專利名稱：含有鯊烯的水包油乳液的質(zhì)量控制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗佐劑生產(chǎn)領(lǐng)域，具體說，涉及含有鯊烯的水包油乳液 佐劑的質(zhì)量控制測定。
背景技術(shù)：
稱為'MF59，[l-3]的疫苗佐劑是鯊烯、吐溫80和司盤85的亞微米水包 油乳液。它也可包含檸檬酸離子，如lOmM檸檬酸鈉緩沖劑。該乳液的體 積組成可以是約5%鯊烯、約0.5%聚山梨酯80和約0.5%司盤85。在參考 文獻(xiàn)4的第10章和參考文獻(xiàn)5的第12章更詳細(xì)地描述了該佐劑。MF59中 的油滴很小，足以經(jīng)0.2)im濾器過濾除菌。
因為它是給予人的佐劑(例如，它包含在FLUADtm疫苗中)，所以疫苗 的質(zhì)量控制特別重要，必須將批次之間的變化控制在很窄的限度內(nèi)。MF59 的重要參數(shù)包括乳液中的平均液滴尺寸、生物負(fù)荷(bioburden)、 pH、視覺 外觀和分解產(chǎn)物或其成分的常見污染物是否存在。
本發(fā)明的目的是為水包油乳液佐劑，如MF59的質(zhì)量控制提供進(jìn)一步 改進(jìn)的測定。

發(fā)明內(nèi)容
現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，測量MF59佐劑批次中鯊烯的含量可用作檢査生產(chǎn)過程中 的問題的方式。具體說，已發(fā)現(xiàn)鯊烯含量下降可能表明出現(xiàn)過濾問題。測 試最終批次中的鯊烯含量比研究濾器的特性更容易，特別是如果濾器是保 持在GMP條件下的設(shè)備的一部分時，因此鯊烯測定簡化了水包油乳液的質(zhì) 量控制。因此，本發(fā)明提供一種水包油乳液佐劑的質(zhì)量控制測試方法，其中所 述佐劑含有鯊烯，所述方法包括將佐劑的實際鯊烯含量與標(biāo)準(zhǔn)鯊烯含量作 比較的步驟。如果實際的鯊烯含量與標(biāo)準(zhǔn)含量不同，則有生產(chǎn)故障，因此 佐劑未通過質(zhì)量控制測試，然而，如果實際含量可接受，則該佐劑通過質(zhì) 量控制檢測且可用于疫苗生產(chǎn)。
本發(fā)明也提供生產(chǎn)水包油乳液佐劑的方法，所述方法包括以下步驟-(i)用已知量的水性載體、表面活性劑和鯊烯制備亞微米水包油乳液；(ii)對 該乳液進(jìn)行過濾除菌，以提供無菌乳液；和(iii)測量該無菌乳液的鯊烯含量。
可將步驟(iii)中測定的鯊烯含量與步驟(i)中的已知鯊烯含量作比較。如果此 比較揭示出鯊烯含量明顯改變，則有生產(chǎn)故障，因此該佐劑未通過質(zhì)量控 制測試。
通常在給予患者前將乳液佐劑與抗原混合。可以在使用時臨時混合(在 這種情況下抗原和佐劑分開包裝)，或者可以在疫苗生產(chǎn)過程中、填充前混 合。在前一種情況下，對佐劑本身進(jìn)行質(zhì)量控制測試。在后一種情況下， 在與抗原混合前對佐劑和/或?qū)ψ魟?抗原混合物進(jìn)行質(zhì)量控制測試。
因此，本發(fā)明也提供一種疫苗的質(zhì)量控制測試方法，所述疫苗包含含
有鯊烯的水包油乳液佐劑，所述方法包括以下步驟(i)將佐劑的實際鯊烯 含量與標(biāo)準(zhǔn)鯊烯含量作比較；如果實際的鯊烯含量可接受，(ii)將該佐劑與
抗原混合以制備疫苗。步驟(ii)可包括單獨包裝佐劑和抗原，以便在使用時 混合它們，或者該步驟可包括在填充前或填充時混合它們。
相似地，本發(fā)明提供一種疫苗的質(zhì)量控制測試方法，所述疫苗包含抗 原和含鯊烯的水包油乳液佐劑，所述方法包括將疫苗的實際鯊烯含量與標(biāo) 準(zhǔn)鯊烯含量作比較的步驟。如果實際的鯊烯含量與標(biāo)準(zhǔn)含量不同，則有生 產(chǎn)故障，因此該疫苗未通過質(zhì)量控制測試，然而，如果實際含量可接受， 則該疫苗通過質(zhì)量控制檢測且可用于銷售和/或分銷。
在流感病毒疫苗的生產(chǎn)過程中本發(fā)明特別有用，因此本發(fā)明提供一種 方法，該方法包括混合(i)流感病毒抗原和(ii)含鯊烯的水包油乳液佐劑的步
驟，所述方法還包括以下步驟在(a)混合步驟之前測定佐劑中的鯊烯含量，
和/或(b)在混合步驟之后測定抗原-佐劑混合物中的鯊烯含量。如上所述，可將測定的鯊烯含量與標(biāo)準(zhǔn)鯊烯含量作比較，以檢査生產(chǎn)故障。 測試方法
將本發(fā)明方法用于含有鯊烯的水包油乳液佐劑，該方法包括測量(i)佐 劑本身，和/或(ii)含有佐劑和抗原的混合物的疫苗組合物中的鯊烯含量。
本領(lǐng)域已知各種鯊烯實驗。例如，參考文獻(xiàn)6公開了鯊烯的定量比色 測定法。參考文獻(xiàn)7公開了在游離脂肪酸、游離固醇和?；视头肿游镔|(zhì) 存在下定量測定鯊烯的高溫氣相色譜火焰電離檢測法。參考文獻(xiàn)8公開了 利用帶紫外檢測的高效液相色譜的驗證實驗，檢測限為每10億份140份。 參考文獻(xiàn)9公開了超臨界流體色譜在鯊烯定量分析中的應(yīng)用。
參考文獻(xiàn)10公開了用于測定鯊烯的激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜法。 參考文獻(xiàn)11公開了氣相色譜-質(zhì)譜和高效液相色譜(帶超臨界C02提取) 在測定鯊烯含量中的應(yīng)用。參考文獻(xiàn)12公開了定量測定鯊烯、a-生育酚和 固醇的簡單可靠方法，即在硅烷化后對不能皂化的材料進(jìn)行氣相色譜分析 的直接方法。參考文獻(xiàn)13公開了通過正相HPLC在硅膠柱上用己垸/丙醇-2/ 水組成的流動相分級不能皂化的材料的方法，在215nm處監(jiān)測洗脫液，用 己垸洗脫分析柱，從而定量測定這樣收集的烴組分中的鯊烯?？墒褂弥苯?和間接測定，例如，可以先對鯊烯進(jìn)行冷皂化，然后對己垸提取物進(jìn)行氣 相色譜-質(zhì)譜。
測定佐劑或抗原的鯊烯含量時，將其與標(biāo)準(zhǔn)鯊烯含量作比較。對所研 究佐劑而言，標(biāo)準(zhǔn)的鯊烯含量可以是已知給予患者時可接受的含量。它可 以是用于制備該佐劑的鯊烯用量，以便將鯊烯最終含量與起始量作比較。
