專利名稱：具有減少量的角鯊烯的流感疫苗的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于保護不受流感病毒感染的疫苗領域，尤其是所含角鯊烯含量相對于市售疫苗減少的疫苗領域。
背景技術：
除PREPANDRIX 產(chǎn)品(格蘭素史克公司(GlaxoSmithKline))和 FLUAD 產(chǎn)品(諾華疫苗公司)外，流感疫苗通常不含有佐劑。大流行前季節(jié)性單價PREPANDRIX 疫苗中的佐劑是一種水包油乳液。其抗原和乳液佐劑提供于分開的10劑小瓶中，在使用時以1 1的體積比混合。該產(chǎn)品的數(shù)據(jù)表顯示每一劑的體積為0. 5mL，含有3. 75 μ g HA以及10. 68mg角鯊烯和4. 85mg聚山梨醇酯80。三價季節(jié)性FLUAD 疫苗中的佐劑是一種水包油乳液。其抗原和乳液佐劑以預混合的形式提供于預填充的注射器中。該產(chǎn)品的數(shù)據(jù)表顯示每劑的體積為0. 5mL，含有15 μ g 血凝素(HA)/每株，以及9.75mg角鯊烯和1. 175mg聚山梨醇酯80。如參考文獻1所揭示， 通過混合體積比為1 1的2X乳液和2X抗原溶液、以獲得乳液和抗原都為IX濃度的最終溶液而制備該疫苗。該1 1混合比例在參考文獻75的第10章中有進一步的解釋。參考文獻2揭示了這種混合的改動形式。與FLUAD 產(chǎn)品相比，參考文獻3公開了具有較低量的HA (3 X 5 μ g HA/劑)和較低量的角鯊烯(5.35mg/劑)的三價流感疫苗。該疫苗含有硫柳汞防腐劑，并以0.5mL劑量
給予人。本發(fā)明的一個目的是提供進一步改進的佐劑化的流感疫苗制劑，尤其是季節(jié)性流
感疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種流感病毒疫苗，含有(i)獲自至少一種甲型流感病毒株和至少一種乙型流感病毒株的血凝素，其中，所述血凝素的濃度為每株 ^ 12ug/ml ；和(ii)具有亞微米油滴的水包油乳液佐劑，其含有角鯊烯，其中，角鯊烯濃度為 < 19mg/ml。在另一實施方式中，本發(fā)明提供一種無汞的流感病毒疫苗，含有(i)獲自至少一種甲型流感病毒株和至少一種乙型流感病毒株的血凝素；和(ii)具有亞微米油滴的水包油乳液佐劑，其含有角鯊烯，其中，角鯊烯濃度為彡19mg/ml。在另一實施方式中，本發(fā)明提供一種流感病毒疫苗，該疫苗具有0. 2-0. 3mL的單位劑量體積，該疫苗含有(i)獲自至少一種甲型流感病毒株和至少一種乙型流感病毒株的血凝素；和(ii)具有亞微米油滴的水包油乳液佐劑，其含有角鯊烯，其中，角鯊烯濃度為
4≤ 19mg/ml。在另一實施方式中，本發(fā)明提供一種流感病毒疫苗，該疫苗含有(i)獲自至少一種甲型流感病毒株和至少一種乙型流感病毒株的血凝素；和(ii)具有亞微米油滴的水包油乳液佐劑，其含有角鯊烯，其中，角鯊烯濃度為9. 75mg/ml或4. 88mg/ml。在另一實施方式中，本發(fā)明提供一種流感病毒疫苗，該疫苗具有0. 2-0. 3mL的單位劑量體積，該疫苗含有(i)獲自至少一種甲型流感病毒株和至少一種乙型流感病毒株的血凝素；和(ii)具有亞微米油滴的水包油乳液佐劑，其含有角鯊烯，其中，角鯊烯濃度為 19. 5mg/ml、9. 75mg/ml 或 4. 88mg/ml。在另一實施方式中，本發(fā)明提供一種流感病毒疫苗，含有(i)獲自至少兩種甲型流感病毒株和至少兩種乙型流感病毒株的血凝素；和(ii)具有亞微米油滴的水包油乳液佐劑，其含有角鯊烯，其中，角鯊烯濃度為彡19mg/ml。疫苗制備目前可獲得各種形式的流感病毒，疫苗通?；诨畈《净驕缁畈《?。滅活病毒可以基于完整的病毒、裂解的病毒粒子或純化的表面抗原。流感抗原還可以病毒體的形式提供。本發(fā)明可使用任何這些類型的疫苗，但通常使用滅活疫苗。在使用滅活病毒時，疫苗可含有完整的病毒粒子，裂解的病毒粒子，或純化的表面抗原(包括血凝素，通常還包括神經(jīng)氨酸酶)。滅活病毒的化學方法包括用有效量的一種或多種以下試劑處理去污劑、甲醛、β-丙內(nèi)酯、亞甲基藍、補骨脂素、羧基富勒烯(C60)、二元乙胺(binary ethylamine)、乙酰基乙亞胺或它們的組合。滅活病毒的非化學方法是本領域已知的，例如UV光或γ照射。可通過各種方法從含病毒的液體中收集病毒粒子。例如，純化方法可包括利用線性蔗糖梯度溶液的區(qū)帶離心，所述蔗糖溶液含有去污劑以使病毒粒子破裂。任選稀釋后，可通過滲濾純化抗原。用去污劑(例如，乙醚、聚山梨醇酯80、脫氧膽酸鹽、磷酸三-N-丁酯、曲通 X-100、曲通N101、溴化十六烷基三甲銨、Tergitol NP9，等等)處理純化的病毒粒子，包括“吐溫-醚”裂解方法來產(chǎn)生亞病毒粒子制品，從而獲得了裂解的病毒粒子。本領域熟知裂解流感病毒的方法，例如參見參考文獻4-9等。通常利用破裂濃度(disrupting concentration)的裂解劑(splitting agent)使感染性或非感染性的完整病毒破裂或破碎來進行病毒的裂解。破裂造成病毒蛋白質完全或部分溶解，改變病毒的完整性。優(yōu)選的裂解劑是非離子和離子性(例如，陽離子)表面活性劑，例如烷基糖苷、烷基硫代糖苷、?；?、磺基甜菜堿、甜菜堿、聚氧乙烯烷基醚、N，N-二烷基-葡糖酰胺(Glucamides)、?？他湼?Hecameg)、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、季銨化合物、十二烷基肌氨酸鈉(sarcosyl)、 CTAB (溴化十六烷基三甲銨)、磷酸三-N- 丁酯、塞太弗倫(Cetavlon)、肉豆蔻基三甲基銨鹽、脂轉染試劑(Iipofectin)、脂轉染胺(lipofectamine)、和D0T-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如，曲通表面活性劑，如曲通X-100或曲通附01)、聚氧乙烯失水山梨糖醇酯(吐溫表面活性劑)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一種有用的裂解方法利用脫氧膽酸鈉和甲醛的連續(xù)作用，裂解可發(fā)生在最初的病毒粒子純化期間(例如，在蔗糖密度梯度溶液中)。因此裂解方法可包括使含病毒粒子的物質澄清(以除去非病毒粒子物質)，濃縮收集的病毒粒子(例如，采用吸附法，如CaHPO4吸附)，分離完整病毒粒子與非病毒粒子物質，在
5密度梯度離心步驟中利用裂解劑裂解病毒粒子(例如，利用含有裂解劑(如脫氧膽酸鈉) 的蔗糖梯度)，然后過濾(例如，超濾)以除去不需要的物質。可將裂解的病毒粒子有用地重懸在磷酸鈉緩沖的等滲氯化鈉溶液中。PREPANDRIX 、BEGRIVAC 、FLUARIX 、FLUZ0NE 和FLUSHIELD 產(chǎn)品是裂解疫苗。純化的表面抗原疫苗包含流感表面抗原血凝素，通常還包含神經(jīng)氨酸酶。本領域熟知制備純化形式的這些蛋白質的方法。FLUWRIN 、FLUAD 、AGRIPPAL 和INFLUVAC 產(chǎn)品是這些疫苗的例子。滅活的流感抗原的另一種形式是病毒體[10](不含核酸的病毒樣脂質體顆粒)， 如INFLEXAL V 和INVAVAC 產(chǎn)品中的形式。可使用去污劑溶解流感病毒、接著除去核殼體和重構含有病毒糖蛋白的膜而制備病毒體。制備病毒體的另一種方法涉及將病毒的膜糖蛋白加到過量的磷脂中，以產(chǎn)生其膜中具有病毒蛋白的脂質體。毒株選擇本發(fā)明的疫苗包括獲自至少一種甲型流感病毒株和至少一種乙型流感病毒株的血凝素。通常使不同株分開生長，然后在收集病毒和制備抗原后混合。因此，本發(fā)明的方法可包括混合來自一種以上流感株的抗原的步驟。本發(fā)明使用的毒株可具有野生型病毒中發(fā)現(xiàn)的天然HA，或改性HA。例如，已知可改變HA，以除去使病毒對禽類高度致病的決定簇(如HA1/HA2裂解位點附近的超堿性區(qū)域)。