專利名稱：斜生纖孔菌鯊烯合酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學、基因工程技術領域。具體地，本發(fā)明涉及一種在斜生纖孔菌中表達的IoSQS蛋白(斜生纖孔菌鯊烯合酶蛋白，honotus obliquus squalene synthase, IoSQS)及其核酸序列，是斜生纖孔菌鯊烯合酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)和應用。
背景技術：
斜生纖孑L 菌 Inonotus obliquus (Pers. :Fr. ) J. Schroet.,俗稱舊甘(chaga)、 樺樹茸、白樺茸，屬于擔子菌門(Basidiomycota)、層菌綱(Hymeno-mycetes)、非褶菌目 (Aphyllophorales)、 秀革孑L菌禾斗(Hymenochaetaceae)、揭孑L菌屬(Inonotus),主要分布于北緯45° -50°地區(qū)，在我國主要生長于吉林、黑龍江、西藏、青海等高海拔山區(qū)的樺屬樹木上，形成顯著的黑色瘤狀菌核。斜生纖孔菌作為藥用真菌具有抗腫瘤、防治艾滋病、抗衰老、增強免疫、防治糖尿病等療效。其藥效作用主要跟斜生纖孔菌中的三萜類化合物樺褐孔菌醇、白樺脂醇等的活性有關。研究發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌醇在野生斜生纖孔菌原藥材中的含量可達0. 2%，而人工培養(yǎng)的斜生纖孔菌菌絲體中，樺褐孔菌醇的含量大大降低。隨著野生資源的日益枯竭及對藥用真菌斜生纖孔菌需求量的日益增加，有必要通過現(xiàn)代生物技術提高人工培養(yǎng)斜生纖孔菌菌絲體樺褐孔菌醇及其前體的含量來滿足人們對斜生纖孔菌的需求。鯊烯合酶(Squalene Synthase)，簡稱SQS，它催化兩個分子的法呢基焦磷酸生成鯊烯，第一步反應是兩分子的FPP通過異戊烯基轉(zhuǎn)移反應縮合成前鯊烯焦磷酸(PSQPP)，并釋放出一分子無機二磷酸。在該過程中，其中一個FPP的C(I)-CQ)的雙鍵作為另一個FPP 的異戊烯基受體；第二步反應是PSQPP在NADPH作為供氫體的情況下，通過正碳離子重排轉(zhuǎn)化為鯊烯，該反應發(fā)生在細胞中的光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。鯊烯合酶在三萜、留醇的生物合成中起著關鍵的作用。由于鯊烯合酶催化的底物FPP處十類異戊二烯代謝途徑中的分支點，因此，調(diào)控鯊烯合酶的活性能夠直接影響留醇、三萜類以及以FPP為前體物的其他類異戊二烯化合物的生物合成。因此利用現(xiàn)代生物技術將SQS基因?qū)胄鄙w孔菌中，獲得轉(zhuǎn)基因的真菌菌株，并進行大規(guī)模的培養(yǎng)，是實現(xiàn)從根本上提高樺褐孔菌醇等三萜類物質(zhì)含量的最佳途徑?！?(寸iLi·白勺 巾，“Journal of microbiology and biotechnology (it^ 物學和生物技術雜志)，2007，17 (7) :1106-1112”等報道了從靈芝中克隆了鯊烯合酶基因， 但至今尚未發(fā)現(xiàn)有與本發(fā)明主題相同的文獻報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中的不足，提供一種斜生纖孔菌Io-SQS蛋白編碼序列。使其包含所述基因的融合基因構建體，攜帶該構建體的新的重組表達載體，被所述的表達載體轉(zhuǎn)化真菌原生質(zhì)體細胞，以及由轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體產(chǎn)生的所述基因的轉(zhuǎn)基因菌株及其后代，包括菌絲體及發(fā)酵液，所獲得的轉(zhuǎn)基因菌株將具有顯著提高的樺褐孔菌醇等三萜類化合物含量。
本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的—種斜生纖孔菌鯊烯合酶基因，為以下核苷酸序列之一1)所述基因具有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列；2) SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的同源序列；3) SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列其等位基因及衍生的核苷酸序列。一種斜生纖孔菌鯊烯合酶基因編碼的蛋白質(zhì)，具有以下氨基酸之一1)所述蛋白質(zhì)具有SEQ ID No. 2中所示的第1_491位的氨基酸序列所構成；2) SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸的同源序列。含有本發(fā)明的斜生纖孔菌鯊烯合酶基因全序列或部分片段的重組載體，均屬于本發(fā)明的保護范圍。這些重組載體包括質(zhì)粒和真菌表達載體。含有本發(fā)明的斜生纖孔菌鯊烯合酶基因的宿主細胞，如含有上述重組載體的宿主細胞也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述宿主細胞為大腸桿菌細胞、農(nóng)桿菌細胞、酵母細胞或一些真菌的原生質(zhì)體。優(yōu)選大腸桿菌細胞、農(nóng)桿菌細胞或斜生纖孔菌原生質(zhì)體。本發(fā)明的斜生纖孔菌鯊烯合酶基因的應用，包括用所述的真菌表達載體轉(zhuǎn)化斜生纖孔菌原生質(zhì)體；斜生纖孔菌鯊烯合酶基因序列提供一種轉(zhuǎn)基因斜生纖孔菌菌株。具體解釋說明如下本發(fā)明所分離出的DNA分子包括編碼具有斜生纖孔菌Io-SQS蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 1中從核苷酸第109-1584位的核苷酸序列至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55°C條件下與SEQ ID No. 1中從核苷酸第109-1584位的核苷酸序列雜交。所述的編碼具有SEQ ID No. 2所述的氨基酸序列的多肽。所述的序列具有SEQ ID No. 1中從核苷酸第109-1584位的核苷酸序列所構成。本發(fā)明分離出的斜生纖孔菌Io-SQS蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO. 2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。所述的蛋白多肽是具有SEQ ID NO. 2序列的多肽。本發(fā)明所提供的載體DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主原生質(zhì)體，它是真核細胞。