zhì)(Bhattachar jee, P.et al.(巴特查爾吉，P.等人)，2001，在 World J.Microb.Biotechnol.(《世界微生物學和生物技術(shù)期刊》)，17，pp.811-816)中。
[0026]因此通過遺傳重組，已經(jīng)對其生產(chǎn)能力進行了最優(yōu)化處理。然而，如用于醫(yī)學領域(作為疫苗佐劑的純度高于97%的角鯊烯的生產(chǎn))的專利申請W02010/023551所呈現(xiàn)的，在具有超高生產(chǎn)角鯊烯重組酵母之前(超過15%的干細胞重量)，這一第一替代方案還不能工業(yè)化。
[0027]然而，這些重組細胞的獲得需要使用分子生物學工具，實施大量艱辛的、漫長的和復雜的代謝工程步驟，導致角鯊烯生物合成途徑的刺激和角鯊烯分解代謝途徑的抑制。
[0028]作為從鯊魚肝臟或從植物中提取方法的第二替代方案，提出了用于從破囊壺菌家族(包括破囊壺菌屬、Aurantiochytrium和裂殖壺菌屬),更特別地Schizochytriummangrovei或裂殖壺菌的微藻生產(chǎn)角S烯的有希望的方法。
[0029]這些微藻在異養(yǎng)`條件下(無光；提供葡萄糖作為碳源)生產(chǎn)角鯊烯，并且可以因此容易地由微生物發(fā)酵領域普通技術(shù)人員操作。
[0030]這些方法因此通過受控制的發(fā)酵條件提供純化很容易達到以滿足食品、化妝品和醫(yī)學的需要的角鯊烯質(zhì)量。
[0031]然而在這些破囊壺菌目家族的微藻中，角鯊烯是感興趣的其他脂類化合物的副產(chǎn)物，例如二十二碳六烯酸(或DHA)，ω 3家族的一種多不飽和脂肪酸。
[0032]因此特別地角鯊烯被描述為商業(yè)DHA油類(連同胡蘿卜素和固醇類)的不可皂化部分的組分之一。
[0033]通過比較，Schizochytrium mangrovei FBI菌株以按細胞干重6.2%的比例生產(chǎn)DHA，對于角鯊烯0.017%。
[0034]因此，這些自然生產(chǎn)角鯊烯的微生物以小量生產(chǎn)角鯊烯:
[0035]-對于破囊壺菌ACEM6063 (比較 Lewis et al.(劉易斯等人)，Mar.Biotechnol.(《海洋生物技術(shù)》)，2001, pp439-447)，大約0.lmg/g生物質(zhì)，
[0036]-對于Schizochytrium mangrovei FBI (比較 Yue Jiang et al.(越江等人)，J.Agric.Food Chem.(《農(nóng)業(yè)食品化學期刊》)，2004, 52，ppll96_1200)，大約 0.162mg/g 生物質(zhì)。
[0037]為了增加產(chǎn)量，因此明顯的需要最優(yōu)化發(fā)酵條件。
[0038]然而，盡管做出了所有的努力，這些值依然低于橄欖油的參考值(大約4.24mg/g)。
[0039]最好地，這些最優(yōu)化的產(chǎn)量導致的產(chǎn)量大約是:[0040]-每g的破囊壺菌ACEM6063生物質(zhì)，Img至1.2mg的角藍烯(比較Qian Li etal.(錢李等人)，J.Agric.Food Chem(《農(nóng)業(yè)食品化學期刊》).，2009，57，4267-4272 或 Lewiset al.(劉易斯等人)，in Mar.Biotechnol (《海洋生物技術(shù)》).，2001，3，439-447);
[0041]-每g的裂殖壺菌生物質(zhì),0.72mg的角藍烯(比較G.Chen etal.(G.陳等人)，NewBiotechnology (《新生物技術(shù)》)，2010，27-4, pp382_389)；
[0042]-每g 的 Aurantiochytrium mangroveiFB31 生物質(zhì)，0.53mg 的角 S 烯(比較K.ff.Fan et al.(K.W.范等人)，World J.Microbiol.Biotechnol.(《世界微生物與生物技術(shù)期刊》)，2010，26-3，ppl303-1309)；