用于本發(fā)明的乙型流感病毒的血凝素優(yōu)選在氨基酸197具有Asn，以提供糖基化位點 [11]。本發(fā)明使用的流感病毒可以是重配毒株，并可通過反向遺傳學技術獲得。反向遺傳學技術[例如，12-16]能利用質粒或其它人工載體在體外制備含所需基因組區(qū)段的流感病毒。該技術通常涉及表達(a)例如能從poll啟動子或噬菌體RNA聚合酶啟動子編碼所需病毒RNA分子的DNA分子，和(b)例如能從polll啟動子編碼病毒蛋白質的DNA分子，從而使得在細胞中表達兩種類型的DNA能裝配完整的感染性病毒粒子。DNA優(yōu)選能提供所有病毒RNA和蛋白質，但也可利用輔助病毒提供所述RNA和蛋白質中的一些?？墒褂美脝为毜馁|粒制備各病毒RNA的基于質粒的方法[17-19]，且這些方法也將涉及使用質粒來表達所有或一些(如僅僅PB1、PB2、PA和NP蛋白)病毒蛋白，一些方法利用高達12種質粒。 為減少所需的質粒數(shù)，一種方法[20]在同一質粒上組合了多個RNA聚合酶I轉錄盒(用于病毒RNA合成)(例如，編碼1、2、3、4、5、6、7或所有8個甲型流感vRNA區(qū)段的序列)，在另一質粒上組合了含RNA聚合酶II啟動子的多個蛋白質編碼區(qū)(例如，編碼1、2、3、4、5、6、 7或所有8個甲型流感mRNA轉錄物的序列)。參考文獻20所述方法的優(yōu)選方面包括(a) 一個質粒上的PB1、PB2和PA mRNA編碼區(qū)；和(b) —個質粒上的所有8個vRNA編碼區(qū)段。 在一個質粒上包含NA和HA區(qū)段和在另一質粒上包含6個其它區(qū)段也是有利的。作為使用poll啟動子編碼病毒RNA區(qū)段的替代方式，還可能用細菌噬菌體聚合酶啟動子[21]。例如，可方便地使用SP6、T3或T7聚合酶的啟動子。由于poll啟動子的種屬特異性，噬菌體聚合酶啟動子對于許多細胞類型(例如，MDCK)更方便，雖然還必須用編碼外源性聚合酶的質粒轉染細胞。在其它技術中，可采用雙重poll和polll啟動子來同時編碼來自一個模板的病毒 RNA和可表達的mRNA [22，23]。
因此，甲型流感病毒可包含來自A/PR/8/34病毒的一個或多個RNA區(qū)段(通常是 A/PR/8/34的6個區(qū)段，其中HA和N區(qū)段來自疫苗毒株，即6 2重配株)。還可包含A/WSN/33 病毒或用于生產(chǎn)疫苗制備用重配病毒的任何其它病毒毒株的一個或多個RNA區(qū)段。甲型流感病毒可包括少于6個(即0、1、2、3、4或5個)來自AA/6/60流感病毒的病毒區(qū)段(A/Arm Arbor/6/60) 0乙型流感病毒可包括少于6個(即0、1、2、3、4或5個)來自AA/1/66流感病毒的病毒區(qū)段(B/Arm Arbor/1/66)。通常，本發(fā)明抵御能人向人傳播的毒株，因此該毒株的基因組一般包含源自哺乳動物(例如人)流感病毒的至少一個RNA區(qū)段。其可包含源自禽流感病毒的NS區(qū)段。其抗原可包含在組合物中的毒株可對抗病毒治療具有耐受性(如耐奧司他韋 [24]和/或耐扎那米韋)，包括耐藥性流行性毒株[25]。特別有用的毒株是那些從分離自患者開始到在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中復制這一過程中的任何階段(包括分離和在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中復制)都未通過雞蛋傳代的毒株?？稍诜蛛x到病毒復制過程中的所有步驟中都只用MDCK細胞。在一些實施方式中，本發(fā)明使用的毒株的血凝素相對于具有Sia(a 2，3)Gal末端二糖的寡糖而言對具有Sia(α 2，6)Gal末端二糖的寡糖具有結合偏好。人流感病毒結合具有Sia(a 2，6)Gal (唾液酸以α 2，6方式連接于半乳糖)末端二糖的受體寡糖，而雞蛋和 Vero細胞的受體寡糖具有Sia (α 2，3) Gal末端二糖。人流感病毒在細胞如MDCK中的生長提供了針對血凝素的選擇壓力，以維持天然的Sia(a 2，6)Gal結合，這與雞蛋傳代不同。為了測定病毒是否相對于具有Sia(a 2，3)Gal末端二糖的寡糖對具有Sia(a 2， 6)Gal末端二糖的寡糖具有結合偏好，可進行各種檢測。例如，參考文獻沈描述了一種檢測流感病毒受體-結合活性的固相酶聯(lián)檢測，該檢測提供敏感和定量的親和常數(shù)測量值。 參考文獻27使用固相檢測，其評估了病毒對兩種不同的唾液酸基糖蛋白的結合(卵類粘蛋白，具有Sia ( α 2，3) Gal決定簇；和豬α 2_巨球蛋白，具有Sia ( α 2，3) Gal決定簇)，該文獻還描述了評估病毒對兩種受體類似物游離唾液酸(Neu5Ac)和3’ -唾液酸基乳糖 (Neu5Aca2-3Gal^l-4Glc)的結合的檢測。參考文獻觀報道了一種使用能清楚區(qū)分針對 α 2，3或α 2，6連接的受體偏好的聚糖陣列的檢測。參考文獻四報道了一種基于人紅血球的凝集的檢測，該人紅血球經(jīng)酶學修飾成含有Sia ( α 2，6) Gal或Sia ( α 2，3) Gal。依賴于檢測的類型，檢測可直接使用病毒自身，或可間接使用由病毒純化得到的血凝素。在一些實施方式中，本發(fā)明使用的流感毒株具有其糖基化模式不同于雞蛋衍生的病毒的糖基化模式的糖蛋白(包括血凝素)。因此，糖蛋白將包括在雞蛋中未發(fā)現(xiàn)的糖形。甲型流感病毒目前具有16 種 HA 亞型:Η1、Η2、Η3、Η4、Η5、Η6、Η7、Η8、Η9、Η10、Η11、 Η12、Η13、Η14、Η15和Η16。本發(fā)明可抵御一種或多種這些亞型。本發(fā)明可抵御甲型流感病毒NA亞型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和Ν9中的一種或多種。本文的疫苗包括來自至少一種甲型流感病毒株的抗原，且通常將包括來自至少兩種甲型流感病毒株(如2或3種甲型流感病毒株)的抗原。當包括兩種甲型流感病毒株時，這些病毒株通常將是Hl株和Η3 株。當包括三種甲型流感病毒株時，這些病毒株將是Hl株、Η3株和大流行相關的毒株。在一些實施方式中，Η3毒株與A/Moscow/10/99交叉反應；在其它實施方式中，H3毒株與A/ Fujian/411/2002交叉反應。參考文獻30公開了含有A/Hmi、A/H3N2、A/H5m和B抗原的疫苗。
大流行相關流感毒株的特征如下(a)具有與目前常見人毒株的血凝素相比新的血凝素，即在過去10年以上的時間內(nèi)在人群中未出現(xiàn)過(例如，H2)，或者以前在人群中從未發(fā)現(xiàn)(例如，通常只在鳥類中發(fā)現(xiàn)的H5、H6或H9)，因此，疫苗受體和普通人群對該毒株的血凝素沒有免疫力；(b)能夠在人群中水平傳播；以及(c)對人致病。用于本發(fā)明的大流行相關的毒株通常具有H2、H5、H7或H9亞型，如H5m、H5N3、H9N2、H2N2、H7m或H7N7株。優(yōu)選H5m毒株。大流行毒株可具有Hl亞型(如Hmi)，例如，HA可以與A/California/04/09 毒株具有免疫學交叉反應性。目前未發(fā)現(xiàn)乙型流感病毒具有不同的HA亞型，但是乙型流感病毒株確實可分為兩個不同的譜系。這兩譜系在上世紀80年代末期出現(xiàn)，含有抗原性和/或遺傳性彼此不同的HA[31]。目前的乙型流感病毒株是B/Victoria/2/87-樣的或者是B/Yamagata/16/88-樣的。這些毒株通常具有不同的抗原性，但是也已經(jīng)公開根據(jù)氨基酸序列差異來區(qū)分這兩個譜系，例如，B/Yamagata/16/88-樣毒株的HA蛋白通常(但不總是)在164位氨基酸殘基上缺失，這是以‘Lee40’ HA序列為基準的編號[32]。在一些實施方式中，本發(fā)明的組合物包含來自單種乙型流感病毒株的抗原，且該毒株可以是B/Victoria/2/87-樣的或者是B/Yamagata/16/88-樣的。但在其它實施方式中，本發(fā)明的組合物包含來自兩種乙型流感病毒株的抗原，且這兩種毒株通常包括B/ Victoria/2/87-樣毒株和 B/Yamagata/16/88-樣毒株。本發(fā)明的優(yōu)選疫苗含有來自兩種甲型流感病毒株的抗原和來自兩種乙型流感病毒株的抗體(“ABBA”疫苗)。因此，本發(fā)明優(yōu)選的ABBA疫苗含有來自(i)Hmi毒株；(ii) H3N2 毒株；(iii)B/Victoria/2/87-樣毒株；以及(iv)B/Yamagata/16/88-樣毒株的血凝
