取代的哌嗪-1,4-二酰胺類化合物在制備治療和/或預(yù)防衰老的藥中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及取代的哌嗪?1,4?二酰胺類化合物在制藥中的應(yīng)用。取代的哌嗪?1,4?二酰胺類化合物可作為SIRT1的激活劑，激動(dòng)核受體LXRα和LXRβ，調(diào)節(jié)靶蛋白ABCA1/G1的表達(dá)，促進(jìn)脂質(zhì)和膽固醇外排，調(diào)節(jié)炎癥關(guān)鍵蛋白p65的表達(dá)、調(diào)節(jié)衰老相關(guān)基因p66shc等的表達(dá)，發(fā)揮對(duì)膽固醇代謝、炎癥相關(guān)以及衰老基因或蛋白的調(diào)節(jié)作用，用于治療心腦血管疾病、調(diào)節(jié)血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化病癥、抗炎癥反應(yīng)以及抗衰老疾病。
【專利說(shuō)明】取代的脈瞎-1，4-二醜胺類化合物在制備治療和/或預(yù)防衰老 的藥中的應(yīng)用
[0001 ]本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?01410224804.X、發(fā)明名稱為"取代的贓嗦-1,4-二酷胺類化合 物在制藥中的應(yīng)用"的專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明設(shè)及取代的贓嗦-1,4-二酷胺類化合物的用途，尤其設(shè)及在制備治療和/或 預(yù)防衰老的藥中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003] 遺傳因素、飲食和老齡化對(duì)于體內(nèi)膽固醇和脂肪的內(nèi)穩(wěn)態(tài)均有一定的影響。越來(lái) 越多的研究表明，通過(guò)熱量限制（calorie res化iction,CR)降低甘油Ξ醋、總膽固醇和低 密度脂蛋白膽固醇，增加高密度脂蛋白膽固醇，可W延緩衰老，降低屯、血管疾病的發(fā)病率。 CR是唯一被科學(xué)界普遍公認(rèn)的一種能夠在酵母、蠕蟲(chóng)、果蛹W及哺乳類動(dòng)物中延長(zhǎng)壽命的 調(diào)控手段。據(jù)報(bào)道，CR是通過(guò)調(diào)節(jié)沉默信息調(diào)節(jié)因子2(silent information regulator 2, Sir2)信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮作用的，并具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎、抗衰老、氧化應(yīng)激、抗調(diào)亡、調(diào) 節(jié)能量代謝、屯、腦血管保護(hù)、血脂調(diào)節(jié)等作用。
[0004] Sir2是一類首先在酵母菌中發(fā)現(xiàn)的通過(guò)染色體沉默機(jī)制和細(xì)胞能量代謝機(jī)制調(diào) 節(jié)細(xì)胞壽命的重要基因，具有組蛋白去乙酷化酶活性，與多種細(xì)胞的衰老密切相關(guān)。哺乳動(dòng) 物Siruins家族共包括7個(gè)蛋白，分別命名為SIRT1-7,其中SIRT1和酵母Sir2同源性最高，目 前也被研究最多。它一方面通過(guò)修飾組蛋白，去乙酷化化K26、H3K9和H4K16,維持染色質(zhì)處 于沉默狀態(tài)和基因組穩(wěn)定；另一方面通過(guò)去乙酷化眾多非組蛋白，參與調(diào)控細(xì)胞的能量代 謝、增殖、調(diào)亡、衰老和腫瘤發(fā)生。SIRT1的去乙酷化底物有p53蛋白、叉頭轉(zhuǎn)錄因子 (forkhead-0-box transcription factors ,F0X0s)、過(guò)氧化物酶增殖激活受體丫共激活因 子-1口（peroxisome-proliferated activated receptor c coactivator,PGC-1口）、固酉享調(diào) 節(jié)元件結(jié)合蛋白（sterol regulatoiT element binding protein,SREBP-lc)W及肝X受 體（liver X receptor,LXR)等。