該宿主原生質(zhì)體包含所述的DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的，，DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開，而且已經(jīng)與在細胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。在本發(fā)明中，術語“斜生纖孔菌Io-SQS蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有斜生纖孔菌Io-SQS蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 1中第109-1584位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO. 1序列的編碼框第109-1584位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO. 1中第109-1584位核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出SEQ ID N0. 2所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳的在高度嚴緊條件下與SEQ ID NO. 1中從核苷酸第109-1584位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與SEQ ID NO. 1中從核苷酸第109-1584位的核苷酸序列的同源性至少70 %，較佳地至少80 %，更佳地至少90 %，最佳地至少95 %的核苷酸序列。該術語還包括能編碼具有與天然的斜生纖孔菌Io-SQS蛋白相同功能的蛋白的 SEQ ID NO. 1中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個 (通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和 /或取代，以及在5 ’和/或3 ’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。在本發(fā)明中，術語“斜生纖孔菌Io-SQS蛋白或多肽”指具有斜生纖孔菌Io-SQS蛋白活性的SEQ ID NO. 2序列的多肽。該術語還包括具有與天然斜生纖孔菌Io-SQS蛋白相同功能的SEQ ID NO. 2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)， 更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時， 通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術語還包括斜生纖孔菌Io-SQS蛋白的活性片段和活性衍生物。本發(fā)明的斜生纖孔菌Io-SQS蛋白多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊條件下能與斜生纖孔菌Io-SQS 蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用斜生纖孔菌Io-SQS蛋白多肽的血清獲得的多肽或蛋白。在本發(fā)明中，“斜生纖孔菌Io-SQS蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID N0. 2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行替換而產(chǎn)生。表1.保守性變異多肽中的取代殘基
權利要求
1.斜生纖孔菌鯊烯合酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)和應用，斜生纖孔菌鯊烯合酶基因的特征在于所述的核苷酸序列由SEQ ID NO. 1中第109-1584位的核苷酸序列所構成；所述的氨基酸序列由SEQ ID NO. 2中第1-491位的氨基酸序列所構成。
2.根據(jù)權利要求1所述的斜生纖孔菌鯊烯合酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)和應用，其質(zhì)粒的特征在于所述質(zhì)粒含有權利要求1所述的斜生纖孔菌鯊烯合酶基因的完整編碼閱讀框序列。
3.根據(jù)權利要求1所述的斜生纖孔菌鯊烯合酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)和應用，其真菌表達載體的特征在于所述真菌表達載體含有權利要求1所述的斜生纖孔菌鯊烯合酶基因的完整編碼閱讀框序列。
4.根據(jù)權利要求1所述的斜生纖孔菌鯊烯合酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)和應用，其應用的特征在于用權利要求4所述的真菌表達載體轉(zhuǎn)化斜生纖孔菌原生質(zhì)體。
5.根據(jù)權利要求1所述的斜生纖孔菌鯊烯合酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)和應用，其應用的特征在于用權利要求1所述的斜生纖孔菌鯊烯合酶基因序列提供的一種轉(zhuǎn)基因斜生纖孑L菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種斜生纖孔菌鯊烯合酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)與用途，本發(fā)明所提供的鯊烯合酶基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所示基因編碼的蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸的同源序列。本發(fā)明提供的鯊烯合酶基因可以通過基因工程技術提高斜生纖孔菌中樺褐孔菌醇的含量，可用于利用轉(zhuǎn)基因技術來提高斜生纖孔菌中樺褐孔菌醇含量的研究和產(chǎn)業(yè)化中。而這些次生代謝產(chǎn)物在臨床上具有抗腫瘤、防治艾滋病等潛在的應用價值，對保護人民的健康生長有所幫助。因而本發(fā)明具有很大的應用前景。
文檔編號C12N9/12GK102399798SQ20111018878
公開日2012年4月4日 申請日期2011年7月2日 優(yōu)先權日2011年7月2日
發(fā)明者馮友建, 孫勇, 曹小迎, 李長根, 王力, 蔣繼宏, 鄭竹君, 魏江春 申請人:徐州師范大學