ο在一些ABBA實施方式中，至少兩株乙型流感病毒株可具有不同的血凝素但是具有相關的神經(jīng)氨酸酶。例如，兩者可都包含B/Victoria/2/87-樣神經(jīng)氨酸酶[33]，或者兩者都包含B/Yamagata/16/88-樣神經(jīng)氨酸酶。例如，兩種B/Victoria/2/87-樣神經(jīng)氨酸酶可以都包含一個或多個如下序列特征(1)27位殘基不是絲氨酸，優(yōu)選代之以亮氨酸； (2) 44位殘基不是谷氨酸，優(yōu)選代之以賴氨酸；(3) 46位殘基不是蘇氨酸，優(yōu)選代之以異亮氨酸；(4)51位殘基不是脯氨酸，優(yōu)選代之以絲氨酸；( 65位殘基不是精氨酸，優(yōu)選代之以組氨酸；(6) 70位殘基不是甘氨酸，優(yōu)選代之以谷氨酸；(7) 73位殘基不是亮氨酸，優(yōu)選代之以苯丙氨酸；和/或(8)88位殘基不是脯氨酸，優(yōu)選代之以谷氨酰胺。同樣，在某些實施方式中，神經(jīng)氨酸酶可在43位殘基上缺失，或可以是蘇氨酸；有報道稱，NA基因上的三核苷酸缺失造成的43位殘基的缺失是B/Victoria/2/87-樣毒株的特征，但最近的毒株又恢復了 Thr-43 [33]。相反，兩種B/Yamagata/16/88-樣神經(jīng)氨酸酶當然也可共有上述相反的特征， 例如，S27、E44、T46、P51、R65、G70、L73和/或P88。這些氨基酸的編號以‘Lee40，神經(jīng)氨酸酶序列為基準[34]。因此，ABBA疫苗可使用兩株HA抗原性不同(一株B/Yamagata/16/88-樣毒株，一株 B/Victoria/2/87-樣毒株)、但 NA 相關(兩種 B/Yamagata/16/88-樣 NA，或兩種B/Victoria/2/87-樣NA)的乙型流感病毒。本發(fā)明并不局限于三價和四價疫苗，還包括五價、六價、七價等疫苗。舉例來說，五價疫苗可包含三株甲型流感病毒(例如，一株Hl和兩株H3，如上所述)加上兩株乙型流感病毒。例如，A-A-A-B-B疫苗可包含來自于以下毒株的血凝素(i)Hmi毒株；(ii)A/Moscow/10/99-樣 H3N2 毒株；(iii)A/Fujian/411/2002-樣 H3N2 毒株；(iv) B/ Victoria/2/87-樣毒株；以及(v)B/Yamagata/16/88-樣毒株。另一種 A-A-A-B-B 疫苗可包含來自于如下毒株的血凝素(i)Hmi毒株；(ii)H3N2毒株；(iii)H5甲型流感毒株，如 H5m 毒株；(iv)B/Victoria/2/87-樣毒株；以及(v)B/Yamagata/16/88-樣毒株。 A-A-A-A-B疫苗可包含來自于如下毒株的血凝素(i)Hmi毒株；(ii)A/Moscow/10/99-樣 H3N2 毒株；(iii)A/Fujian/411/2002-樣 H3N2 毒株；(iv) H5 甲型流感毒株，如 H5m 毒株； 以及(ν)乙型流感毒株。A-A-A-A-B-B疫苗可包含來自于如下毒株的血凝素(i) Hmi毒株； (ii) A/Moscow/10/99-樣 H3N2 毒株；(iii) A/Fujian/411/2002-樣 H3N2 毒株；(iν) H5 甲型流感毒株，如 H5m 毒株；(v)B/Victoria/2/87-樣毒株；以及(vi) B/Yamagata/16/88-樣毒株。血凝素劑量血凝素(HA)是目前滅活流感疫苗的主要免疫原，通過參照一般由SRID測量的HA 水平來標準化疫苗劑量?，F(xiàn)有疫苗通常在0.5mL的劑量中含有約15yg HA/毒株，雖然例如對兒童(通常為0. 25mL的劑量，HA濃度相同)、或在大流行情況下、或在使用佐劑時可使用較低的劑量。已使用分劑量，例如1/2(即7. 5yg HA/毒株)、1/4和1/8，以及較高劑量 (如 3x 或 9x 劑量[35，36])。通常，每劑HA的量可以在0. 1-150 μ g/毒株的范圍內(nèi)，優(yōu)選0. 1_50μβ，例如 0. 1-20 μ g、0. 1-15 μ g、0. 1-10 μ g、0. 1-7/5 μ g、0. 5-5 μ g 等。具體劑量包括例如，約 45、約 30、約15、約10、約7. 5、約5、約3. 8、約1. 9、約1. 5 μ g/毒株等。在本發(fā)明的一些實施方式中，組合物中每毒株HA的濃度至少為12 μ g/ml (即在0. 5毫升的體積中每株至少6 μ g，這高于參考文獻3使用的濃度)。通常，該濃度將為彡15 μ g/ml，例如，彡20 μ g/ml、彡25 μ g/ ml、彡30 μ g/ml或更高。通常為每株15 μ g/ml或30 μ g/ml的濃度。通常，組合物中每株的HA濃度是相同的。但在一些實施方式中，該濃度將是最低濃度的整數(shù)倍。例如，某具體毒株的最低HA濃度是15 μ g/ml，那么組合物中其它HA濃度將是 15 μ g/ml、30 μ g/ml、45 μ g/ml 或 60 μ g/ml。如上所述，本發(fā)明通常使用滅活疫苗。但在一些實施方式中，可使用活疫苗。與基于HA含量進行標準化不同，活疫苗劑量通過中值組織培養(yǎng)感染劑量(TCID5tl)測定。通常使用每株IO6到108(優(yōu)選IO6 5-IO7 5)的TCID5tlt5流感病毒可被減毒。流感病毒可以是溫度敏感的。流感病毒可以是冷適應性的。細胞系用于本發(fā)明的疫苗的制備可使用SPF雞蛋作為底物進行病毒生長，其中從感染的母雞雞蛋的尿囊液收集病毒。但是，可使用支持流感病毒復制的細胞系取代雞蛋。細胞系通常是哺乳動物來源的。合適的哺乳動物來源細胞包括但不限于倉鼠、牛、靈長類(包括人和猴)和犬細胞，但靈長類動物細胞不是優(yōu)選的。可利用各種細胞類型，例如腎細胞、成纖維細胞、視網(wǎng)膜細胞、肺細胞等。合適的倉鼠細胞的例子是名為BHK21或HKCC的細胞系。 合適的猴細胞是，例如非洲綠猴細胞，例如腎細胞，如Vero細胞系[37-39]。合適的犬細胞是，例如腎細胞，如CLDK和MDCK細胞系。因此，合適的細胞系包括但不限于=MDCK ；CHO ；CLDK ；HKCC ；293T ；BHK ；Vero ； MRC-5 ；PER. C6[40] ；FI hL2 ;WI_38 ；等等。這些細胞系可廣泛獲自，例如美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCCK41]、寇里爾細胞保藏中心(Coriell Cell Repositories) [42]或歐洲細胞培養(yǎng)物保藏所(ECACC)。例如，ATCC 提供目錄號為 CCL-81、CCL-81. 2、CRL-1586 和 CRL-1587 的各種不同Vero細胞，目錄號為CCL-34的MDCK細胞。PER. C6可以保藏號9602^40獲自 ECACC0最優(yōu)選的細胞系是具有哺乳動物型糖基化的那些細胞系。作為哺乳動物細胞系的次優(yōu)替代，也可以用禽細胞系培養(yǎng)病毒[例如，參考文獻43-45]，這包括鴨細胞系(例如，鴨的視網(wǎng)膜)或雞細胞系。禽細胞系的例子包括禽胚胎干細胞[43，46]和鴨視網(wǎng)膜細胞W4]。 合適的禽胚胎干細胞包括來源于雞胚胎干細胞的EBx細胞系EB45、EB14和EB14-07M47]。 也可以使用雞胚胎成纖維細胞(CEF)。但是，與使用禽細胞不同，使用哺乳動物細胞意味著疫苗將不含禽類DNA和雞蛋蛋白(例如卵清蛋白和卵類粘蛋白)，由此可以降低過敏性。