可以各種形式提供標(biāo)準(zhǔn)含量。例如，可平行檢測測試佐劑與佐劑的陽 性對照樣品，以便比較它們的鯊烯含量。或者，可以在測試佐劑之前或之 后分析陽性對照，以提供比較數(shù)據(jù)。或者，標(biāo)準(zhǔn)含量可以是基于以前分析 的絕對數(shù)字。然而，在所有情況下，該方法都應(yīng)揭示出所測試佐劑中的鯊 烯含量對于質(zhì)量控制目的是否可接受。如果測定的鯊烯含量與標(biāo)準(zhǔn)含量不 同，那么這種差異表明生產(chǎn)故障。
標(biāo)準(zhǔn)含量可以是絕對量或濃度，或者可以是相對量，如相對于表面活 性劑含量或抗原含量檢測的。絕對量或濃度更常見。標(biāo)準(zhǔn)含量可以是準(zhǔn)確的數(shù)字或者是范圍。例如，可以是具有可接受的 百分?jǐn)?shù)偏差，例如±10%、 ±5%等的絕對量。然后，可將測定的含量與標(biāo)準(zhǔn) 含量范圍作比較，如果其超出該范圍，則測定失敗。對于水包油乳液佐劑，
鯊烯標(biāo)準(zhǔn)含量的絕對值一般可以為，例如40-45mg/ml (如43mg/ml)、 36國42mg/ml (如39mg/ml)、 20誦25mg/ml (如21.5mg/ml)、 18-21mg/ml (如 19.5mg/ml)等。
按照正常統(tǒng)計學(xué)標(biāo)準(zhǔn)， 一般測定幾個樣品中的鯊烯含量，以最大程度 降低實驗誤差效應(yīng)。因此，本發(fā)明可包括比較平均值與標(biāo)準(zhǔn)含量。
如以下更詳細(xì)的解釋，可在與抗原混合之前對佐劑、對抗原/佐劑混合 物、對填充前的散裝材料、對由散裝材料提取的填充材料等進(jìn)行鯊烯測定。
佐劑
將本發(fā)明方法用于水包油乳液佐劑。該佐劑包含鯊烯，鯊烯是不飽和 砲類油(C30H50; [(CH3)2C[=CHCH2CH2C(CH3)]2=CHCH2-]2; 2,6,10,15,19,23-六甲基-2，6，10，14,18,22-二十四碳己烯;CAS RN 7683-64-9)。
佐劑也可包含除鯊烯以外的其它油。優(yōu)選地，任何其它油是可生物降 解(可代謝)和生物相容性的。該佐劑也可包含諸如動物(如魚)或植物來源的 油。植物油的來源包括堅果、種籽和谷物。堅果油中最常見的是花生油、 大豆油、可可油和橄欖油。也可使用獲自(例如)霍霍巴豆的霍霍巴油。種籽 油包括紅花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻油等。在谷物油中，最常見的 是玉米油，但也可采用其它谷類如小麥、燕麥、裸麥、稻、畫眉草(teff)、 黑小麥(triticale)等的油?？蓮膱怨头N籽油開始，通過水解、分離和酯化合 適物質(zhì)制備甘油和1,2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯(不是種籽油中天然產(chǎn)生 的)。來自哺乳動物乳汁的脂肪和油是可代謝的，因此可用于實施本發(fā)明。 由動物來源獲得純油的過程中必需的分離、純化、皂化和其它步驟是本領(lǐng) 域眾所周知的。大多數(shù)魚類含有容易回收的可代謝油。例如，鱈魚肝油、 鯊魚肝油和鯨油如鯨蠟代表了可用于本發(fā)明的幾種魚油的例子。通過生化 途徑用5-碳異戊二烯單位合成許多支鏈油，它們總稱為萜類，其中包括鯊 烯。也可采用鯊烯的飽和類似物鯊?fù)?。魚油，包括鯊烯和鯊?fù)橐子趶纳虡I(yè) 來源購得，或可通過本領(lǐng)域已知方法獲得。其它優(yōu)選油是生育酚。當(dāng)組合物包含生育酚時，可采用a、 p、 Y、 S、 S或g生育酚中的任何一種，但優(yōu)
選a-生育酚。生育酚可取不同形式，例如不同的鹽和/或異構(gòu)體。鹽包括有 機(jī)鹽，例如琥珀酸鹽、乙酸鹽、煙酸鹽等?？赏瑫r采用D-a-生育酚和DL-a-生 育酚。優(yōu)選的a生育酚是DL-a生育酚。如果采用這種生育酚的鹽，那么優(yōu) 選的鹽是琥珀酸鹽。
除了存在鯊烯(任選地，還有一種或多種其它油)外，該乳劑包含水相和 表面活性劑。表面活性劑優(yōu)選是可生物降解(可代謝)和生物相容性的?？赏?過'HLB'(親水/親脂平衡)對表面活性劑分類。本發(fā)明優(yōu)選的表面活性劑的 HLB為至少10，優(yōu)選至少15，更優(yōu)選至少16?？捎糜诒景l(fā)明的表面活性 劑包括但不限于聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性劑(通常稱為吐溫)，特 別是聚山梨酯20和聚山梨酯80;以商品名DOWF AX出售的環(huán)氧乙垸(EO)、 環(huán)氧丙烷(PO)和/或環(huán)氧丁垸(BO)的共聚物，如直鏈EP/PO嵌段共聚物；重 復(fù)的乙氧基(氧-l,2-乙二基)數(shù)量不同的辛苯聚醇，特別感興趣的是辛苯聚醇 9(曲通(Triton)X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚 乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40); 磷脂如磷脂酰膽堿(卵磷脂)； 衍 生自十二垸醇、十六垸醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(稱為芐澤表 面活性劑)，如三乙二醇單月桂基醚(芐澤30);聚氧乙烯-9-月桂醚以及去水 山梨糖醇酯(通常稱為司盤)，如去水山梨糖醇三油酸酯(司盤85)和去水山梨 糖醇單月桂酸酯。乳液中包含的優(yōu)選表面活性劑是吐溫80(聚氧乙烯去水山 梨糖醇單油酸酯)、司盤85(去水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。
可使用表面活性劑的混合物，如吐溫80/司盤85混合物或吐溫80/曲通 -XlOO混合物c也適合釆用聚氧乙烯去水山梨糖醇酯如聚氧乙烯去水山梨糖 醇單油酸酯(吐溫80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100)
的混合物。另一種有用的混合物包含聚乙二醇單月桂醚9和聚氧乙烯去水山 梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。
表面活性劑的含量(重量％)優(yōu)選為聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如吐 溫80) 0.01-1%，特別是約0.1%;辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通X-100 或曲通系列的其它去污劑)0.001-0.1%，特別是0.005-0.02%;聚氧乙烯醚(如 月桂醇聚醚9) 0.1-20%，優(yōu)選0.1-10%，特別是0.1-1%或約0.5%。乳液的水相優(yōu)選為緩沖液，如磷酸鹽緩沖鹽水。