[0043]-每g的 Schizochytrium mangrovei 生物質(zhì)，1.17±0.6mg 的角藍烯(比較C-J Yueand Y.Jiang (越和 Y 江)，Process Biochemistry (《生物化學進展》)，2009，44，923-927)。
[0044]本申請公司自身也致力于通過以下進一步改進破囊壺菌目物種家族的微藻的角鯊烯產(chǎn)量:提供一種使其可能以在本領域的文獻中還未達到的水平生產(chǎn)角鯊烯的方法，例如每100g的生物質(zhì)至少8g的角鯊烯(如將在下文中舉例說明)。
[0045]在實驗室規(guī)模上，用于從來源于發(fā)酵介質(zhì)的生物質(zhì)提取角鯊烯的方法是使用有機溶劑的常規(guī)方法:
[0046]-Yue Jiang et al.(越江等人)，J.Agric.Food Chem.(《農(nóng)業(yè)食品化學期干IJ》)，2004, 52，1196-1200描述了一種方法，在該方法中這些脂類溶解在甲醇/丙酮(7:3v/v)中并且然后在氯仿/甲醇(2: lv/v)中洗滌。
[0047]-在C-J Yue (C-J 越)和 Y.Jiang (Y.江)，Process Biochemistry (《生物化學進展》)，2009, 44，923-927中，角鯊烯和膽固醇的提取是在預先使用乙醇對凍干細胞進行皂化后使用己烷進行的；
[0048]-在G.Chen et al.(G.陳等人)，在 New Biotechnology (《新生物技術(shù)》)，2010，27-4，pp382-389中，角鯊烯的提取是在使用KOH (10%w/v)-乙醇(75%v/v)對凍干細胞進行皂化后使用己烷進行的；
[0049]-在Lewiset al.(劉易斯等人)，Mar.Biotechnol (《海洋生物技術(shù)》).，2001，439-447中，首先使用三元混合物(氯仿/甲醇/水(1:2:0.8v/v/v)從凍干細胞中提取總脂類，然后為了獲得不皂化的脂類，使用在甲醇/水(4: lw/v)中5%的KOH溶液對這些總脂類的部分進行處理，隨后使用己烷-氯仿(4: lv/v)對這些中性不皂化脂類進行實際提取。
[0050]在更大的規(guī)模，為了避免使用對人類及環(huán)境有害的溶劑，提出了其他的溶液。
[0051]有趣的是在專利KR2008/0017960中，提出例如將包含角鯊烯的介質(zhì)放置在環(huán)糊精溶液中以獲得環(huán)糊精/角鯊烯復合物，然后添加凝固劑(例如CaCl2、CaSO4, MgCl2或MgSO4)以利于它從所述介質(zhì)中分離。然而，為了將其按照這樣進行分離還必須將角鯊烯解復合。
[0052]然而事實上主要描述了兩種技術(shù):
[0053]-用于使用超臨界CO2提取的方法；
[0054]-用于在有機溶劑不存在下提取的方法。
[0055]因此用于使用氯仿或使用己烷提取的方法的第一替代方案是超臨界C02。 [0056]這種技術(shù)很適合于具有分子重量低于500道爾頓的非極性化合物的提取(角鯊烯的分子重量稍微低于400Da)。
[0057]角鯊烯在壓力為100和250bar之間在超臨界CO2中是可溶的。
[0058]使用這種技術(shù)進行提取的大量工作已經(jīng)在葡萄藻、斜生柵藻或德爾布有孢酵母上進行。
[0059]此外超臨界CO2因此用于細胞裂解和用于角鯊烯的分離兩者。
[0060]然而，建議在從那里將這些脂類提取之前將細胞凍干，這需要大量的額外工作以使該技術(shù)適合于微生物的類型。
[0061] 此外，在令人注目的成本下這些條件難以適用于工業(yè)規(guī)模。
[0062]第二技術(shù)替代方案是在不存在有機溶劑下液體提取的方法。
[0063]來自Benemann (伯南曼)和Oswald (奧斯瓦德)大量文章和文件或來自例如專利EP1252324和EP1305440的傳授內(nèi)容，描述了這種方法，但是沒有它們的任何一個特別指明針對角鯊烯提取的最優(yōu)條件。