培養(yǎng)流感病毒最優(yōu)選的細胞系是MDCK細胞系[48-51]，該細胞系源于馬-達二氏(Madin-Dardy)犬腎。原始的MDCK細胞系可從ATCC獲得，編號為CCL-34，但也可以使用這個細胞系的衍生物和其它MDCK細胞系。例如，參考文獻48公開了一種適化后能在懸浮培養(yǎng)物中生長的MDCK細胞系(“MDCK 33016”，保藏編號為DSM ACC 2219)。同樣，參考文獻52公開了一種能在無血清培養(yǎng)物中懸浮生長的MDCK衍生的細胞系(“B-702”，保藏編號為FERM BP-7449)。參考文獻53公開了非致瘤性MDCK細胞，包括“MDCK-S”(ATCC PTA-6500)、“MDCK-SF101，，(ATCC PTA-6501)、"MDCK-SF102，，(ATCC PTA-6502)禾口 "MDCK-SF103” (PTA-6503)。參考文獻M公開了對感染高度易感的MDCK細胞系，包括 “MDCK. 5F1”細胞(ATCC CRL-12042)。這些MDCK細胞系都可以使用。病毒可以在貼壁培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)的細胞中生長。也可以采用微載體培養(yǎng)。在一些實施方式中，可改造細胞使其適應懸浮生長。優(yōu)選將細胞系培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)基和/或不含蛋白的培養(yǎng)基中。在本發(fā)明中稱某培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基表示，該培養(yǎng)基中不含來源于人或動物血清的添加物。在這種培養(yǎng)物中生長的細胞天然地包含其自身的蛋白質，但是不含蛋白的培養(yǎng)基應當被理解為這樣的培養(yǎng)基在沒有蛋白質、生長因子、其他蛋白添加物和非血清蛋白的情況下細胞能夠在其中繁殖(如，在感染前)，但是可選地包含如胰蛋白酶或可能為病毒生長所需的其他蛋白酶之類的蛋白。在病毒復制期間，支持病毒復制的細胞系以在37°C以下培養(yǎng)為佳[55](例如 30-36°C，或約 30°C、31°C、32°C、33°C、34°C、35°C、36°C )。在培養(yǎng)的細胞內(nèi)擴增流感病毒的方法通常包括用待生長的毒株接種物接種細胞培養(yǎng)物，將被感染的細胞培養(yǎng)一段所需時間來擴增病毒，例如根據(jù)病毒滴度或抗原表達情況確定培養(yǎng)時間(例如接種后M到168小時)，以及收集擴增的病毒。以1 500到1 1 的病毒(根據(jù)PFU或TCID5tl測定)細胞比接種培養(yǎng)的細胞，優(yōu)選1 100到1 5，更優(yōu)選1 50到1 10。將病毒加到細胞懸液中或細胞單層上，在25°C到40°C、優(yōu)選到 370C，讓病毒吸附到細胞上，歷時至少60分鐘，但是一般不超過300分鐘，優(yōu)選90到240分鐘。可通過凍融或通過酶作用分離感染的細胞培養(yǎng)物(例如細胞單層)，以增加收獲的培養(yǎng)物上清中的病毒含量。然后對收獲的液體進行滅活或凍存。培養(yǎng)細胞按約0.0001到10 的感染復數(shù)(“m.o. i. ”)感染，優(yōu)選約0.002到5，更優(yōu)選0.001到2。更優(yōu)選的是，細胞按約0.01的m. ο. i.感染?？稍诟腥竞?0到60小時收獲被感染的細胞。優(yōu)選在感染后34到48小時收獲細胞。更優(yōu)選在感染后38到40小時收獲細胞。通常在細胞培養(yǎng)期間添加蛋白酶(一般是胰蛋白酶)以使病毒釋放?？稍谂囵B(yǎng)期間任何合適的階段添加蛋白酶，例如，在接種前，在接種的同時或接種后[55]。在一些實施方式中，特別是采用MDCK細胞的實施方式中，細胞系從主工作細胞庫傳代的群體倍增水平不超過40。病毒接種物和病毒培養(yǎng)物最好不含(即，已檢測污染且污染檢測結果呈陰性)單純皰疹病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒3、SARS冠狀病毒、腺病毒、鼻病毒、呼腸孤病毒、 多瘤病毒、雙核糖核酸病毒、環(huán)狀構象病毒和/或細小病毒[56]。特別好的是不含單純皰疹病毒。宿主細胞DNA如病毒已在細胞系上生長，那么盡可能減少最后疫苗內(nèi)殘存細胞系DNA就是標準操作，這是為了盡可能消除該DNA的致瘤性。因此，根據(jù)本發(fā)明制備的疫苗組合物優(yōu)選每個劑量包含IOng以下(優(yōu)選Ing以下，更優(yōu)選IOOpg以下)的殘存宿主細胞DNA，但仍可能存在痕量的宿主細胞DNA。優(yōu)選的是包含< IOng(例如，< lng, < IOOpg)宿主細胞DNA/15 μ g血凝素的疫苗，以及包含< IOng(例如，< lng, < IOOpg)宿主細胞DNA/0. 25ml體積的疫苗。更好的是包含< IOng(例如，< lng, < IOOpg)宿主細胞DNA/50 μ g血凝素的疫苗，以及包含 < IOng (例如，< lng, < IOOpg)宿主細胞DNA/0. 5ml體積的疫苗。較好的是，任何殘存宿主細胞DNA的平均長度小于500bp，例如，小于400bp、小于 300bp、小于 200bp、小于 IOObp 等。污染性DNA可在疫苗制備過程中通過標準純化方法去除，例如，色譜法等。核酸酶處理，例如DNA酶處理，可提高殘存宿主細胞DNA的清除率。降低宿主細胞DNA污染的合適方法可見參考文獻57和58，包括兩步處理，第一步使用DNA酶(例如，Benzonase)，可在病毒生長期使用，然后用陽離子去污劑(例如，CTAB)，可在病毒粒子裂解過程中使用。也可以采用β-丙內(nèi)酯處理進行去除。測定殘存宿主細胞DNA現(xiàn)在是生物制品的常規(guī)法定要求，也是本領域技術人員常規(guī)技術之一。用于測定DNA的方法通常是經(jīng)驗證的實驗[59，60]。一項經(jīng)驗證的實驗其性能特征可以數(shù)學和定量術語來描述，其可能的誤差原因應是已知的。這樣的實驗通常已就諸如精度、準度、特異性等特征經(jīng)過了測試。待一項實驗經(jīng)過校準(例如，用已知標準量的宿主細胞DNA校準)并測試后，就可進行常規(guī)的定量DNA測定。有三種主要的DNA定量測定技術可以使用雜交方法，如DNA印跡(Southern Blots)或狹縫印跡(Slot Blots) [61]； 免疫測定方法，如Threshold 系統(tǒng)W2]；以及定量PCR[63]。這些方法都是本領域技術人員熟知的，但每一種方法的精準度可能與待測的宿主細胞有關，例如，雜交探針的選擇、擴增用的引物和/或探針的選擇等。Molecular Devices的Threshold 系統(tǒng)是一種可測定 Pg級總DNA的定量分析方法，已被用于檢測生物藥物的污染DNA水平W2]。典型的實驗包括生物素化的ssDNA結合蛋白、尿素酶結合的抗ssDNA抗體和DNA之間非序列特異性地形成反應復合物。所有檢測組分都包括在廠家生產(chǎn)的完整總DNA分析試劑盒內(nèi)。許多商業(yè)制造商都提供用于檢測殘存宿主細胞DNA的定量PCR實驗，例如AppTec 實驗室服務公司(AppTec Laboratory Services)、BR 公司(BioReliance )、阿爾泰技術公司(AltheaTechnologies)等。參考文獻64對用于測定人病毒疫苗內(nèi)宿主細胞DNA污染的化學發(fā)光雜交分析和總DNA Threshold 系統(tǒng)進行了比較。藥用組合物本發(fā)明使用的疫苗通常除流感病毒外還包含其它組分，如它們通常包含一種或多種藥用載體和/或賦形劑。有關這些組分的全面討論可參見參考文獻65。在許多實施方式中，還可包含佐劑。組合物在給藥時通常為水溶液形式。