[0005] LXRs是核受體家族中的一員，受配體激活時(shí)，能夠促進(jìn)膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)膽 汁內(nèi)膽固醇的分泌，抑制腸內(nèi)膽固醇的吸收，在維持細(xì)胞內(nèi)和機(jī)體膽固醇穩(wěn)態(tài)中具有十分 重要的意義，在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用。所謂膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)，即：將膽 固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，由肝臟代謝或W膽汁的形式排出，該過(guò)程是防止過(guò)量的膽固醇在周圍組 織蓄積的一個(gè)重要生理過(guò)程。文獻(xiàn)報(bào)道，SIRT1與LXRs相互作用并使其發(fā)生去乙酷化化XRa 的43 2位賴氨酸、LX祕(mì)的43 3位賴氨酸)而激活，調(diào)節(jié)LXRs下游祀基因的表達(dá)，在SIRT1基因缺 失小鼠體內(nèi)，膽固醇含量顯著升高。
[0006] SIRT1對(duì)屯、血管疾病的發(fā)生發(fā)展具有一定的保護(hù)作用。最早研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1-方 面去乙酷化血管內(nèi)皮細(xì)胞中的一氧化氮合酶(eNOS)，活化eNOS抑制血管緊張素受體AT1;另 一方面，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的衰老，延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。隨后研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1通過(guò)去 乙酷化用，活化LXRs和FXR(fa;rnesoid X rec巧tor)調(diào)節(jié)脂類和膽固醇代謝，促進(jìn)高密度脂 蛋白與膽固醇結(jié)合，減少膽固醇沉積，調(diào)節(jié)血脂水平，影響動(dòng)脈粥樣硬化的形成。此外， SIRT1還可W抑制血管緊張素受體AT1的表達(dá)，預(yù)防屯、臟的病理肥大。SIRT1能夠調(diào)節(jié)肝臟糖 類代謝和脂肪代謝。在短期禁食小鼠肝臟中，敲除SIRT1基因會(huì)導(dǎo)致肝臟脂肪酸β氧化基因 的表達(dá)降低。
[0007] 一系列體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SIRT1對(duì)炎癥基因表達(dá)及組織炎性損傷具有顯著的抑 制效應(yīng)。在SIRT1基因敲除的小鼠 RAW264.7巨隧細(xì)胞，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS)誘 導(dǎo)的核因子KB(nuclear factorKB，NF-KB)激活及TNF-a、化-1β、化-6等多種促炎細(xì)胞因子 的表達(dá)顯著增高。越來(lái)越多研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中不僅含有脂質(zhì)，而且有大量炎癥 細(xì)胞浸潤(rùn)，W血管壁積聚大量的單核細(xì)胞和淋己細(xì)胞為特征，運(yùn)提示炎癥在介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣 硬化發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的地位，也體現(xiàn)了 SIRT1、動(dòng)脈粥樣硬化W及炎癥之間的內(nèi)在聯(lián)系與 重要作用。
[000引式1是已知的在贓嗦-1,4-二酷胺類化合物表達(dá)式
[0009]
[0010] 上述式1的贓嗦-1,4-二酷胺中R1和R2可W分別是表1所示的取代基。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的是提供取代的贓嗦-1,4-二酷胺類化合物的新用途，即在制藥中的 應(yīng)用。
[0012] 具體地，本發(fā)明設(shè)及取代的贓嗦-1,4-二酷胺類化合物作為制備治療和/或預(yù)防動(dòng) 脈粥樣硬化疾病的藥中的應(yīng)用。
[0013] 設(shè)及取代的贓嗦-1,4-二酷胺類化合物作為制備治療和/或預(yù)防屯、腦血管疾病的 藥中的應(yīng)用。
[0014] 設(shè)及取代的贓嗦-1,4-二酷胺類化合物在制備治療和/或預(yù)防調(diào)節(jié)血脂的藥中的 應(yīng)用。
[0015] 設(shè)及取代的贓嗦-1,4-二酷胺類化合物在制備治療和/或預(yù)防炎癥反應(yīng)的藥中的 應(yīng)用。