[0064]在他們1996 年名為(Systems and Economic Analysis of Microalgae Pondsfor Conversion of C02to Biomass.Report prepared for the Pittsburgh EnergyTechnology Center under Grant N0.DE_FG22_93PC93204(《用于將 CO2 轉(zhuǎn)變?yōu)樯镔|(zhì)的微藻池塘的系統(tǒng)和經(jīng)濟分析，在授權(quán)編號DE-FG22-93PC93204下為匹茨堡能源技術(shù)中心準備的報告》)的文章中，J.Benemann (J.伯南曼)&W.0swald (W.奧斯瓦德)傳授離心分離不僅可以用于濃縮生物質(zhì)同時還從油相中的藻類提取脂類。
[0065]這種分離是基于水、藻類的脂類和生物質(zhì)其他組分之間在密度上相對大的差異。
[0066]特別地,Benemann (伯南曼)&0swald (奧斯瓦德)特別在用于以下的方法的背景下描述了它:從藻類生物質(zhì)提取β_胡蘿卜素，這種藻類生物質(zhì)已經(jīng)通過熱油提取方法進行了絮凝。
[0067]因此，收集和處理步驟與普通絮凝和離心分離步驟重疊。
[0068]專利ΕΡ1252324報道了以下:破裂濕潤微生物生物質(zhì)以釋放細胞內(nèi)脂類，通過用于生產(chǎn)“相分離的混合物”(包括重層和輕層)的方法處理細胞裂解產(chǎn)物，從含脂輕層重力分離重層，并且然后分解所述輕相中的水/脂類乳液以獲得該脂類。
[0069]注意到乳液狀態(tài)阻止了純脂類的回收是重要的。因此必須求助于一種方法，該方法使用一種洗滌溶液(該洗滌溶液可以是水、乙醇和/或丙酮)對該乳液進行洗滌，直至這些脂類變成“本質(zhì)上”非乳化的。然而不建議使用高于5%的非極性有機溶劑。
[0070]還應理解的是乳液的油/水界面由細胞碎片穩(wěn)定化。這就是為什么在細胞-分解步驟之前或期間加熱發(fā)酵介質(zhì)，或在細胞-分解步驟期間將堿添加至該發(fā)酵介質(zhì)促成了乳液形成減少的原因，由于這種加熱(至少50°C)或堿處理使蛋白質(zhì)變性并且使有機物質(zhì)溶解。
[0071]據(jù)說這種方法允許所有類型脂類的提取:磷脂類；游離脂肪酸；脂肪酸酯，包括脂肪酸甘油三酯；固醇類；色素類(例如類胡蘿卜素和氧合類胡蘿卜素)和其他脂類，和脂-相關(guān)化合物例如植物留醇、麥角硫因、硫辛酸、和包括胡蘿卜素、生育三烯酚類和生育酚的抗氧化劑。
[0072]在這種情況中優(yōu)選的脂類和脂-相關(guān)化合物是:膽固醇、植物甾醇、脫氫膽甾醇、生育三烯酚類、生育酚、泛醌、類胡蘿卜素和葉黃素類例如胡蘿卜素、葉黃素、番茄紅素、蝦青素、玉米黃素、角黃素、和脂肪酸例如共軛亞油酸、和Ω-3和Ω-6類型的多不飽和脂肪酸，例如二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、花生四烯酸、十八碳四烯酸、雙高-Y-亞麻酸和Y-亞麻酸。
[0073]并不是如此設想角鯊烯，也并不如此設想任何具體的細胞裂解方法或用于實施明確提供的離心的條件。
[0074]對于專利EP1305440，其特別地致力于由高山被孢霉產(chǎn)生的花生四烯酸的提取。
[0075]關(guān)于發(fā)展用于提取角鯊烯的方法(該方法比那些描述于現(xiàn)有技術(shù)中的方法更有效)，本申請公司已經(jīng)在用于從破囊壺菌屬家族的微藻的發(fā)酵介質(zhì)提取(不存在有機溶劑)這種化合物的最優(yōu)化條件方面發(fā)展了自身研究。
[0076]因此本發(fā)明涉及在不存在有機溶劑下用于提取通過使屬于破囊壺菌目物種家族的微藻發(fā)酵而產(chǎn)生的角鯊烯的方法，其特征在于它包括以下步驟:
[0077]I)制備屬于破囊壺菌目家族的微藻的生物質(zhì)以減少間質(zhì)可溶物質(zhì)的濃度，并且因此達到30%和99%之間的純度，優(yōu)選地高于95%，表達為相比發(fā)酵介質(zhì)總干重的生物質(zhì)干重，