組合物可包含防腐劑，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。但在一些實施方式中，與 PREPANDRIX 產(chǎn)品不同，疫苗應基本上不含含汞物質，例如不含硫柳汞[8，66]。不含汞的疫苗是更優(yōu)選的。不含防腐劑的疫苗是特別優(yōu)選的。α-生育酚琥珀酸鹽可作為汞化合物的替代物[8]。特別優(yōu)選的是不含防腐劑的疫苗。為了控制滲透壓(tonicity)，優(yōu)選包含生理鹽，如鈉鹽。優(yōu)選氯化鈉(NaCl)，其濃度可為1到20mg/ml。其他可以使用的鹽包括氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉和/或氯化鎂等。在佐劑與抗原分開存在于不同容器時，氯化鈉可存在于兩個容器中。組合物的滲透壓通常為200m0sm/kg到400m0sm/kg，優(yōu)選M0-360m0sm/kg，更優(yōu)選 290-310m0sm/kgo本發(fā)明組合物可包含一種或多種緩沖劑。典型的緩沖劑包括磷酸鹽緩沖劑； Tris緩沖劑；硼酸鹽緩沖劑；琥珀酸鹽緩沖劑；組氨酸緩沖劑(特別是與氫氧化鋁佐劑一起)；或者檸檬酸鹽緩沖劑。緩沖劑的使用濃度一般為5-20mM。組合物的pH —般在5. 0到8. 1之間，更常見的是在6. 0到8. 0之間，例如6. 5-7. 5 或 7. 0-7.8。組合物最好是無菌的。組合物最好是無熱原的，例如，每劑EU(內(nèi)毒素單位，標準計量)< 1，每劑EU優(yōu)選<0.1。組合物優(yōu)選不含谷蛋白。本發(fā)明的組合物，特別是裂解疫苗或表面抗原疫苗，可包含去污劑，例如，聚氧乙烯脫水山梨酯表面活性劑(被稱為“吐溫”)、辛苯聚醇(如辛苯聚醇-9(曲通X-100)或叔辛基苯氧聚乙氧基乙醇)、溴化十六烷基三甲胺(“CTAB”)或脫氧膽酸鈉。去污劑可以只以痕量存在。因此，疫苗可包含含量各低于lmg/ml的辛苯聚醇-10和聚山梨醇酯80。其它痕量存在的殘留組分可以是抗生素(例如，新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。在佐劑與抗原分開保存在不同容器時，去污劑通常存在于含有抗原的容器中(如抗原與聚山梨醇酯80和辛苯聚醇-10在一起)。組合物可包含用于單次免疫的材料，或者包含用于多次免疫的材料(即，“多劑量” 藥盒)。多劑量組合物中優(yōu)選包含防腐劑。作為多劑量組合物包含防腐劑的替代手段，或者在包含防腐劑以外，可以將組合物裝在帶有用于取用材料的無菌接配器的容器內(nèi)。人流感病毒疫苗通常以約0. 5mL的單位劑量體積通過肌肉內(nèi)注射給藥。但在本發(fā)明的一些實施方式中，可使用該體積一半的單位劑量(即，約0.25ml)。此減少的劑量體積特別可給予兒童。還可使用更低的劑量(如0. Iml或0. 2ml)，例如用于皮內(nèi)注射。優(yōu)選將疫苗存放在2°C到8°C。它們不應被冷凍。理想的是避免光線直接照射?？梢愿鞣N合適的容器提供疫苗，疫苗可被配制成立即可用的，或者為給藥前臨時混合的試劑盒的一部分，如分開的抗原和佐劑組分(如PREPANDRIX 產(chǎn)品中的那樣)。合適的容器包括小瓶、注射器(如一次性注射器)、鼻噴霧器等。這些容器應無菌。如果將組合物/組分存于小瓶中，所述小瓶優(yōu)選由玻璃或塑料材料制成。優(yōu)選先將小瓶滅菌再加入組合物。為避免患者對乳膠過敏的問題，優(yōu)選用無乳膠的塞子密封小瓶，優(yōu)選所有包裝材料均不含乳膠。小瓶可裝有單劑量疫苗，或可裝有一劑量以上(“多劑量”小瓶)，例如10劑量。優(yōu)選用無色玻璃制成小瓶。小瓶可裝有蓋子(例如，Luer鎖扣)，該蓋子適于將注射器插入其中。小瓶，尤其是多劑量小瓶，可具有允許無菌取出其內(nèi)容物的蓋子。如果組分包裝在注射器中，注射器可裝有針頭。如果未裝針頭，可隨注射器提供單獨的針頭用于裝配和使用。這種針頭可以是有鞘的。優(yōu)選安全針頭。常見的是1英寸23號、1英寸25號和5/8 英寸25號針頭。注射器可裝有可剝離標簽，其上打印了批號、流感季節(jié)和內(nèi)含物的有效期， 從而有助于記錄保管。注射器的柱塞優(yōu)選具有限位器，從而能防止柱塞在抽吸期間意外掉出。注射器可裝有乳膠橡膠蓋子和/或柱塞。一次性注射器含有單劑量疫苗。在裝上針頭之前，注射器一般裝有針帽以密封頂端，所述針帽優(yōu)選由丁基橡膠制成?？山o容器做上顯示半劑量體積的標記，例如以有助于遞送給兒童。例如，含有 0. 5ml劑量的注射器可具有顯示0. 25ml體積的標記。因此，可以0. 5ml的單位劑量體積包裝疫苗，但疫苗可以0. 25ml的定量劑量體積給予，容器上的標記有助于這種半劑量給藥。如果使用玻璃容器(例如，注射器或小瓶)，則優(yōu)選使用硼硅酸鹽玻璃而不是鈉鈣玻璃制成的容器?？呻S容器裝有(例如，裝在同一盒子中)插頁，該插頁包括疫苗的細節(jié)，例如給藥的說明書，疫苗中抗原的細節(jié)等。說明書還可包括警告，例如準備腎上腺素溶液以防疫苗接種后的過敏反應，等等。佐劑在使用時，本發(fā)明疫苗宜包含佐劑，佐劑的作用是增強在接受該組合物的患者中引起的免疫應答(體液免疫和/或細胞免疫)。水包油乳液佐劑(尤其是含有角鯊烯的佐劑)的存在被證明可增強季節(jié)性W7]和大流行[68，69]流感疫苗的免疫應答的毒株交叉反應性。本發(fā)明所用的水包油乳液通常包含至少一種油和至少一種表面活性劑，所述油和表面活性劑是生物可降解(可代謝)和生物相容的。乳液中的油滴直徑通常小于5μπι，甚至可具有亞微米直徑，通過微流化床實現(xiàn)這種小尺寸以提供穩(wěn)定乳液。優(yōu)選小于220nm的液滴，因為它們可進行過濾除菌。本發(fā)明可使用的油諸如動物油(如魚油)或植物油。植物油的來源包括堅果、種籽和谷物。最常見的花生油、大豆油、椰子油和橄欖油是堅果油的代表例子。也可使用獲自 (例如)霍霍巴豆(jojoba bean)的霍霍巴油。種籽油包括紅花油、棉花籽油、葵花籽油、 芝麻籽油等。在谷物油中，最常見的是玉米油，但也可以使用來自其它谷類，如小麥、燕麥、 黑麥、稻、畫眉草(teff)、黑小麥(triticale)等的油?？蓮膱怨头N籽油開始，通過水解、 分離和酯化合適物質制備甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯(不是種籽油中天然產(chǎn)生的)。來自哺乳動物乳汁的脂肪和油類是可代謝的，因此可以用于實施本發(fā)明。由動物來源獲得純油的過程中必需的分離、純化、皂化和其它方法的步驟是本領域眾所周知的。大多數(shù)魚類含有容易回收的可代謝油。例如，鱈魚肝油、鯊魚肝油和如鯨蠟的鯨油是可以用于本發(fā)明的幾種魚油的代表例子。通過生化途徑用5-碳異戊二烯單位合成許多支鏈油，它們總稱為萜類化合物。鯊魚肝油含有稱為角鯊烯的支鏈不飽和萜類化合物，即2， 6，10，15，19，23-六甲基_2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯。也可采用角鯊烯的飽和類似物角鯊烷(squalane)。魚油，包括角鯊烯和角鯊烷，易于從商業(yè)來源獲得，或可以通過本領域已知的方法獲得。優(yōu)選角鯊烯。含有角鯊烯的乳液已包含在FLUAND 和PREPANDRIX 產(chǎn)品中。在FLUAND 疫苗中， HA的總量是45μ g(3X15y g)，角鯊烯的總量是9. 75mg，劑量體積為0. 5ml (即，19. 5mg/ml 角鯊烯)。在PREPANDRIX 疫苗中，HA的總量是3. 75 μ g (單價)，角鯊烯的總量是10. 68mg, 劑量體積為0. 5ml (即，21. 4mg/ml角鯊烯)。在本發(fā)明的許多實施方式中，角鯊烯濃度低于19mg/ml，其同時仍然維持佐劑作用，且其濃度可以是彡10mg/ml，如彡5mg/ml、彡2. 5mg/ ml?？墒褂妹縿?.5mg角鯊烯的最小量(如，見參考文獻3)。每劑的量的例子包括5. ;3mg、 4. 