乳液中油滴的直徑(平均)通常小于1 pm。用微流化床可容易地實現(xiàn)亞 微米直徑，以提供穩(wěn)定的乳液。特別優(yōu)選小于220nm的液滴，因為它們可 進(jìn)行過濾除菌。其中至少80%數(shù)量的液滴直徑為50-200nm的乳液特別有 用。
含有鯊烯并可用本發(fā)明方法測試的具體水包油乳液佐劑包括但不限
于
鯊烯、吐溫80和司盤85的亞微米乳液。該乳液的體積組成可以是 約5%鯊烯、約0.5%聚山梨酯80和約0.5%司盤85。以重量計，這些含量 變?yōu)?.3%鯊烯、0.5%聚山梨酯80和0.48%司盤85。這種佐劑稱為'MF59'。 MF59乳液宜包含檸檬酸根離子，如lOmM檸檬酸鈉緩沖液。
鯊烯、生育酚和吐溫80的乳液。該乳液可包含磷酸鹽緩沖鹽水。它 也可含有司盤85(如1%)和/或卵磷脂。這些乳液可含有2-10%鯊烯、2-10% 生育酚和0.3-3%吐溫80，鯊烯:生育酚的重量比優(yōu)選S1，因為這能提供更穩(wěn) 定的乳液。鯊烯和吐溫80的體積比可以約為5:2?？赏ㄟ^下述方法制備一 種這樣的乳液將吐溫80溶解于PBS得到2%溶液，然后將90 ml該溶液 與5g DL-a生育酚和5 ml鯊烯的混合物混合，然后使該混合物微流體化。 得到的乳液可含有(如)平均直徑為100-250nm，優(yōu)選約180nm的亞微米油 滴。該乳液也可包含3d-MPL和/或皂苷(如QS21)。
鯊烯、生育酚和曲通去污劑(如曲通X-100)的乳液。該乳液也可含有 3-0-脫酰化單磷酰脂質(zhì)A ('3d-MPL')。該乳液可含有磷酸鹽緩沖液。
含有鯊烯、普流羅尼F-68嵌段共聚物、蛋黃磷脂酰膽堿、甘油和生 育酚的乳液[14]。
含有鯊烯、聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污劑(如曲通X100) 和生育酚(如琥珀酸a-生育酚)的乳液。該乳液可包含這三種組分，其質(zhì)量 比約為75:11:10 (如750嗎/ml聚山梨酯80、 110嗎/ml曲通X-100和100 嗎/ml琥珀酸a-生育酚)，這些濃度應(yīng)包括抗原中這些組分的貢獻(xiàn)。該乳液 也可包含3d-MPL。該乳液也可包含皂苷，如QS21。水相可含有磷酸鹽緩 沖液。 含有鯊烯、水性溶劑、聚氧乙烯烷基醚親水性非離子型表面活性劑 (如聚氧乙烯(12)十六十八醚)和疏水性非離子型表面活性劑(如去水山梨糖 醇酯或二縮甘露醇酯，如去水山梨糖醇單油酸酯或'司盤80')的乳液。該乳
劑優(yōu)選為熱可逆的和/或其中至少90%油滴(以體積計)的尺寸小于200 nm [15]。該乳劑也可含有以下一種或多種物質(zhì)糖醇；低溫保護(hù)劑(例如，糖， 如十二垸基麥芽苷和/或蔗糖)；和/或垸基聚糖苷(alkylpolyglycoside)。也可 包含TLR4激動劑，如化學(xué)結(jié)構(gòu)不含糖環(huán)的TLR4激動劑[16]。這類乳液可 以被凍干。
鯊烯、泊洛沙姆-105和Abil-Care的乳液[17]。含佐劑疫苗中這些組 分的終濃度(重量)是5%鯊烯、4%泊洛沙姆-105(普流羅尼多元醇)和2% Abil-Care 85 (雙-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 二甲硅油；辛酸/癸酸甘油 三酯)。
抗原
雖然可能將水包油乳液佐劑本身給予患者(如為單獨給予患者的抗原 提供佐劑效應(yīng))，但更常見的是將佐劑與抗原混合后給予患者。這種混合可 以在生產(chǎn)期間進(jìn)行，以便使銷售的疫苗產(chǎn)品可以立即給藥；或者可以在使 用時進(jìn)行混合。
各種抗原均可用于水包油乳液，包括但不限于病毒抗原，如病毒表 面蛋白；細(xì)菌抗原，如蛋白質(zhì)和/或糖抗原；真菌抗原；寄生物抗原；和腫 瘤抗原。
本發(fā)明特別可用于以下病原體的疫苗流感病毒、HIV、鉤蟲、乙肝 病毒、單純皰疹病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、巨細(xì)胞病毒、金黃 色葡萄球菌(&ap/^/ococcw awews)、衣原體、SARS冠狀病毒、水痘-帶狀 抱疫病毒、月巿炎鏈球菌(5^e;^ococciw ; "ewmo"/fle)、 結(jié)核分支桿菌 (腳co6a"eW訓(xùn)化6ercw/c^)、 炭疽桿菌(5ac〃/"51 a"f/zrac/s) 、 EB病毒、人 乳頭瘤病毒等。
流感病毒抗原.抗原可以采取活病毒或者滅活病毒的形式。采用滅活 病毒時，該疫苗可包含完整的病毒顆粒、分裂病毒顆?；蚣兓谋砻婵乖?(包括血凝素，通常也包括神經(jīng)氨酸酶)。流感抗原也可以病毒體形式出現(xiàn)[18]?？乖删哂羞x自下組的任何血凝素亞型Hl、 H2、 H3、 H4、 H5、 H6、 H7、 H8、 H9、 HIO、 Hll、 H12、 H13、 H14、 H15和/或H16。疫苗可 包含一種或多種(如1、 2、 3、 4或更多種)流感病毒毒株，包括甲型流感病 毒和/或乙型流感病毒的抗原。流感病毒可以是重配毒株，并可通過逆向遺 傳學(xué)技術(shù)獲得[如19-23]。因此，該病毒可包含來自A/PR/8/34病毒(一般是 來自A/PR/8/34的6個節(jié)段，HA和N節(jié)段來自疫苗毒株，即6:2重配毒株) 的一個或多個RNA節(jié)段。可以在雞蛋(如含胚雞蛋)或細(xì)胞培養(yǎng)物上培養(yǎng)用 作抗原來源的病毒。使用細(xì)胞培養(yǎng)物時，細(xì)胞底物一般是哺乳動物細(xì)胞系， 如MDCK; CHO; 293T; BHK; Vero; MRC-5; PER.C6; WI-38;等。用 于培養(yǎng)流感病毒的哺乳動物細(xì)胞系優(yōu)選包括MDCK細(xì)胞[24-27]，衍生自 馬達(dá)二氏(Madin Darby)犬腎；Vero細(xì)胞[28-30]，衍生自非洲綠猴 (Cwco/ "/^cws aeA/o/w)腎；或PER.C6細(xì)胞[31]，衍生自人胚視網(wǎng)膜母細(xì)胞。 這些細(xì)胞系可由各種來源獲得，例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)[32]、 Coriell細(xì)胞庫[33]或歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)。例如，ATCC提供 各種不同Vero細(xì)胞，目錄號為CCL-81、CCL-81.2、CRL-1586和CRL-1587; 并提供MDCK細(xì)胞，目錄號為CCL-34。 PER.C6可獲自ECACC，保藏號 為96022940。哺乳動物細(xì)胞系的次優(yōu)選替代方式可以在禽細(xì)胞系上培養(yǎng)[例 如參考文獻(xiàn)34-36]，這些細(xì)胞系包括衍生自鴨(如鴨視網(wǎng)膜)或母雞如雞胚胎 成纖維細(xì)胞(CEF)等的細(xì)胞系。在哺乳動物細(xì)胞系上培養(yǎng)病毒時，該組合物 宜不含雞蛋蛋白質(zhì)(如卵清蛋白和卵類粘蛋白)和雞DNA，從而降低變應(yīng)原 性。
