專利名稱：從甘蔗的嫩葉中提取過氧化物酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶的制備技術(shù)，尤其涉及過氧化物酶的提取。過氧化物酶，英文簡稱POD，其催化的反應(yīng)為，這類酶以鐵啉為輔基，在生物界廣泛存在，在細(xì)胞代謝大氧化還原過程中起重要的作用。
隨著酶標(biāo)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，特別在醫(yī)院中作為常規(guī)手段檢測(cè)抗原、抗體而大使量用。作為標(biāo)記酶，過氧化物酶是目前使用最普遍地一種酶。它的標(biāo)記物既能用于定位檢測(cè)，也能用于定量測(cè)定，因此分離制備過氧化物酶意義重大。
以往人們多從辣根中提取過氧化物酶，作為原料要專門種植辣根，辣根作為非種植植物，原料來源受到一定限制，需要專門大量的種植，成本投資大。而本發(fā)明的原料則是甘蔗生產(chǎn)中的廢棄物——甘蔗嫩葉，原料來源廣泛而廉價(jià)，可作為甘蔗生產(chǎn)中的副產(chǎn)品來提高農(nóng)民的收入。另外，生產(chǎn)過程中的廢水含有大量N、P、K可作為肥料還田。
本發(fā)明目的提供一種從甘蔗嫩葉中提取過氧化物酶的方法，更好地解決甘蔗生產(chǎn)過程中副產(chǎn)品的利用以及克服以辣根生產(chǎn)過氧化物酶的原料來源困難之不足。
本發(fā)明以甘蔗嫩葉為原料，原料清潔后，加入預(yù)冷4℃的0.05mol/LpH＝7.0磷酸鉀抽提液勻漿抽提。原料與抽提液的比例為1∶2(重量與體積比)，勻漿后過濾，棄去濾渣，取濾液，于濾液中加入固體硫酸銨，邊加邊攪拌至飽和度達(dá)40％，置0-4℃下靜置后以4000rpm離心。棄沉淀得清液，在清液中再加入固體硫酸銨，邊加邊攪拌至飽和度達(dá)80％，置0-4℃下靜置后以4000rpm離心。棄清液，得沉淀物，沉淀物即為粗酶；于粗酶中加入4℃的0.05mol/L pH＝7.0磷酸鉀緩沖液，粗酶與緩沖液加入量的比例為1-2∶50(g/v)，裝入透析袋中，放入重蒸餾水在4℃下透析直至硫酸銨透析完畢為止。透析后于4000rpm離心，棄沉淀，所得的上清液置于冰浴中，不斷攪拌，慢慢加入1倍體積預(yù)冷至-15℃乙醇溶液，靜置后4000rpm離心，棄去沉淀，于上清液再加入原上清液的1倍體積-15℃乙醇溶液，靜置后4000rpm離心，收集沉淀，將沉淀溶于預(yù)冷4℃的0.05mol/L pH＝7.0磷酸鉀緩沖液中，在重蒸餾水中透析除去乙醇?？傻玫絉2值近于1的酶溶液；將酶溶液經(jīng)Sephadex G-100層析柱層析，用pH6.8 0.02mol/L磷酸鉀緩沖液洗脫，自動(dòng)部分收集器收集，恒流泵恒流，收集呈酶活性的洗脫液，將洗脫液在4℃下超濾，凍干，即為純酶制劑。
本發(fā)明是這樣實(shí)施的1、原料勻漿稱取甘蔗嫩葉1000g，洗凈、涼干。加入預(yù)冷4℃的0.05mol/L pH＝7.0磷酸鉀抽提液2000mL，勻漿，勻漿后用140目尼龍布過濾，棄去殘?jiān)?，得濾液。2、酶的制備于上述濾液中慢慢加入固體硫酸銨，邊加邊攪拌至飽和度達(dá)40％置0-4℃下放置過夜，次日在常溫下，以4000rpm離心15min，棄沉淀，得上清液。在上清液中再加入固體硫酸銨，邊加邊攪拌至飽和度達(dá)80％，置0-4℃下放置過夜，以4000rpm離心20min，棄上清液，得沉淀，此沉淀即為粗酶。3、乙醇分級(jí)分離向16.3g粗酶中加入100mL預(yù)冷4℃的0.05mol/L pH7.0磷酸鉀緩沖液，將溶液于透析袋中，放入重蒸餾水中于4℃下透析48小時(shí)。直至硫酸銨透析完畢為止(可用5％乙酸鋇溶液檢查)，透析在4℃下進(jìn)行，將透析袋中液體倒出，4000rpm離心15min，棄沉淀，得上清液。將上清液倒入燒杯并置于冰浴中，在不斷攪拌下慢慢加入1倍原上清液體積的-15℃乙醇溶液，放置20min，4000rpm離心20min，收集沉淀，將沉淀溶于20mL 0.05mol/L pH7.0磷酸鉀緩沖液中，在重蒸餾水中透析除去乙醇，可得R2值近于1的酶溶液(R2值表明酶的純度，R2＝O.D403nm/O.D275.nm)。4、葡聚糖凝膠G-100柱層析將上述酶液進(jìn)行濃縮，將上述酶液經(jīng)葡聚糖凝膠G-100層析柱層析，層析柱規(guī)格為2×40cm。