[0016] 設(shè)及取代的贓嗦-1,4-二酷胺類化合物在制備治療和/或預(yù)防衰老的藥中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明的取代的贓嗦-1,4-二酷胺類化合物可W其本身給藥，或者W藥物組合物 的形式給藥。本發(fā)明的藥用組合物包括有效劑量的本發(fā)明化合物或其可藥用鹽W及一種或 多種生理學(xué)上接受的可藥用載體。
[0018] 本發(fā)明的藥物組合物可按常規(guī)方式配制，使用一種或多種生理學(xué)上可接受的載 體、賦形劑和助劑，有利于將活性化合物加工成可藥用制劑。適當(dāng)?shù)闹苿┤Q于所選擇的給 藥途徑，可W按照本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行制備。
[0019] 本發(fā)明的取代的贓嗦-1,4-二酷胺類化合物或其藥用鹽可W通過(guò)各種給藥途徑或 方式釋放至患者。適合的給藥途徑包括但不限于吸入、透皮、口服、直腸、經(jīng)粘膜、腸內(nèi)和腸 胃外給藥，腸胃外給藥包括肌內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi)注射。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1是白襲蘆醇在SIRT1激活劑篩選模型上激活活性量效曲線。
[0021] 圖2是小分子化合物抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎、抗衰老、調(diào)血脂的作用示意圖。
[0022] 圖3是化合物（I)胞內(nèi)去乙酷化功能活性驗(yàn)證。其中，圖3中a為化合物（I)作用后 U20S細(xì)胞內(nèi)p53和Ac-p53的蛋白印跡圖；圖3中b為蛋白灰度定量圖。
[0023] 圖4是化合物（I)與SIRT1蛋白分子間相互作用，具體是E123與SIRTI-N-CC-C蛋白 相互作用傳感圖。
[0024] 圖5是化合物（I)對(duì)LXRs去乙酷化程度的影響。其中，圖5中a為化合物（I)作用后 HepG2細(xì)胞內(nèi)乙酷化LXRs (具體為L(zhǎng)XRa、LXRi3)的蛋白印跡圖；圖5中b為蛋白灰度定量圖。
[002引圖6是化合物（I)激動(dòng)LXRs活性量效曲線。
[0026] 圖7是化合物(I)調(diào)節(jié)ABCA1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性。
[0027] 圖8是化合物（I)調(diào)節(jié)RAW264.7細(xì)胞中ABCA1和ABCG1蛋白表達(dá)。其中，圖8中a為化 合物(I)作用后RAW264.7細(xì)胞內(nèi)ABCA1和ABCG1的蛋白印跡圖；圖8中b為蛋白灰度定量圖。 [00%]圖9是化合物（I)調(diào)節(jié)化pG2細(xì)胞內(nèi)ABCG5/G8蛋白。其中，圖9中a為化合物（I)作用 后HepG2細(xì)胞內(nèi)ABCG5和ABCG8的蛋白印跡圖；圖9中b為ABCG5蛋白灰度定量圖；圖9中C為 ABCG8蛋白灰度定量圖）
[0029] 圖10是化合物（I)促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞膽固醇外排。其中，圖10中a為化合物（I)促進(jìn) RAW264.7細(xì)胞內(nèi)皿L介導(dǎo)的膽固醇外排；圖10中b為化合物（I)促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)Apo-AI 介導(dǎo)的膽固醇外排。
[0030] 圖11是化合物（I)抑制巨隧細(xì)胞泡沫化油紅0染色鏡檢照片。其中，a是空白細(xì)胞 (不加 Ox-LDL);b是溶劑對(duì)照（80μg/ml Ox-LDL); C是ΙΟμΜ化合物（I )+80μg/ml Ox-LDL;d是 陽(yáng)性對(duì)照（ΙΟμΜ 9CRA+80μg/ml Ox-LDL)。
[0031 ]圖12是化合物(I)對(duì)RAW264.7胞內(nèi)總膽固醇含量的影響。
[0032] 圖13是化合物（I)抑制炎癥關(guān)鍵蛋白p65的表達(dá)。其中，圖13中a為化合物（I)作用 后THP-1細(xì)胞內(nèi)p65的蛋白印跡圖；圖13中b為蛋白灰度定量圖。
[0033] 圖14是化合物（I)對(duì)apoE^/^小鼠主動(dòng)脈全長(zhǎng)中斑塊的影響。主動(dòng)脈全長(zhǎng)油紅染色 結(jié)果顯示，化合物（I)明顯減少apoE^/^小鼠主動(dòng)脈硬化斑塊的形成，減少膽固醇和脂質(zhì)聚 積。其中a是空白組(普通飼料）；b是模型組(高脂飲食）；c是化合物（I)20mg/kg(高脂飲食）。