人免疫缺陷病毒，包括HIV-1和HIV-2。該抗原一般是包膜抗原。
乙肝病毒表面抗原。該抗原優(yōu)選通過重組DNA方法獲得，例如在釀 酒酵母OSacc/zofrow;;cw cerev/s/oe)中表達(dá)后獲得。與天然病毒HBsAg不同， 重組酵母表達(dá)的抗原是非糖基化抗原。它可以是基本呈球形的顆粒形式(平 均直徑約為20nm)，包括含有磷脂的脂質(zhì)基質(zhì)。不像天然HBsAg顆粒，酵 母表達(dá)的顆?？赡馨字＜〈?。HBsAg可來自以下任何亞型aywl、 ayw2、 ayw3、 ayw4、 ayr、 adw2、 adw4、 adrq-禾卩adrq+。
鉤蟲，特別是犬中發(fā)現(xiàn)的鉤蟲(犬鉤蟲G4"c;;/oWomflfcam'"wm》。這種抗原可以是重組Ac-MTP-l (蝦紅素樣金屬蛋白酶)和/或天冬氨酸血紅蛋白 酶(Ac-APR-l)，它可以在桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)為分泌蛋白[37,38]。
單純皰疹病毒抗原(HSV).用于本發(fā)明的優(yōu)選HSV抗原是膜糖蛋白 gD。優(yōu)選使用HSV-2毒株的gD('gD2'抗原)。該組合物可使用C-末端膜錨 定區(qū)缺失的gD形式[39]，如包含天然蛋白的氨基酸1-306且C-末端加入天 冬酰胺和谷胺酰胺的截短gD。這種蛋白質(zhì)形式包括信號肽，信號肽被切割 后產(chǎn)生成熟的283個氨基酸的蛋白質(zhì)。缺失錨定物，以便將該蛋白制備成 可溶形式。
人乳頭瘤病毒抗原舊PV).用于本發(fā)明的優(yōu)選HPV抗原是Ll衣殼蛋 白，該蛋白可組裝形成稱為病毒-樣顆粒(VLP)的結(jié)構(gòu)。可通過在酵母細(xì)胞(例 如釀酒酵母(S. cerev&'fle))或昆蟲細(xì)胞(例如夜蛾0^o^^era)細(xì)胞，如草地貪 夜蛾OS./n^peWa)，或果蠅(Dmyo; /n7a)細(xì)胞)中重組表達(dá)Ll產(chǎn)生VLP。在 酵母細(xì)胞中，質(zhì)粒載體可攜帶L1基因；在昆蟲細(xì)胞中，桿狀病毒載體可攜 帶Ll基因。更優(yōu)選地，該組合物包含來自HPV-16和HPV-18毒株的Ll VLP。已證明這種二價組合非常有效[40]。除了 HPV-16和HPV-18毒株外， 也可能包含來自HPV-6和HPV-ll毒株的Ll VLP。也可能采用致癌性HPV 毒株。疫苗可包含20-60嗎/ml (如約40叫/ml) L1/HPV毒株。
ME^M.炭疽是由炭疽桿菌CSac/〃wfl"f/2mc^)引起的。合適的炭疽 桿菌抗原包含A組分(致死因子(LF)和水腫因子(EF))， 二者共享稱為保護(hù)性 抗原(PA)的B組分。任選地，可使抗原脫毒。其它詳情可參見參考文獻(xiàn) 41-43。
MM.已知各種腫瘤特異性抗原。本發(fā)明可使用引發(fā)針對肺癌、黑 素瘤、乳腺癌、前列腺癌等的免疫治療性應(yīng)答的抗原。
本發(fā)明也可使用基于包含病毒表面抗原和異源抗原的雜交或融合蛋白
的抗原。例如，已知將HBsAg序列融合于異源抗原，以利用HBsAg的能 力組合成顆粒。例如，參考文獻(xiàn)44報道了 HIV-1 gpl20與HBsAg融合得 到的融合蛋白，該蛋白自發(fā)地組裝成類似于天然HBsAg顆粒的顆粒。此方 法也被用于瘧疾疫苗。參考文獻(xiàn)45報道了將來自瘧疾gpl90抗原的至多 61aa的表位插入HBsAg序列，表達(dá)的雜交顆粒可在動物中引發(fā)抗-gpl90免疫應(yīng)答。參考文獻(xiàn)46報道了含有16個重復(fù)的環(huán)孢子體蛋白4-聚體序列 的蛋白質(zhì)，表達(dá)為含HBsAg的融合蛋白。參考文獻(xiàn)47報道了在酵母中產(chǎn) 生由融合于HbsAg的Pfsl6組成的病毒樣顆粒。參考文獻(xiàn)48公開了其中環(huán) 孢子體蛋白融合于HBsAg的雜交抗原。參考文獻(xiàn)49公開了間日^原蟲(戶. w'w;c)的裂殖子表面1蛋白的C末端區(qū)的融合物，它形成的免疫原性顆粒的 大小為20-45 nm。因此，本領(lǐng)域熟知采用HBsAg以自身組裝顆粒形式遞呈 瘧疾抗原。因此，本發(fā)明可采用包含病毒表面抗原和異源抗原的雜交抗原。 特別是當(dāng)病毒表面抗原是HBsAg時，異源抗原可來自HIV、惡性瘧原蟲 (尸/osmocf/wm ^/"J9arwm) 、 |、司曰癥原蟲(/V^wmocZ/wm v/vox)、 三曰癥原蟲 CP/asmoWwm ma/a〃.a)或卵圓癥原蟲(尸Axywoflf/wm ova/e)。適用于審U備HBsAg 雜交子的HIV抗原包括包膜糖蛋白gpl20或其抗原性片段[44]。適用于制 備HBsAg雜交子的惡性瘧原蟲抗原可以基于環(huán)孢子體表面抗原("CSP")的 亞基，例如它們可包含3-20個重復(fù)的NANP基序，和/或它們可包含CSP 的C末端區(qū)(但一般不包含C末端的最后12個氨基酸)。例如，本發(fā)明可采 用稱為"RTS"的抗原，其含有惡性瘧原蟲NF54或7G8分離物的CSP的C 末端的一大部分(氨基酸210-398，其含有19個NANP重復(fù)和氨基酸367-390 的T細(xì)胞表位區(qū))，該部分通過HBsAg的前(Pre)S2部分四個氨基酸融合于 HBsAg的N末端。因此，RTS的序列可包含(i)N-末端甲硫氨酸殘基； (ii)Met-Ala-Pro; (iii)對應(yīng)于惡性瘧原蟲7G8的CS蛋白的氨基酸210-398 或惡性瘧原蟲NF54的CS蛋白的氨基酸207-395的189個氨基酸；(iv)Arg 或Gly; (v)來自乙型肝炎前-S2蛋白的Pro-Val-Thr-Asn;和(vi)HBsAg。 疫苗