[0078]2)將產(chǎn)生的生物質(zhì)使用蛋白酶進行處理，該蛋白酶選自中性或堿性蛋白酶的組，例如枯草桿菌蛋白酶，以此破壞所述微藻的細胞壁同時阻止由所述酶處理產(chǎn)生的乳液形成，
[0079]3)將產(chǎn)生的反應混合物進行離心以將油與水相分離，并且
[0080]4)回收由此產(chǎn)生的富集角鯊烯的粗制油。
[0081]根據(jù)本發(fā)明的方法的第一步驟在于制備屬于破囊壺菌目家族的微藻的生物質(zhì)以減少間質(zhì)可溶物質(zhì)的濃度，并且因此達到30%和99%之間的純度，優(yōu)選地高于95%，表達為相比發(fā)酵介質(zhì)總干重的生物質(zhì)干重。
[0082]對于本發(fā)明的目的，術(shù)語“間質(zhì)可溶物質(zhì)”旨在表明發(fā)酵介質(zhì)的所有的可溶性有機污染物，例如水-可溶化合物如鹽類、殘留葡萄糖、蛋白質(zhì)和肽類等等。
[0083]對于屬于破囊壺菌目家族的微藻，測試了以下商業(yè)可購得的菌株:
[0084]-裂殖壺菌屬ATCC20888，
[0085]-Aurantiochytrium sp.ATCC PRA276。
[0086]此外，本申請公司還具有其自身生產(chǎn)菌株，保藏于2011年4月14日在巴斯德研究所的法國國家微生物保藏中心[Collection Nationale de Cultures deMicroorganismes]中保藏號為CNCM 1-4469的裂殖壺菌屬以及還保藏在中國武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION of theUniversity of Wuhan)，武漢430072，中華人民共和國，保藏號為M209118的裂殖壺菌屬。
[0087]該培養(yǎng)在異養(yǎng)條件下進行?？偟膩碇v，該培養(yǎng)步驟包括預培養(yǎng)步驟(為了使該菌株復蘇)，然后是培養(yǎng)或發(fā)酵本身的步驟。后一步驟相對應于生產(chǎn)感興趣的脂類化合物的步驟。
[0088]用于培養(yǎng)這些微藻的條件在本領域是熟知的。例如，G.Chen (G.陳)在NewBiotechnology (《新生物技術(shù)》)，2010, 27-4, pp382_389的文章中，描述了包括以下連續(xù)步驟的方法:
[0089]-從依靠瓊脂營養(yǎng)培養(yǎng)基供養(yǎng)的菌株開始，該瓊脂培養(yǎng)基包括葡萄糖、谷氨酸一鈉、酵母提取物和多種微量元素，[0090]-在定軌振蕩器上的錐形瓶中制備預培養(yǎng)物，條件為pH為6溫度為25°C，以獲得復蘇的生物質(zhì)，
[0091]-使用如在預培養(yǎng)中所用的相同的培養(yǎng)基接種另一系列的生產(chǎn)錐形瓶，，取大約為0.5%(v/v)的前一步驟中獲得的生物質(zhì)，保持溫度為25°C。
[0092]預培養(yǎng)可以優(yōu)選地持續(xù)24至74小時，優(yōu)選地大約48小時。對于培養(yǎng)，就其本身而言，可以優(yōu)選地持續(xù)60至150小時。
[0093]微藻生長所需的碳源優(yōu)先地是葡萄糖。
[0094]關(guān)于氮源的性質(zhì)，本申請公司發(fā)現(xiàn)可以從下組選擇氮源，該組由以下各項組成:酵母提取物、尿素、谷氨酸鈉和硫酸銨，單獨使用或組合使用。同樣地，可以全部地或部分地將尿素置換為谷氨酸鈉，或使用谷氨酸鈉和硫酸銨的混合物。 [0095]可能傾向于酵母提取物(傳統(tǒng)地在現(xiàn)有技術(shù)方法中使用的)，補充有維生素混合物的尿素，例如由西格瑪公司(Sigma)出售的BME混合物，以5ml/l的比例使用。
[0096]優(yōu)選地，預培養(yǎng)物培養(yǎng)介質(zhì)包括維生素B1、B6和B12。