[0034] 圖15是化合物（I)對(duì)apoE-/-小鼠屯、臟流出道的影響。屯、臟流出道的油紅染色結(jié)果 顯示化合物（I)能明顯減少apoE^/^小鼠屯、臟流出道中斑塊的面積和數(shù)量，減少膽固醇和脂 質(zhì)聚積。其中，a是空白組(普通飼料）；b是高脂飲食模型組;C是化合物（I)20mg/kg(高脂飲 食)。
[0035] 圖16是化合物（I)對(duì)C57化/6小鼠主動(dòng)脈衰老相關(guān)基因 p66shc、PAI-1、p21的mRNA 表達(dá)影響。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 為了更清楚地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，我們首先對(duì)取代的贓嗦-1,4-二酷胺類化合物 激活SIRTl的活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1中可W看出，取代的贓嗦-1，4-二酷胺類化合 物具有不同程度的激活SIRT1的活性。下面W標(biāo)號(hào)巧123Γ的取代的贓嗦-1,4-二酷胺類化 合物(簡(jiǎn)稱為化合物（I))的病理試驗(yàn)和結(jié)果來(lái)深入說(shuō)明取代的贓嗦-1,4-二酷胺類化合物 在制藥中的應(yīng)用。
[0037] 首先，借助大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功獲得目的蛋白SIRT1?；诰鄷r(shí)間分辨巧光技 術(shù)，利用有活性的蛋白建立高通量SIRT1激活劑篩選模型，模型優(yōu)化后，利用已知公認(rèn)的陽(yáng) 性藥白襲蘆醇對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，ECso值與文獻(xiàn)報(bào)道相符，見(jiàn)圖1，表明所表達(dá)的蛋白是高活性 的目的蛋白，并且篩選模型是可信的。對(duì)組合化合物庫(kù)（國(guó)家新藥(微生物)篩選實(shí)驗(yàn)室)進(jìn) 行活性物質(zhì)篩選，獲得數(shù)個(gè)活性化合物，并測(cè)定所有化合物對(duì)SIRT1蛋白的激活作用。選擇 代表性活性化合物（I)進(jìn)行了進(jìn)一步的活性研究，在細(xì)胞水平上證實(shí)了化合物（I)能夠使得 SIRT1蛋白的祀蛋白p53的去乙酷化程度增加，確實(shí)是SIRT1蛋白的激活劑。在表面等離子共 振實(shí)驗(yàn)中測(cè)得了化合物（I)與蛋白SIRT1之間的Kd值為9.61μΜ。最后，對(duì)化合物（I)進(jìn)行了分 子藥理學(xué)方面的研究，發(fā)現(xiàn)化合物（I)能夠使LXRs的去乙酷化程度增加，激動(dòng)核受體LXRa和 LXRi3，調(diào)節(jié)祀蛋白ABCA1 /G1的表達(dá)，促進(jìn)胞內(nèi)膽固醇外排，抑制巨隧細(xì)胞泡沫化，上調(diào) ABCG5/G8表達(dá)，促進(jìn)膽固醇分泌。探討了化合物(I)對(duì)泡沫細(xì)胞內(nèi)炎癥因子相關(guān)代謝通路的 作用，發(fā)現(xiàn)其能夠抑制炎癥轉(zhuǎn)錄因子NF-kB關(guān)鍵蛋白p65的表達(dá)。研究了化合物（I)對(duì)小鼠 主動(dòng)脈衰老相關(guān)基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)其能夠抑審虹66shc、PAI-l、p21的mRNA表達(dá)。
[0038] 因此，W化合物（I)為代表的取代的贓嗦-1,4-二酷胺類化合物可作為SIRT1的激 活劑，發(fā)揮對(duì)膽固醇代謝、炎癥、衰老相關(guān)疾病的基因的調(diào)節(jié)作用(見(jiàn)圖2)，可用于動(dòng)脈粥樣 硬化、炎癥、衰老、屯、腦血管等疾病預(yù)防和/或治療。
[0039] 實(shí)施例1.取代的贓嗦-1,4-二酷胺類化合物對(duì)SIRT1激活活性的測(cè)定
[0040] 1)蛋白表達(dá)