用pH6.8 0.02mol/l磷酸鉀緩沖液洗脫，自動(dòng)部分收集器收集，恒流泵恒流，每管5mL，收集呈酶活性的洗脫液，將洗脫液在4℃下超濾，凍干即為純酶制劑。5、酶活性及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法酶活性測(cè)定方法測(cè)定前將酶液稀釋300-500倍，吸1mL酶液，加入2mL聯(lián)苯銨醇的醇的鈉緩沖液(在200mL容量瓶中，先加入2/3重蒸餾水及2.3mL冰乙酸和184mg聯(lián)苯銨，在50-60℃水浴中加熱溶解，然后加入5.45g無水醇的鈉。待完全溶解后，冷卻，定容)，在28-32℃水浴中保溫5min，測(cè)定時(shí)，加入1mL 0.1mol/LH2O2，立即搖勻，并轉(zhuǎn)入比色皿中，用分光光度計(jì)在波長580nm下測(cè)定光密度的變化。以加入過氧化氫起計(jì)時(shí)，每15秒鐘讀數(shù)一次。E＝(O.D45秒-O.D15秒)×2×稀釋倍數(shù)/1000酶活單位為O.D/ng蛋白×min蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法按考馬斯亮藍(lán)G-250法。
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)；1、料來源廣泛，廉價(jià)；2、生產(chǎn)的廢水中含有豐富的N、P、K元素，可作為化學(xué)肥料，對(duì)土壤無副作用，無環(huán)境污染；投資少，效益大，每10萬元投入可生產(chǎn)出100萬元的酶產(chǎn)品。
3、資少，效益大，每10萬元投入可生產(chǎn)出100多萬元的酶產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1.從甘蔗的嫩葉中提取過氧化物酶的方法，其特征在于以甘蔗嫩葉為原料，原料清潔后，加入預(yù)冷4℃的0.05mol/L pH＝7.0磷酸鉀抽提液勻漿抽提；原料與抽提液的比例為1∶2(重量與體積比)，勻漿后過濾，棄去濾渣，取濾液，于濾液中加入固體硫酸銨，邊加邊攪拌至飽和度達(dá)40％，置0-4℃下靜置后以4000rpm離心；棄沉淀得清液，在清液中再加入固體硫酸銨，邊加邊攪拌至飽和度達(dá)80％，置0-4℃下靜置后以4000rpm離心；棄清液，得沉淀物，沉淀物即為粗酶；于粗酶中加入4℃的0.05mol/L pH＝7.0磷酸鉀緩沖液，粗酶與緩沖液加入量的比例為1-2∶50(g/v)，裝入透析袋中，放入重蒸餾水在4℃下透析直至硫酸銨透析完畢為止；透析后于4000rpm離心，棄沉淀，所得的上清液置于冰浴中，不斷攪拌，慢慢加入1倍體積預(yù)冷至-15℃乙醇溶液，靜置后4000rpm離心，棄去沉淀，于上清液再加入原上清液的1倍體積-15℃乙醇溶液，靜置后4000rpm離心，收集沉淀，將沉淀溶于預(yù)冷4℃的0.05mol/L pH＝7.0磷酸鉀緩沖液中，在重蒸餾水中透析除去乙醇?？傻玫絉2值近于1的酶溶液；將酶溶液經(jīng)Sephadex G-100層析柱層析，用pH6.8 0.02mol/L磷酸鉀緩沖液洗脫，自動(dòng)部分收集器收集，恒流泵恒流，收集呈酶活性的洗脫液，將洗脫液在4℃下超濾，凍干，即為純酶制劑。
全文摘要
過氧化物酶(POD)提取方法,以甘蔗嫩葉為原料,以預(yù)冷的磷酸鉀緩沖液勻漿、過濾,上清液用硫酸銨分級(jí)分離,凍干成粗酶。用預(yù)冷的磷酸鉀緩沖液溶解沉淀并對(duì)重蒸餾水透析,離心,上清液用－15℃酒精沉淀,靜置后,在冰凍離心機(jī)中離心收集沉淀,將沉淀溶于少量緩沖溶液中,透析除酒精。透析液經(jīng)Sephadex G－100柱層析、洗脫液濃縮,可得部分純酶。本方法可生產(chǎn)出R2=3的高純度的過氧化物酶,作為標(biāo)記酶使用。原料來源廣、廉價(jià)。
文檔編號(hào)C12N9/08GK1369557SQ02114970
公開日2002年9月18日 申請(qǐng)日期2002年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月18日
發(fā)明者何平, 傅雪琳, 高向陽, 徐鳳彩 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)