通過本發(fā)明方法檢測的乳液佐劑可用于生產(chǎn)疫苗。如上所述，可以在 臨用前或者在疫苗生產(chǎn)過程中混合乳液和抗原。當(dāng)制備兩種類型的疫苗時， 可應(yīng)用本發(fā)明方法。就預(yù)混疫苗而言，可以在與抗原混合之前對佐劑進(jìn)行 該方法，和/或可以在混合后進(jìn)行該方法，然后，通過質(zhì)量控制檢測的疫苗 可放行用于銷售和/或分銷。對以臨用前混合形式提供的疫苗而言，可以在 與抗原一起包裝到藥盒中之前對佐劑進(jìn)行該方法。
因此，檢測佐劑的本發(fā)明方法還可包括將佐劑與抗原混合的工藝步驟?；蛘?，還可包括將佐劑與抗原組分一起包裝到藥盒中形成藥盒組件的步驟。 這些步驟通常僅在佐劑通過質(zhì)量控制測試的情況下進(jìn)行。
通常對散裝佐劑或混合疫苗的小份樣品進(jìn)行本發(fā)明方法。對此樣品進(jìn) 行質(zhì)量控制，只有在樣品通過質(zhì)量控制檢測后才將散裝樣品包裝成藥劑。 因此，本發(fā)明方法可包括從散裝佐劑中提取樣品；如上所述檢測該樣品； 然后，如果樣品通過測試，則將該散裝佐劑與散裝抗原混合物混合。然后， 提取單位劑量的混合散裝物質(zhì)，進(jìn)行包裝以便銷售和/或分銷。
在另一實施方式中，本發(fā)明方法可包括從散裝佐劑中提取樣品；如 上所述檢測該樣品；然后，如果樣品通過測試，則從散裝佐劑中提取單位 劑量以與單位劑量的抗原混合。
在另一實施方式中，本發(fā)明方法可包括從散裝佐劑中提取樣品；如 上所述檢測該樣品；然后，如果樣品通過測試，則從散裝佐劑中提取單位 劑量，包裝成即用型藥盒組件(如上所述)。
在另一實施方式中，本發(fā)明方法可包括從散裝的抗原佐劑混合物中 提取樣品；如上所述檢測該樣品；然后，如果樣品通過測試，則從散裝混 合物中提取單位劑量進(jìn)行包裝。
對流感疫苗而言，通常參照血凝素(HA)含量(通常用SRID測定)標(biāo)準(zhǔn)化 疫苗的單位劑量。現(xiàn)有的疫苗一般含有約15pgHA/毒株，但也可使用更低 的劑量，特別是使用佐劑時。采用了分?jǐn)?shù)劑量如1/2(即7.5pgHA/毒株)、1/4 和1/8[50、 51]，以及較高劑量(如3x或9x劑量[52、 53])。因此，疫苗可包 含0.1-150嗎HA/流感毒株，優(yōu)選0.1-50 pg，例如0.1-20 pg、 0.1-15 pg、 0.1-10^g、 0.1-7.5 pg、 0.5-5 pg等。具體劑量包括例如，約15、約10、約 7.5、約5、約3.8、約1.9、約1.5pg等/毒株。
因此，綜上所述，制備混合的疫苗時或制備包含臨用前混合的抗原和 佐劑的藥盒時，可使用本發(fā)明。如果在生產(chǎn)過程中混合，那么所混合的散 裝抗原和佐劑的體積一般大于1升，例如^升、三10升、^20升、^50升等。 如果在使用時混合，那么所混合的體積一般小于1毫升，例如^0.6ml、 S0.5ml、 S0.4ml、 S0.3ml、 50.2ml等。在這兩種情況下，通常所混合的乳液 和抗原溶液的體積基本相等，即基本上為1:1 (例如1.1:1至1:1.l，優(yōu)選1.05:1至1:1.05，更優(yōu)選1.025:1至1:1.025)。然而，在一些實施方式中，可采用 過量的佐劑或過量的抗原。當(dāng)一種組分的體積過量時，過量通常為至少 1.5:1,例如^2:1、 ^2.5:1、 ^3:1、 ^4:1、 ^5:1等。
抗原和佐劑包裝為藥盒中的單獨組分時，它們在藥盒中物理上相互分 離，這種分離可通過多種方式實現(xiàn)。例如，組分可以裝在不同的容器，如 藥瓶中。需要時，可通過(例如)取出一個藥瓶的內(nèi)容物并將其加入另一個藥 瓶，或者分別取出兩個藥瓶的內(nèi)容物并在第三個容器中將它們混合在一起， 來混合兩個藥瓶的內(nèi)容物。
在優(yōu)選的配置中，藥盒的一種組分在注射器中，另一種組分在容器如 藥瓶中?？墒褂迷撟⑸淦?例如裝有針頭的注射器)將其內(nèi)容物注入第二個容 器中混合，然后將該混合物抽回注射器中。然后， 一般通過新的無菌針頭 將該注射器中的混合成分給予患者。將一種組分包裝到注射器中無需用其 它注射器對患者給藥。
在另一優(yōu)選配置中，這兩種藥盒組分在同一注射器，例如雙室注射器 (如參考文獻(xiàn)54-61等所述)中分開保存。當(dāng)注射器致動時(例如給予患者時)， 將這兩室中的內(nèi)容物混合。這種配置在使用時無需單獨的混合步驟。
不同藥盒組件的內(nèi)容物通常均為水性形式。在一些配置中，組分(一般 是抗原組分而非乳液組分)是干燥形式(例如凍干形式)，而另一組分是水性 形式。可將這兩種組分混合，以再次激活干燥組分，得到給予患者的水性 組合物。凍干組分一般裝在藥瓶中，而非注射器中。干燥組分可包含穩(wěn)定 劑，例如乳糖、蔗糖或甘露醇，及其混合物，如乳糖/蔗糖混合物、蔗糖/ 甘露醇混合物等。 一種可能的配置將水性乳液組分裝在預(yù)填裝注射器中， 將凍干的抗原組分裝在藥瓶中。
如果除佐劑和抗原外疫苗還含有其它組分，那么這些其它組分可包含 在這兩種藥盒組分之一中，或者可以是第三種藥盒組分的一部分。
適用于本發(fā)明混合疫苗或單獨藥盒組分的容器包括藥瓶和一次性注射 器。這些容器應(yīng)無菌。
組合物/組分裝在藥瓶中時，藥瓶優(yōu)選由玻璃或塑料制成。在將組合物 加入藥瓶之前，優(yōu)選對其進(jìn)行滅菌。為了避免膠乳過敏患者可能產(chǎn)生的問題，藥瓶優(yōu)選用無膠乳塞子密封，且優(yōu)選所有包裝材料均不含膠乳。藥瓶 可包含單一劑量的疫苗，或者可以包含一個以上劑量('多劑量'藥瓶)，如10 個劑量。優(yōu)選的藥瓶由無色玻璃制成。
藥瓶可以有適合的帽(如Luer鎖)，以便將預(yù)填裝注射器插入該帽，可
以將注射器的內(nèi)容物推入藥瓶(如在其中重建凍干物質(zhì))，可以將藥瓶的內(nèi)容 物吸回注射器中。從藥瓶中拔出注射器后，可連上針頭，將該組合物給予 患者。該帽優(yōu)選位于封口或蓋子內(nèi)側(cè)，以便在封口或蓋子打開后才能接觸 到該帽。
將組合物/組分包裝到注射器中時，注射器通常不會連接有針頭，但可
提供單獨的針頭與注射器組裝和使用。優(yōu)選安全性針頭。 一般是1-英寸23-
號、1-英寸25-號和5/8-英寸25-號針頭。可提供有剝離標(biāo)簽的注射器，該