[0041 ]首先，從質(zhì)粒PCDNA3.1-SIRT1 (中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所劉德培教授課題 組饋贈(zèng))擴(kuò)增獲得了人SIRT1的催化域及包含N端、C端部分序列的cDNA，與克隆載體地lunt- Simple Vector連接測(cè)序正確后，與大腸桿菌表達(dá)載體祀T-30a( + )連接，構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì) 粒命名為pET-SIRTl，轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主化21 (DE3)，挑取單克隆，測(cè)序鑒定。將測(cè)序正 確的單菌落搖瓶培養(yǎng)，在OD600值為0.6-0.別寸，加入終濃度為0.5mM的異丙基-β-D-硫代半乳 糖巧（1?了6)，15°(：，200巧111，培養(yǎng)24}1后收集菌液。用超聲波破碎菌體后12,000巧111離屯、 30min。收集上清，經(jīng)0.45μΜ濾膜過(guò)濾。采用iilCTAexplorer系統(tǒng)進(jìn)行蛋白純化工作，使用 1ml預(yù)裝柱化sTrapFF crud作為純化介質(zhì)。其原理是目的蛋白通過(guò)其N端的化s-tag與柱中 的化elating Sepharose?上的Ni2+離子藝合，進(jìn)而吸附在柱子上，而其他雜蛋白因不能與 Ni2+離子藝合，直接隨上樣緩沖液流出柱子，再用洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，從而得到高純 度的目的蛋白SIRT1。
[0042] 2)化合物對(duì)SIRT1激活活性的測(cè)定
[0043] 本活性測(cè)定采用Cisbio公司人SIRT1激活劑篩選試劑盒進(jìn)行化合物活性的測(cè)定。
[0044] 測(cè)定原理：
[0045] 檢測(cè)體系如下：重組人SIRT1蛋白，底物subs化ate-d2為巧光基團(tuán)d2標(biāo)記的p53小 膚片段，NA護(hù)為SIRT1發(fā)揮酶活性必須的輔因子，anti-acetyl-ciTptate是Eu2+標(biāo)記的穴狀 化合物。若加入的化合物對(duì)酶有激活作用，底物去乙酷化程度增加，底物與cryptate之間的 距離變遠(yuǎn)，不足w產(chǎn)生共振能量轉(zhuǎn)移，表現(xiàn)為巧光讀數(shù)降低。
[0046] 測(cè)定方法：
[0047] (1)在Reaction buffer中加入終濃度為ImM的DTT，配制成linzymatic buffer。
[004引 （2)用Enzymatic buffer依次稀釋重組蛋白、底物substrate-d2W及輔酶NA護(hù)，使 其終濃度分別為0.5mUAU、6nM、ISOiiM。
[0049] (3)用化zymatic buffer稀釋化合物至一定的濃度。
[0050] (4)依次加入化1待測(cè)化合物、2μ1ΝΑ0+、4μ1底物至384孔板，最后加入化1重組蛋 白，啟動(dòng)酶促反應(yīng)。設(shè)置不加蛋白的No en巧me組W及不加化合物的化gative con化〇1組， 每組3個(gè)平行孔。
[0化1] (5)室溫解育120min。
[0化2] (6)加入10μ1終濃度為7.5nM的Anti-acetyl-cryptate，室溫解育化或過(guò)夜，用酶 標(biāo)儀測(cè)定巧光值化X: 340nm，血:665/615nm)。
[0053] (7)計(jì)算方法：
[0化4] Ratio: (665nm/615nm)Xl〇4
[0化5]底物去乙酷化比率（％):100-(Rati〇Sample/Rati〇N。enzyme X 100)
[0化6] 上調(diào)率（％ )=去乙酷化比率Sample/去乙酷化比率Negative con付。iX 100%
[0057] 若上調(diào)率大于等于150%視為初篩陽(yáng)性，進(jìn)行下一步的復(fù)篩和量效曲線測(cè)定。
[0058] 讀取巧光讀數(shù)，根據(jù)公式計(jì)算后，W化合物濃度的對(duì)數(shù)值作為橫坐標(biāo)，底物的去乙 酷化程度為縱坐標(biāo)，用GraphPad Prism軟件擬合曲線，得ECso值及最大上調(diào)率，結(jié)果見(jiàn)表1。
[0059] 該測(cè)定結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明中取代的贓嗦-1,4-二酷胺類化合物對(duì)SIRT1具有顯著的 去乙酷化激活作用。其中，活性最好的化合物（I)最大上調(diào)率為384.09 %，ECso值為0.43ιχΜ。 由于SIRT1在參與膽固醇代謝和脂肪酸、糖類代謝等生理過(guò)程中具有重要意義，因此該結(jié)果 說(shuō)明本發(fā)明中的取代的贓嗦-1,4-二酷胺類化合物能夠通過(guò)激活SIRT1在調(diào)控設(shè)及相關(guān)生 理過(guò)程的疾病中發(fā)揮作用。