9mg、2. 7mg、2. 4mg 和 1. 2mg 等。其他有用的油是生育酚，它宜包含在針對老年患者(如年齡大于60歲或更大的患者)的疫苗中，因為據(jù)報道維生素E在此患者群體中對免疫應答有正面作用[70]。它們也具有抗氧化特性，這種特性有助于穩(wěn)定該乳液[71]。存在各種生育酚(α、β、Y、δ、ε或 ξ )，但通常使用α -生育酚。優(yōu)選的α -生育酚是DL- α -生育酚。已知琥珀酸α -生育酚與流感疫苗相容，并且是有用的替代含汞化合物的防腐劑[8]?？墒褂糜偷幕旌衔铮?，角鯊烯和α-生育酚的混合物。油含量通常為2-20% (體積)。可通過'HLB'(親水/親脂平衡)對表面活性劑分類。本發(fā)明優(yōu)選的表面活性劑的HLB為至少10，優(yōu)選至少15，更優(yōu)選至少16。可以與本發(fā)明一起使用的表面活性劑包括但不限于聚氧乙烯失水山梨糖醇酯表面活性劑(通常稱為吐溫)，特別是聚山梨醇酯20 和聚山梨醇酯80 ；以商品名DOWFAX 出售的環(huán)氧乙烷(Ε0)、環(huán)氧丙烷(PO)和/或環(huán)氧丁烷 (BO)的共聚物，如直鏈ΕΡ/ΡΟ嵌段共聚物；乙氧基(氧-1，2-乙二基)重復數(shù)量不同的辛苯聚醇，特別感興趣的是辛苯聚醇9 (曲通Χ-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂，如磷脂酰膽堿(卵磷脂)；壬酚乙醇酯，如Tergitol NP系列；衍生自月桂醇、鯨蠟醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(稱為芐澤(Brij)表面活性劑)，如三甘醇單月桂基醚(芐澤30)；以及失水山梨糖醇酯(通常稱為司盤(SPAN))，如失水山梨糖醇三油酸酯(司盤8 和失水山梨糖醇單月桂酸酯。優(yōu)選非離子型表面活性劑。用于乳液的最優(yōu)選的表面活性劑是聚山梨醇酯80(聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯；吐溫80)?？墒褂帽砻婊钚詣┑幕旌衔铮缤聹?0/司盤85混合物。聚氧乙烯失水山梨糖醇酯和辛苯聚醇的組合也適用。另一種有用的組合包含月桂醇聚醚9和聚氧乙烯失水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。優(yōu)選的表面活性劑的用量(重量％ )為聚氧乙烯失水山梨糖醇酯(如吐溫 80)0. 01-1%，特別是約0. ；辛基-或壬基-苯氧基聚氧乙醇(如曲通X-100或曲通系列的其它去污劑)0. 001-0. 1%，特別是0. 005-0. 02% ；聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚 9)0. 1-20%，優(yōu)選 0. 1-10%，特別是 0. 1-1%或約 0.5%。優(yōu)選含角鯊烯的水包油乳液，特別是含有聚山梨醇酯80的那些乳液。角鯊烯聚山梨醇酯80之間的重量比可以是1到10，例如2到9，如約2. 2或約8. 3。本發(fā)明所用的具體水包油乳液佐劑包括但不限于·角鯊烯、聚山梨醇酯80和失水山梨糖醇三油酸酯的亞微米乳液。該乳液的體積組成可以是約5%角鯊烯、約0. 5%聚山梨醇酯80和約0. 5%司盤85。以重量計，這些比例為4. 3%角鯊烯、0. 5%聚山梨醇酯80和0. 48%司盤85。這種佐劑稱為‘MF59，[72-74]，參考文獻75的第10章和參考文獻76的第12章更詳細地描述了該佐劑。MF59乳液宜包含檸檬酸根離子，如IOmM檸檬酸鈉緩沖液。 角鯊烯、生育酚和聚山梨醇酯80的亞微米乳液。這些乳液可含有2-10%角鯊烯、 2-10%生育酚和0. 3-3%聚山梨醇酯80，角鯊烯生育酚的重量比優(yōu)選例如0. 90)，因為這能提供更穩(wěn)定的乳液。角鯊烯和聚山梨醇酯80的體積比可以約為5 2，或者重量比約為11 5?？赏ㄟ^下述方法制備一種這樣的乳液將吐溫80溶解于PBS得到2%溶液， 然后將90ml該溶液與5g DL- α -生育酚和5ml角鯊烯的混合物混合，然后使該混合物微流體化。得到的乳液含有平均直徑為如100-250nm，優(yōu)選約ISOnm的亞微米油滴。該乳液也可含有3-脫-0-?；瘑瘟柞Ｖ|A (3d-MPL)。此種類型的另一種有用乳液可包含(每個人用劑量)0. 5-10mg角鯊烯、0. 5-1 Img生育酚和0. Hmg聚山梨醇酯80 [3]。·角鯊烯、生育酚和曲通去污劑(如曲通X-100)的乳液。該乳液也可包含 3d-MPL (見下)。該乳液可含有磷酸鹽緩沖劑。 含有聚山梨醇酯(如聚山梨醇酯80)、曲通去污劑(如曲通X-100)和生育酚(如琥珀酸α-生育酚)的乳液。該乳液可包含這三種組分，其質量比約為75 11 10(如 7501^/1111聚山梨醇酯80，1101^/1111曲通Χ-100和100 μ g/ml琥珀酸0-生育酚)，這些濃度應包括抗原中這些組分的貢獻。該乳液還可包含角鯊烯。該乳液也可包含3d-MPL。水相可含有磷酸鹽緩沖劑。 角鯊烯、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆401(〃普流羅尼克(Pluronic) L121")的乳液?？梢杂昧姿猁}緩沖鹽水，PH 7. 4配制該乳液。該乳液是一種有用的胞壁酰二肽的遞送載體，已在"SAF-I “佐劑(0. 05-1%1111-1 、5%角鯊烯、2.5%普流羅尼克1^121和0.2% 聚山梨酸酯80) [77]中與蘇氨酰-MDP—起使用。也可不與Thr-MDP—起使用，例如〃 AF" 佐劑(5%角鯊烯、1.25%普流羅尼克L121和0.2%聚山梨酸酯80) [78]。優(yōu)選微流體化?！ず薪酋徬?、水性溶劑、聚氧乙烯烷基醚親水性非離子型表面活性劑(如聚氧乙烯(1 十六烷基-十八烷基醚)和疏水性非離子型表面活性劑(如失水山梨糖醇酯或二縮甘露醇酯，如失水山梨糖醇單油酸酯或‘司盤80’)的乳液。該乳液優(yōu)選為熱可逆的和/ 或其中至少90%油滴(以體積計)的尺寸小于200nm[79]。該乳液也可含有以下一種或多種物質醛醇；低溫保護劑(例如，糖，如十二烷基麥芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷 (alkylpolyglycoside)。該乳液可包含TLR4激動劑[80]。這類乳液可以被凍干。·角鯊烯、泊洛沙姆105和Abil-Care的乳液[81]。含佐劑疫苗中這些組分的終濃度(重量)是5%角鯊烯、4%泊洛沙姆105(普流羅尼克多元醇)和2% Abil-Care 85 (雙-PEG/PPG-16/16PEG/PPG-16/16 二甲硅油；辛酸/癸酸甘油三酯)?！ず?. 5-50%油、0. 1-10%磷脂和0. 05_5 %非離子型表面活性劑的乳液。如參考文獻82所述，優(yōu)選的磷脂組分是磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。優(yōu)選亞微米液滴尺寸。·不可代謝油(如輕質礦物油)和至少一種表面活性劑(如卵磷脂、吐溫80或司