標(biāo)簽上可打印上內(nèi)含物的批號、流感季節(jié)和過期日期，以幫助記錄保存。
注射器的活塞優(yōu)選帶有抑止裝置，以防止活塞在吸出時偶然脫出。注射器
可以有膠乳橡膠帽和/或活塞。 一次性注射器含有單一劑量的疫苗。注射器
通常帶有頂帽，以在連接針頭前密封頂端，頂帽優(yōu)選由丁基橡膠制成。如
果注射器和針頭分開包裝，那么針頭優(yōu)選裝有丁基橡膠護(hù)罩。優(yōu)選的注射 器是以商品名"Tip-Lok"TM銷售的注射器。
容器可標(biāo)注有半劑量體積，以利于遞送給兒童。例如，含有0.5ml劑 量的注射器可標(biāo)有0.25 ml體積的標(biāo)記。
采用玻璃容器(如注射器或藥瓶)時，優(yōu)選采用由硼硅酸鹽玻璃，而非鈉 鈣玻璃制成的容器。
可將藥盒或組合物與單頁宣傳品包裝在一起(在同一個盒子中)，所述單 頁宣傳品包括疫苗的詳細(xì)情況如給藥說明書、疫苗內(nèi)所含抗原的詳情等。 說明書也可包含警告，(例如)準(zhǔn)備好腎上腺素溶液以應(yīng)對疫苗接種后發(fā)生過 敏反應(yīng)的情況等。
藥物組合物
用本發(fā)明方法制備的組合物是藥學(xué)上可接受的。除抗原和佐劑外，它 們可包含其它組分，例如它們一般包含一種或多種藥物載體和/或賦形劑。
對這類組分的充分討論參見參考文獻(xiàn)62。該組合物可含有防腐劑，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，疫苗優(yōu)選應(yīng)
基本不含(即小于5 pg/ml)含滎物質(zhì)，如不含硫柳汞[63，64]。更優(yōu)選無汞的 疫苗。
為了控制張力，優(yōu)選包含生理性鹽如鈉鹽。優(yōu)選氯化鈉(NaCl)，它的 濃度可以是1-20 mg/ml?？梢源嬖诘钠渌}包括氯化鉀、磷酸二氫鉀、二 水合磷酸氫二鈉、氯化鎂、氯化鈣等。
組合物的滲透壓通常為200 mOsm/kg-400 mOsm/kg，優(yōu)選為240-360 mOsm/kg，更優(yōu)選為2卯-310 mOsm/kg。雖然以前報道過滲透壓對疫苗接種 引起的疼痛無影響[65]，但優(yōu)選將滲透壓保持在此范圍內(nèi)。
組合物可含有一種或多種緩沖劑。緩沖劑一般包括磷酸鹽緩沖液； Tris緩沖液；硼酸鹽緩沖液；琥珀酸鹽緩沖液；組氨酸緩沖液；或檸檬酸 緩沖液。包含的緩沖劑的濃度一般是5-20mM。
組合物的pH通常為5.0-8.1，更常見為6.0-8.0，例如6.5-7.5。因此， 本發(fā)明方法可包括在包裝前調(diào)整散裝疫苗pH的步驟。
該組合物優(yōu)選無菌。該組合物優(yōu)選無熱原，如每劑量含有〈1EU(內(nèi)毒素 單位，標(biāo)準(zhǔn)量度)，優(yōu)選每劑量O.IEU。該組合物優(yōu)選不含谷蛋白。
該組合物可含有一次免疫的物質(zhì)，或者可含有多次免疫的物質(zhì)(即'多 劑量'藥盒)。多劑量配置優(yōu)選含有防腐劑。
疫苗的給藥劑量體積一般為約0.5ml，但可將一半劑量(即約0.25ml)給 予兒童。
組合物和藥盒優(yōu)選儲存于2-8"C。不應(yīng)冷凍。理想地，應(yīng)避光保存。 治療方法和疫苗的給藥
本發(fā)明提供用本發(fā)明方法制備的藥盒和組合物。它們適合給予人類患 者，本發(fā)明提供了在患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，包括將該組合物給予患 者的步驟。
本發(fā)明也提供用作醫(yī)藥品的這些藥盒和組合物。
本發(fā)明也提供以下應(yīng)用(i)抗原的水性制劑；和(ii)按照本發(fā)明檢測的 水包油乳液佐劑在制備在患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用。
這些方法和應(yīng)用引發(fā)的免疫應(yīng)答通常包括抗體應(yīng)答，優(yōu)選保護(hù)性抗體應(yīng)答。
可以各種方式給予該組合物。最優(yōu)選的免疫途徑是肌肉內(nèi)注射(如注射
到上肢或下肢)，但其它可用的途徑包括皮下注射、鼻內(nèi)[66-68]、 口服[69 皮內(nèi)[70,71]、經(jīng)皮、透皮[72]等。
可利用按照本發(fā)明制備的疫苗治療兒童和成年人?；颊呖梢孕∮?歲、 1-5歲、5-15歲、15-55歲或至少55歲?；颊呖梢允抢夏耆?如三50歲，優(yōu) 選^65歲)、青年(如^5歲)、住院患者、健康護(hù)理任意、軍隊服務(wù)人員和軍 人、懷孕婦女、慢性疾病患者、免疫缺陷患者和去國外旅行的人。然而該 疫苗不只適用于這些人群，可以在更廣泛的人群中使用。
可以通過單劑量方案或多劑量方案進(jìn)行治療。多劑量可用于初免方案 和/或加強(qiáng)免疫方案。在多劑量方案中，可通過相同或不同途徑給予各種劑 量，例如初免采用胃腸道外途徑而加強(qiáng)免疫采用粘膜途徑，或者初免采用 粘膜途徑而加強(qiáng)免疫采用胃腸道外途徑等。對于免疫原初(immunological naive)患者，特別適合給予一個以上的劑量(一般是兩個劑量)。 一般以至少 1周(例如約2周、約3周、約4周、約6周、約8周、約12周、約16周 等)的間隔給予多個劑量。
可在與其它疫苗基本相同的時間(例如在向健康護(hù)理專業(yè)人員的同一 次醫(yī)療咨詢或就診期間)，將本發(fā)明疫苗給予患者。
概述
術(shù)語"含有"包括"包含"以及"由…組成"，例如"含有"X的組 合物可僅由X組成或可包含其它物質(zhì)，例如X+Y。
術(shù)語"基本上"不排除"完全"，如"基本上不含"Y的組合物可能 完全不含Y。必要時，可從本發(fā)明定義中刪去術(shù)語"基本上"。
與數(shù)值x相關(guān)的術(shù)語"約"表示，例如x士10y。。
除非另有說明，包括混合兩種或更多種組分的步驟的方法不需要任何 特定的混合順序。因此，可以任何順序混合這些組分。有三種組分時，兩 種組分可以相互混合，然后將混合的組分再與第三種組分混合等。
將動物(特別是牛)材料用于培養(yǎng)細(xì)胞時，它們應(yīng)獲自未患傳染性海綿狀 腦病(TSE)，特別是未患牛海綿狀腦病(BSE)的來源。總之，優(yōu)選在完全不含動物來源物質(zhì)的情況下培養(yǎng)細(xì)胞。
當(dāng)某化合物作為組合物的一部分給予人體時，該化合物可被合適的前 藥所替換。
附圖簡要說明