[0097]關(guān)于培養(yǎng)基的pH，如將會在下文中舉例說明，它將保持在5.5和6.5，優(yōu)先地固定在pH值6。pH可以通過本領域普通技術(shù)人員所熟知的任何手段進行調(diào)整，例如通過添加2N硫酸，然后添加8N氫氧化鈉。
[0098]最后，溶解氧量可以在值為20%和0%之間進行調(diào)整，優(yōu)選地保持在5%持續(xù)24和48小時之間的一個初始時期,優(yōu)選地36小時,然后在0%保持。此外,關(guān)于氧傳輸,將通過本領域普通技術(shù)人員熟知的任何手段進行調(diào)整以使其不超過45mmol/l/小時。
[0099]根據(jù)本發(fā)明的方法，從發(fā)酵罐提取的生物質(zhì)將通過本領域普通技術(shù)人員熟知的任何手段進行處理以達到純度高于95%，表達為相比發(fā)酵介質(zhì)總干重的生物質(zhì)干重。
[0100]有利的是，本申請公司建議經(jīng)由連續(xù)的生物質(zhì)濃縮(通過離心)/稀釋將間質(zhì)可溶物質(zhì)進行洗滌，如將在下文中舉例說明。
[0101]這種間質(zhì)可溶物質(zhì)純化的生物質(zhì)然后優(yōu)先地調(diào)整為6%和12%之間的干物質(zhì)含量，優(yōu)選地調(diào)整至10%和12%之間的干物質(zhì)含量,使用去礦物質(zhì)水或純水,優(yōu)選地純水。
[0102]根據(jù)本發(fā)明的方法的第二步驟在于使用選自中性或堿性蛋白酶的組的蛋白酶(例如枯草桿菌蛋白酶)對產(chǎn)生的生物質(zhì)進行處理，以破壞所述微藻的細胞壁同時阻止由所述酶處理產(chǎn)生的乳液形成。
[0103]作為酶裂解細胞壁這個步驟的開始，將具有12%干物質(zhì)含量的生物質(zhì)放置在裝配有螺旋槳攪拌器(低剪應力)和擋板(為了破壞產(chǎn)生的渦旋作用)的反應器中，以此限制由酶處理產(chǎn)生的細胞裂解產(chǎn)物的乳化作用，同時能夠均勻的混合促進水解酶的作用。
[0104]溫度調(diào)整至50°C以上，優(yōu)選地大約60°C，并將pH調(diào)整至7以上，優(yōu)選地大約為8。在本申請中，術(shù)語“大約”意為表示的值±10%所述值，優(yōu)選地±5%所述值。當然包括精確值。例如，大約地100意為90和110之間，優(yōu)選地95和105之間。
[0105]這些條件對于枯草桿菌蛋白酶(例如由諾維信公司(Novozymes)出售的一種)的活性是最優(yōu)的，該蛋白酶在濃度為按干重計0.4%和1%之間,優(yōu)選地按干重計1%使用。
[0106]裂解作用的持續(xù)時間在2h和8h之間，優(yōu)選地4h。
[0107]裂解作用結(jié)束時，本申請公司建議以高于5%(v/v)，優(yōu)選地大約10%(v/v)將乙醇添加至該反應混合物(水包油乳液形式)并且進一步攪拌15分鐘。[0108]將乙醇作為乳液-去穩(wěn)定劑以較小比例添加至該系統(tǒng)。
[0109]根據(jù)本發(fā)明的方法的第三步驟在于將產(chǎn)生的反應混合物進行離心以將油與水相分離。
[0110]在前述步驟結(jié)束時將獲得的乙醇-去穩(wěn)定乳液進行離心。
[0111]獲得了二相:
[0112]-較上輕相(油)，
[0113]-主要的水性中間體相(水+水-可溶物質(zhì))，和
[0114]-較下相(細胞碎片沉淀物)。
[0115]這三相的分離是使用濃縮器模式的三輸出分離器裝置進行的，例如由阿法拉伐公司(Alfa Laval)出售的Clara20，這允許從水相和從細胞碎片提取的較上輕相(油)的回收。
[0116]對于水相，就其本身而言，經(jīng)由分離器的重相輸出來提取。固相經(jīng)由自凈作用提取。
[0117]在根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟2結(jié)束時獲得的細胞裂解產(chǎn)物可以加熱至70°C和90°C之間的溫度，特別地70°C和80°C之間并且優(yōu)選地80°C，并且然后使用正排量泵進行輸送(以在此進一步限制乳化作用)。優(yōu)選地，它的pH可以調(diào)整至8和12之間的值，優(yōu)選地值為10。