15盤80)的亞微米水包油乳液。可包含添加劑，例如QuilA皂苷、膽固醇、皂苷-親脂體偶聯(lián)物(如通過葡糖醛酸的羧基將脂族胺加到脫?；碥丈隙a(chǎn)生的GPI-0100，參見參考文獻 83)、二甲基二-十八烷基溴化銨和/或N，N-二-十八烷基-N，N-雙(2-羥乙基)丙二胺。 皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如膽固醇)結合成螺旋膠束的乳液[84]。·包含礦物油、非離子親脂性乙氧基化脂肪醇和非離子親水性表面活性劑(例如， 乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[85]?！ぐV物油、非離子親水性乙氧基化脂肪醇和非離子親脂性表面活性劑(例如， 乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[85]?？稍谝呙缰苽溥^程中將乳液與抗原混合，或者可以獨立的組分提供，以在遞送時與獨立的含抗原組分臨時混合(如PREPANDRIX 產(chǎn)品那樣)。這兩種組分是液體時，混合兩種液體的體積比可變(例如5 1-1 5)，但通常約為1 1。抗原和佐劑混合后，血凝素抗原通常保留在水溶液中，但其本身可分布于油/水界面附近。通常，如果有，也是很少的血凝素會進入該乳液的油相。本發(fā)明組合物中角鯊烯與血凝素(總量)的重量比可以為20-180，如25-30、 50-60、105-115。治療方法和疫苗的給藥途徑本發(fā)明的組合物適用于人患者，本發(fā)明提供了在患者體內(nèi)誘導免疫反應的方法， 該方法包括給予患者本發(fā)明組合物的步驟。本發(fā)明還提供了可作為藥品使用的本發(fā)明組合物。本發(fā)明還提供了至少一種甲型流感病毒抗原、至少一種乙型流感病毒抗原和角鯊烯(如，以水包油乳液形式)在制備用于主動免疫以抵抗流感疾病的組合物中的應用，其中，所述組合物是具有上文所述特征的疫苗。這些方法和用途通常用于誘導抗體應答，優(yōu)選保護性抗體應答。分析流感病毒疫苗免疫后的抗體應答、中和能力和保護作用的方法是本領域熟知的。人體實驗結果表明，抗人流感病毒血凝素的抗體滴度與保護作用呈正相關關系(血清樣本內(nèi)血凝素抑制滴度達到約30-40時所產(chǎn)生的保護作用可抑制約50%的同源病毒感染)[86]?？贵w反應一般用血凝素抑制、微量中和法、單輻射免疫擴散(SRID)和/或單輻射溶血分析(SRH)來測得。這些分析就是都是本領域熟知的。本發(fā)明的組合物可以多種途徑給藥。最優(yōu)選的免疫途徑是肌肉注射(例如，注射到胳膊或大腿內(nèi))，但是其他可用的途徑還有皮下注射、真皮內(nèi)注射[87，88]、鼻內(nèi)給藥 [89-91]、經(jīng)口給藥[92]、含服(buccal)、舌下、經(jīng)皮、透皮給藥[93]等。按照本發(fā)明的方法制備的疫苗可用于治療兒童和成人。目前推薦將流感疫苗用于兒科和成人免疫接種，從6個月大開始。因此，患者可以是1歲以下、6- < 36月、1-5歲、 5-15歲、15-55歲或55歲以上。優(yōu)選的疫苗接種者有高齡的(例如> 50歲、> 60歲，優(yōu)選 > 65歲)、低齡的(例如，< 5歲)、住院患者、醫(yī)療保健人員、軍隊服務人員和軍事人員、孕婦、慢性病患者、免疫缺陷患者、接種疫苗前7天內(nèi)服用過抗病毒化合物(例如，奧司他韋或扎那米韋；見下文)的患者、對雞蛋過敏的人以及到國外旅行的人。疫苗不僅適用于這些人群，還可用于更多其他人群。本發(fā)明的優(yōu)選組合物可滿足療效CPMP標準的1、2或3條。對于成人來說(18_60歲)，這些標準是(1)彡70%的血清保護；(2)彡40%的血清轉化；和/或(3)GMT升高彡2. 5倍。對于高齡患者來說(> 60歲)，這些標準是(1)彡60%的血清保護；(2) ^30% 的血清轉化；和/或(3)GMT升高> 2倍。這些標準是根據(jù)至少包括50個患者的開放性研究(Open Label Study)制定的。治療可采用單劑量方案或多劑量方案。多劑量方案可用于初次免疫和/或加強免疫。在多劑量方案中，不同的劑量可通過相同的或不同的途徑給藥，例如，胃腸外途徑初次免疫加粘膜途徑加強免疫，粘膜途徑初次免疫加胃腸外途徑加強免疫等。一次以上劑量給藥(一般兩次)特別適用于沒有免疫力的患者，例如，以前從未接種過流感疫苗的人群，或用于包含新HA亞型的疫苗。多劑量通常至少間隔1周給藥(例如約2周、約3周、約4周、 約6周、約8周、約12周、約16周等)。本發(fā)明生產(chǎn)的疫苗可與其他疫苗一起基本同時(例如，在同一次醫(yī)療咨詢或或訪問健康護理專業(yè)人員或疫苗接種中心期間)給藥，如基本上同時與下述疫苗給予麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、風疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破傷風疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶聯(lián)的乙型流感嗜血桿菌疫苗、滅活脊髓灰質炎疫苗、乙肝疫苗、腦膜炎球菌偶聯(lián)疫苗(如三價A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞病毒疫苗、肺炎球菌偶聯(lián)疫苗等。對于高齡患者來說優(yōu)選與肺炎球菌疫苗和/或腦膜炎球菌疫苗基本上同時給藥。同樣，本發(fā)明的疫苗可與抗病毒化合物基本上同時給藥(例如，在同一次醫(yī)療咨詢或看醫(yī)生期間)，特別是抗流感病毒的抗病毒化合物(例如，奧司他韋和/或扎那米韋)。這些抗病毒化合物包括神經(jīng)氨酸酶抑制劑，如(3R，4R，5Q-4-乙酰基氨基-5-氨基-3 (1-乙基丙氧基)-1-環(huán)己烯-1-羧酸或5-(乙?；被?-4-[(氨基亞胺甲基)-氨基]-2，6-無水-3,4,5-三脫氧-D-甘油-D-半乳糖酮_2_烯酸(galactonon-2-enonic acid)，包括其酯(例如，乙酯)和其鹽(例如，磷酸鹽)。優(yōu)選的抗病毒化合物是(3R，4R， 5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-環(huán)己烯-1-羧酸、其乙酯和磷酸鹽 (1 1)，也被稱為磷酸奧司他韋(oseltamivir phosphate)(達菲(TAMIFLU ))。概述術語“含有”包括“包含”以及“由…組成”，例如“含有” X的組合物可僅由X組成或可包含其它物質，例如X+Y。術語〃基本上〃不排除〃完全〃，如〃基本上不含〃 Y的組合物可能完全不含Y。 必要時，可從本發(fā)明定義中刪去術語"基本上"。與數(shù)值χ相關的術語“約”是任選的，其表示(例如)x士 10%。除非另有說明，包括混合兩種或更多種組分的步驟的方法不要求任何特定的混合順序。因此，可以任何順序混合這些組分。有三種組分時，兩種組分可以相互混合，然后將混合的組分再與第三種組分混合等。將動物(特別是牛)材料用于培養(yǎng)細胞時，它們應獲自未患傳染性海綿狀腦病 (TSE)，特別是未患牛海綿狀腦病(BSE)的來源?？傊?，優(yōu)選在完全不含動物來源物質的情況下培養(yǎng)細胞。當某化合物作為組合物的一部分給予人體時，該化合物可被合適的前藥所替換。當細胞底物用于重配或反向遺傳學方法時，或用于培養(yǎng)病毒時，優(yōu)選批準用于人類疫苗生產(chǎn)的細胞底物，例如Wi Eur總綱5. 2. 3所述的細胞底物。
實施本發(fā)明的方式595位患者(男孩和女孩，6到<36月)分成17組，每組35人。每組接受三價 (A/H1NUA/H3N2.B)或四價(A/Hmi、A/H3N2、B/Victoria、B/Yamagata)流感疫苗。疫苗以 0. 5ml (15 μ g/ 齊[J / 株；總共為 45 μ g 或 60 μ g)或 0. 25ml (7. 5 μ g/ 齊[J / 株；總共為 22. 5 μ g 或30yg)的體積給予。一組接受兒科劑量的目前銷售的三價滅活疫苗。肌肉內(nèi)注射給予疫苗，以預填充的注射器形式或小瓶形式提供疫苗。測試了三種不同的佐劑用量(通過稀釋獲得)。三價疫苗含有推薦用于北半球2008-2009流感季的流感毒株A/ Brisbane/59/2007-樣、A/Brisbane/10/2007-樣病毒和 B/Florida/4/2006-樣。B/ Florida/4/2006-樣屬于B/Yamagata譜系，因此，所述四價疫苗額外含有來自B/ Malaysia/2506/2004-樣病毒的抗原，該病毒屬于B/Victoria譜系。對象在第1天和第四天接受兩劑疫苗O組除外，這2組在第1天接受一劑疫苗)， 通過分析基線(接種前)、第觀天和第50天采集的血液來評估流感特異性免疫應答。通過針對流感毒株A/Hmi、A/H3N2和B (包括同源的和異源變異毒株)的毒株特異性血凝素抑制(HI)實驗來評估血清樣品。因此，所述17組如下所示