圖1顯示不同批次的水包油乳液的鯊烯含量(mg/ml)。可接受的鯊烯含 量的三個偏離之處記為A、 B和C。
實施本發(fā)明的方式
通過混合鯊烯、司盤85、吐溫80、水和檸檬酸鹽緩沖劑制備各批次的 MF59佐劑(各50升)。各組分的混合量應(yīng)提供以下終濃度5%(體積)鯊烯、 0.5%(體積)聚山梨酯80、 0.5%(體積)司盤85和lOmM檸檬酸鹽緩沖劑。以 約700巴微流化該混合物，最終的微流化混合物通過0.2pm濾器過濾。
這些MF59批次中目標(biāo)鯊烯含量為39±3 mg/ml。圖1顯示了超過150 種不同生產(chǎn)批次中的鯊烯含量。很明顯出現(xiàn)了三個偏離目標(biāo)范圍的偏差， 記為A-C。當(dāng)研究'A，和'B，批次的生產(chǎn)設(shè)備時，發(fā)現(xiàn)相互作用室故障 導(dǎo)致濾器堵塞，也發(fā)現(xiàn)液滴大小超出這些批次的目標(biāo)上限。也觀察到'C' 批次的濾器堵塞，但其原因是采用了不合適的濾器類型，而不是相互作用 室故障。
因此，異常的鯊烯水平適合檢測各種的過濾問題，而不需要直接檢査 濾器。
應(yīng)理解，僅以舉例的方式描述了本發(fā)明，可在本發(fā)明的范圍和構(gòu)思內(nèi)進(jìn)行 修改。
參考文獻(xiàn)(通過引用將其內(nèi)容納入本文) [1] WO術(shù)14837。 Podda和Del Giudice (2003) Expert Rev Vaccines 2:197-203 。 [3] Podda (2001) Vaccine 19: 2673-2680。《疫苗設(shè)計亞基和佐劑方法》(Vaccine Design: The Subunit andAdjuvant Approach)(Powell和Newman編輯)普萊努出版社(Plenum Press) 1995 (ISBN 0-306-44867-X)。《疫苗佐劑制備方法和研究方案》(Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols)(分子醫(yī)學(xué)方法叢書第42巻(Volume 42 of Methods in Molecular Medicine series)). ISBN: 1-59259-083-7. O，Hagan編。 Rothblat等(1962) Anal Biochem 4:52-6。 Lau等(2005) Lipids 40(5):523-8。 Spanggord等(2002) J Pharm Biomed Anal 29(1-2): 183-93。 [9] Choo等(2005) Lipids 40(4):429-32。 Zambonin等(2006) Rapid Commun Mass Spectrom 20(2):325-7。 Ko等(2002) J Agric Food Chem 50(19):5343-8。 Giacometti (2001) Analyst 126(4):472-5。 Sulpice和Ferezou (1984) Lipids 19(8):631-5。 WO99/056776。 US 2007/0014805。 WO2007/080308。 Suli等(2004) Vaccine 22(25-26):3464-9。 Huckriede等(2003) Methods Enzymol 373:74-91 。 Hoffmann等(2002) Vaccine 20:3165—3170。 Subbarao等(2003) Virology 305:192—200。 Liu等(20(B) Virology 314:580—590。 Ozaki等(2004) J. Virol. 78:1851-1857。 Webby等(2004) Lancet 363:1099—1103。 WO97/37000。 Brands等(1999) Dev Biol Stand 98:93-100。 Halperin等(2002) Vaccine 20:1240-7。 Tree等(2001) Vaccine 19:3444-50。 Kistner等(1998) Vaccine 16:960-8。 Kistner等(1999) Dev Biol Stand 98:101-110。[30] Bmhl等(2000) Vaccine 19:1149-58。 Pau等(2001) Vaccine 19:2716-21。 http:〃www.atcc.org/ http:〃locus.umdnj.edu/ WO03/076601。 WO2005/042728。 WO03/043415。 Williamson等(2006) Infection and Immunity 74: 961-7。 [38] Loukas等(2005) PLoS Med 2(10): e295。 [39] EPA 0139417。 Harper等(2004) Lancet 364(9447): 1757-65。 J Toxicol Clin Toxicol (2001) 39:85-100。 Demicheli等(1998) Vaccine 16:880-884。 Stepanov等(1996) J Biotechnol 44:155-160。 Berkower等(2004) Virology 321(l):75-86。 von B認(rèn)n等(1991) Vaccine 9(7):477-84。 Vreden等(1991) Am J Trop Med Hyg 45(5):533-8。 Moelans等(1995) Mol Biochem Parasitol 72(l-2):179-92。 Stoute等(1997) N Engl J Med 336(2):86-91 。 Wunderlich和del Portillo (2000) Mol Med 6(3):238-45。 WOO 1/22992。 Hehme等(2004) Virus Res. 103(1-2):163-71。 Treanor等(1996) J Infect Dis 173:1467-70。 Keitel等(1996) Clin Diagn Lab Immunol 3:507-10。 WO2005層837。 US 6,692,468。 WO00腦47。 WO99/17820。 US 5,971,953。[59] US 4,060,082。 岡EPA 0520618。 [61] WO98/01174。 