[0118]離心力高于4000g，優(yōu)選地在6000g和1000Og之間。
[0119]優(yōu)選地非乳化`輕相以單程獲得。
[0120]最后，根據(jù)本發(fā)明的方法的第四步驟在于回收富集角鯊烯的較上油相。
[0121]本發(fā)明將通過以下實例更清楚地被理解，這些實例意為說明性的和非限制性的。
[0122]實例I
[0123]在實際培養(yǎng)/生產(chǎn)階段之前在此以兩個連續(xù)的預培養(yǎng)階段進行微藻的發(fā)酵。
[0124]對于這個實驗，將維生素添加至第一預培養(yǎng)基，但是將其添加至第二預培養(yǎng)基以及在生產(chǎn)中添加是可任選的。
[0125]預培養(yǎng)介質(zhì)因此具有在下表1和II中給出的組合物:
[0126]表1
[0127]
【權(quán)利要求】
1.一種方法，該方法用于在不存在有機溶劑下提取通過使屬于破囊壺菌目物種家族的微藻發(fā)酵產(chǎn)生的角鯊烯，其特征在于包括以下步驟: 1)制備屬于破囊壺菌目家族的微藻的生物質(zhì)以減少間質(zhì)可溶物質(zhì)的濃度，并且因此達到30%和99%之間的純度，優(yōu)選地高于95%，表達為相比發(fā)酵介質(zhì)總干重的生物質(zhì)干重， 2)將產(chǎn)生的生物質(zhì)使用一種蛋白酶進行處理，該蛋白酶選自中性或堿性蛋白酶的組，例如枯草桿菌蛋白酶，以破壞所述微藻的細胞壁同時阻止由所述酶處理產(chǎn)生的乳液形成， 3)將產(chǎn)生的反應混合物進行離心以將油與水相分離，并且 4)回收由此產(chǎn)生的富集角鯊烯的粗制油。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于將在步驟I)中純化的生物質(zhì)然后優(yōu)先地調(diào)整至6%和12%之間的干物質(zhì)含量，優(yōu)選地至10%和12%之間的干物質(zhì)含量。
3.如權(quán)利要求1和權(quán)利要求2中任何一項所述的方法，其特征在于在配備有螺旋槳攪拌器和擋板的裝置中伴隨非剪切、弱乳化攪拌地進行步驟2)的酶處理。
4.如權(quán)利要求1至3中任何一項所述的方法，其特征在于步驟2)的酶處理在高于50°C的溫度，優(yōu)選地在大約60°C，并且在高于7的pH，優(yōu)選地在大約8進行。
5.如權(quán)利要求1至4中任何一項所述的方法，其特征在于在酶處理結(jié)束時添加多于5%(v/v),優(yōu)選地大約10%(v/v)的乙醇。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于該乙醇處理伴隨攪拌地進行多于10分鐘，優(yōu)選地多于15分鐘。
7.如權(quán)利要求1至6中任何一項所述的方法，其特征在于離心之前該反應混合物在70 0C和90 0C之間的溫度，優(yōu)選地80 0C，并且可以使它的pH至8和12之間的值，優(yōu)選地至10的值。
8.如權(quán)利要求1至7中任何一項所述的方法，其特征在于該離心在濃縮器模式的三輸出分離器中進行，該分離器允許回收從水相及細胞碎片提取的較上輕相(油)。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于該離心使用大于4000g，優(yōu)選地6000g和1000Og之間，優(yōu)選地大約1000Og的離心力進行。
【文檔編號】C11B1/02GK103608459SQ201280025846
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2012年5月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月27日
【發(fā)明者】塞繆爾·帕蒂尼爾 申請人:羅蓋特兄弟公司