權利要求
1.一種流感病毒疫苗，含有(i)獲自至少兩種甲型流感病毒株和至少兩種乙型流感病毒株的血凝素；和(ii)具有亞微米油滴的水包油乳液佐劑，其含有角鯊烯，其中，角鯊烯濃度為< 19mg/ml。
2.一種流感病毒疫苗，含有(i)獲自至少一種甲型流感病毒株和至少一種乙型流感病毒株的血凝素，其中，所述血凝素的濃度為每株> 12yg/ml ；和(ii)具有亞微米油滴的水包油乳液佐劑，其含有角鯊烯，其中，角鯊烯濃度為< 19mg/ml。
3.一種無汞流感病毒疫苗，含有(i)獲自至少一種甲型流感病毒株和至少一種乙型流感病毒株的血凝素；和(ii)具有亞微米油滴的水包油乳液佐劑，其含有角鯊烯，其中，角鯊烯濃度為< 19mg/ml。
4.一種流感病毒疫苗，含有(i)獲自至少一種甲型流感病毒株和至少一種乙型流感病毒株的血凝素；和(ii)具有亞微米油滴的水包油乳液佐劑，其含有角鯊烯，其中，角鯊烯濃度為 9. 75mg/ml 或 4. 88mg/ml。
5.前述任一項權利要求所述的疫苗，其特征在于，具有0.5mL的單位劑量體積。
6.一種流感病毒疫苗，具有0. 2-0. 3mL的單位劑量體積，該疫苗含有(i)獲自至少一種甲型流感病毒株和至少一種乙型流感病毒株的血凝素；和(ii)具有亞微米油滴的水包油乳液佐劑，其含有角鯊烯，其中，角鯊烯濃度為< 19mg/ml。
7.—種流感病毒疫苗，具有0. 2-0. 3mL的單位劑量體積，該疫苗含有(i)獲自至少一種甲型流感病毒株和至少一種乙型流感病毒株的血凝素；和(ii)具有亞微米油滴的水包油乳液佐劑，其含有角鯊烯，其中，角鯊烯濃度為19. 5mg/ml、9. 75mg/ml或4. 88mg/ml。
8.前述任一項權利要求所述的疫苗，其特征在于，所述血凝素為裂解病毒粒子或純化表面抗原的形式。
9.前述任一項權利要求所述的疫苗，其特征在于，含有獲自以下毒株的血凝素(i) HlNl甲型流感病毒株；(ii)H3N2甲型流感病毒株；(iii)B/Victoria/2/87-樣乙型流感病毒株；以及(iv)B/Yamagata/16/88-樣乙型流感病毒株。
10.前述任一項權利要求所述的疫苗，其特征在于，每毒株的血凝素的濃度為至少 25 μ g/ml0
11.前述任一項權利要求所述的疫苗，其特征在于，角鯊烯的濃度為<10mg/ml。
12.前述任一項權利要求所述的疫苗，其特征在于，本發(fā)明組合物中角鯊烯與血凝素的重量比在20到180的范圍內(nèi)。
13.如權利要求4-12中任一項所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗是具有Α/Hmi毒株、 A/H3N2毒株和B毒株的三價滅活流感疫苗，所述疫苗具有每株約30 μ g/ml的血凝素濃度， 約19. 5mg/ml的角鯊烯濃度，和約0. 25ml的單位劑量體積。
14.如權利要求2-5或8-12中任一項所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗是具有A/ HlNl毒株、A/H3N2毒株和B毒株的三價滅活流感疫苗，所述疫苗具有每株約30 μ g/ml的血凝素濃度，約9. 75mg/ml的角鯊烯濃度，和約0. 5ml的單位劑量體積。
15.如權利要求1或5或7-12中任一項所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗是具有A/ HlNl毒株、A/H3N2毒株、B/Yamagata譜系的乙型流感病毒株和B/Victoria譜系的乙型流感病毒株的四價滅活流感疫苗，所述疫苗具有每株約30 μ g/ml的血凝素濃度，約19. 5mg/ ml的角鯊烯濃度，和約0. 25ml的單位劑量體積。
16.如權利要求1-5或8-12中任一項所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗是具有A/ HlNl毒株、A/H3N2毒株、B/Yamagata譜系的乙型流感病毒株和B/Victoria譜系的乙型流感病毒株的四價滅活流感疫苗，所述疫苗具有每株約30μ g/ml的血凝素濃度，約9. 75mg/ ml的角鯊烯濃度，和約0. 5ml的單位劑量體積。
17.如權利要求2-12中任一項所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗是具有Α/Hmi毒株、 A/H3N2毒株和B毒株的三價滅活流感疫苗，所述疫苗具有每株約30 μ g/ml的血凝素濃度， 約9. 75mg/ml的角鯊烯濃度，和約0. 25ml的單位劑量體積。
18.如權利要求2-5或8-12中任一項所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗是具有A/ HlNl毒株、A/H3N2毒株和B毒株的三價滅活流感疫苗，所述疫苗具有每株約30 μ g/ml的血凝素濃度，約4. 88mg/ml的角鯊烯濃度，和約0. 5ml的單位劑量體積。
19.如權利要求1-12中任一項所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗是具有A/Hmi毒株、 A/H3N2毒株、B/Yamagata譜系的乙型流感病毒株和B/Victoria譜系的乙型流感病毒株的四價滅活流感疫苗，所述疫苗具有每株約30 μ g/ml的血凝素濃度，約9. 75mg/ml的角鯊烯濃度，和約0. 25ml的單位劑量體積。
20.如權利要求1-5或8-12中任一項所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗是具有A/ HlNl毒株、A/H3N2毒株、B/Yamagata譜系的乙型流感病毒株和B/Victoria譜系的乙型流感病毒株的四價滅活流感疫苗，所述疫苗具有每株約30 μ g/ml的血凝素濃度，約4. 88mg/ ml的角鯊烯濃度，和約0. 5ml的單位劑量體積。
21.如權利要求2-12中任一項所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗是具有A/Hmi毒株、 A/H3N2毒株和B毒株的三價滅活流感疫苗，所述疫苗具有每株約30 μ g/ml的血凝素濃度， 約4. 88mg/ml的角鯊烯濃度，和約0. 25ml的單位劑量體積。
22.如權利要求1-12中任一項所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗是具有A/Hmi毒株、 A/H3N2毒株、B/Yamagata譜系的乙型流感病毒株和B/Victoria譜系的乙型流感病毒株的四價滅活流感疫苗，所述疫苗具有每株約30 μ g/ml的血凝素濃度，約4. 88mg/ml的角鯊烯濃度，和約0. 25ml的單位劑量體積。
23.一種在患者中引起免疫應答的方法，該方法包括給予該患者前述任一項權利要求所述的疫苗的步驟。
全文摘要
流感疫苗包含來自至少一種甲型流感病毒株和至少一種乙型流感病毒株的血凝素。所述流感疫苗還含有具有亞微米油滴的水包油乳液佐劑，其含有角鯊烯。在一些實施方式中，血凝素濃度為每株＞12μg/ml。在一些實施方式中，角鯊烯濃度為＜19mg/ml。在一些實施方式中，疫苗不含汞。在一些實施方式中，疫苗的單位劑量體積為0.2-0.3ml。在一些實施方式中，角鯊烯的濃度為9.75mg/ml或4.88mg/ml。在一些實施方式中，疫苗含有來自兩種甲型流感病毒株和兩種乙型流感病毒株的抗原。
文檔編號A61K39/295GK102307590SQ201080007887
公開日2012年1月4日 申請日期2010年2月10日 優(yōu)先權日2009年2月10日
發(fā)明者D·奧黑根, M·肯托尼, N·格羅斯 申請人:諾華有限公司