Gennaro (2000)《雷明頓藥學(xué)科學(xué)和實踐》(Remington: The Science and Practice of Pharmacy).第20版，ISBN: 0683306472。 [63] Banzhoff (2000) Immunology Letters 71:91-96。 [64] WO02/097072。 Nony等(2001) Vaccine 27:3645-51 。 Greenbaum等(2004) Vaccine 22:2566-77。 Zurbriggen等(2003) Expert Rev Vaccines 2:295-304。 Piascik (2003) J Am Pharm Assoc (華盛頓特區(qū)).43:728-30。 Mann等(2004) Vaccine 22:2425-9。 Halperin等(1979) Am J Public Health 69:1247-50。 Herbert等(1979) J Infect Dis 140:234-8。 Chen等(20Q3) Vaccine 21:2830-6。
權(quán)利要求
1. 一種生產(chǎn)水包油乳液佐劑的方法，所述方法包括以下步驟(i)用已知量的水性載體、表面活性劑和鯊烯制備亞微米水包油乳液；(ii)對該乳液進(jìn)行過濾除菌，以提供無菌乳液；和(iii)測量該無菌乳液的鯊烯含量。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括以下步驟(iv) 將步驟(iii)中測定的鯊烯含量與步驟(i)中的已知鯊烯含量作比較。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，如果步驟(iv)中的比較揭示出 步驟(i)和(iii)的鯊烯含量明顯不同，則丟棄該佐劑。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，如果步驟(iii)中測定的含量與 步驟(i)中已知含量的差異超過±10%，則丟棄所述佐劑。
5. 如權(quán)利要求2、 3或4所述的方法，其特征在于，步驟(i)中已知的鯊烯 含量是2%至8體積％的鯊烯濃度。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(i)中已知的鯊烯含量是 4%至6體積％的鯊烯濃度。
7. —種水包油乳液佐劑的質(zhì)量控制測試方法，其中所述佐劑含有鯊烯， 所述方法包括將佐劑的實際鯊烯含量與標(biāo)準(zhǔn)鯊烯含量作比較的步驟。
8. 如前述任一項權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，如果佐劑具有可接 受的鯊烯含量，則將其與抗原混合。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗原是流感抗原。
10. —種疫苗的質(zhì)量控制測試方法，所述疫苗包含含有鯊烯的水包油乳液 佐劑，所述方法包括以下步驟(i)將所述佐劑的實際鯊烯含量與標(biāo)準(zhǔn)鯊烯含量 作比較；如果實際的鯊烯含量可接受，(ii)將所述佐劑與抗原混合以制備疫苗。
11. 如權(quán)利要求9或10所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)鯊烯含量是 2%至8體積％的鯊烯濃度。
12. 如權(quán)利要求ll所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)鯊烯含量是4%至 6體積％的鯊烯濃度。
13. 如權(quán)利要求9-12中任一項所述的方法，其特征在于，如果實際含量與 標(biāo)準(zhǔn)含量的差異超過±10%，則丟棄該佐劑。
14. 一種方法，該方法包括混合(i)流感病毒抗原和(ii)含鯊烯的水包油乳液 佐劑的步驟，所述方法還包括以下步驟在(a)混合步驟之前測定佐劑中的鯊烯 含量，和/或(b)在混合步驟之后測定抗原-佐劑混合物中的鯊烯含量。
15. 如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，將(a)或(b)中測定的鯊烯含 量與標(biāo)準(zhǔn)鯊烯含量作比較，以檢查生產(chǎn)故障。
16. 如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)鯊烯含量是2%至 8體積％的鯊烯濃度。
17. 如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)鯊烯含量是4%至 6體積％的鯊烯濃度。
18. 如權(quán)利要求15-17中任一項所述的方法，其特征在于，如果實際含量 與標(biāo)準(zhǔn)含量的差異超過±10%，則丟棄該佐劑。
19. 如權(quán)利要求14-18中任一項所述的方法，其特征在于，在(a)和(b)中均 測定鯊烯含量。
20. 如權(quán)利要求14-18中任一項所述的方法，其特征在于，在(a)中測定鯊 烯含量，而在(b)中不測定。
21. 如權(quán)利要求14-18中任一項所述的方法，其特征在于，在(b)中測定鯊 烯含量，而在(a)中不測定。
22. 如前述任一項權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述乳液是含有鯊 烯、吐溫80和司盤85的亞微米乳液。
23. 如權(quán)利要求1-21中任一項所述的方法，其特征在于，所述乳液是鯊烯、 生育酚和吐溫80的乳液。
24. 如權(quán)利要求1-21中任一項所述的方法，其特征在于，所述乳液是鯊烯、 生育酚和曲通去污劑的乳液。
25. 如權(quán)利要求1-21中任一項所述的方法，其特征在于，所述乳液是 含有鯊烯、聚氧乙烯垸基醚親水性非離子型表面活性劑和疏水性非離子型 表面活性劑的乳液。
全文摘要
通過測量水包油乳液中的鯊烯含量檢查生產(chǎn)過程中的問題。具體說，已發(fā)現(xiàn)鯊烯含量下降可能表明出現(xiàn)過濾問題。檢測最終批次中的鯊烯含量比研究濾器特性容易，因此鯊烯測定法簡化了水包油乳液的質(zhì)量控制。
文檔編號A61K39/39GK101534856SQ200780041143
公開日2009年9月16日 申請日期2007年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月8日
發(fā)明者N·克萊恩 申請人:諾華有限公司