[0060] 實(shí)施例2.細(xì)胞的培養(yǎng)
[0061 ] HepG2、ABCAl-LUC Η邱G2、U20SW及皿Κ293細(xì)胞均為貼壁細(xì)胞，約4她傳代一次。 待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，棄舊培養(yǎng)基，用PBS漂洗細(xì)胞后棄掉，加適量膜酶，在室溫下消化細(xì)胞約 2min，棄消化液，立即加入含10%FBS的培養(yǎng)基，W抑制膜蛋白酶活力，用彎頭吸管反復(fù)輕輕 吹打培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞，使細(xì)胞完全脫離瓶底且吹打使之分散為單個(gè)細(xì)胞懸液。再按1:3比例接 種細(xì)胞懸液于新的細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，或棄去適量細(xì)胞懸液，然后補(bǔ)加適量完全培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱 繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件:37 °C，5 % C〇2。
[0062] 小鼠單核巨隧細(xì)胞RAW264.7為半貼壁細(xì)胞，約4她傳代一次。膜酶消化5min，按1: 4-1:6比例傳代，使用DMEM完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件:37 °C，5 % C〇2。
[0063] 人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞THP-1為懸浮細(xì)胞，約4她傳代一次。待細(xì)胞密度為(3- 5) X106個(gè)/ml時(shí)，用彎頭吸管吹打培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞，使之分散為單個(gè)細(xì)胞懸液。再按1:4比例 接種細(xì)胞懸液于新的細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，或棄去適量細(xì)胞懸液，然后補(bǔ)加適量完全培養(yǎng)基，放入培養(yǎng) 箱繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件:37 °C，5 % C〇2。
[0064] 實(shí)施例3.化合物（I)對(duì)多柔比星誘導(dǎo)的人骨肉瘤U20S細(xì)胞中乙酷化p53蛋白表達(dá) 水平的影響。
[0(?日]1)化合物處理細(xì)胞:預(yù)先將人骨肉瘤細(xì)胞U20S用含10%FBS的McCoy's 5a培養(yǎng)基 W每孔3 X 105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，37°C，5%C02條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。待細(xì)胞完全貼壁 后，吸取細(xì)胞液，換為空白McCoy ' S 5a培養(yǎng)基，加入終濃度為扣Μ的鹽酸多柔比星(D0X)，10μ Μ的SIRT1特異性抑制劑EX-527 W及終濃度分別為0.1、1、ΙΟμΜ的陽(yáng)性化合物，37°C，5%C02 條件下解育化。
[0066] 2)蛋白的制備:6h后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS漂洗細(xì)胞2次，膜酶消化后用培養(yǎng) 基收集細(xì)胞，SOOrpm離屯、3min，再用PBS懸浮細(xì)胞，SOOrpm離屯、3min。每管分別加入52μ1的 RIPA細(xì)胞裂解液(每1ml裂解液中加入終濃度為l(K)μg/ml的PMSF)，于冰上裂解細(xì)胞30minD4 °C，12000 Xg離屯、20min。收集上清，用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(Thermo公司）對(duì)蛋白進(jìn)行定 量，用dd此明尋各組蛋白樣品濃度調(diào)整為化g/μL。加入一定量的5X蛋白上樣緩沖液，于沸水 浴中煮lOmin，冷卻后短暫離屯、，每孔上樣40yg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。剩余樣品于-80 °C保 存。
[0067] 3)Western blot方法測(cè)定蛋白水平:SDS-PAGE電泳后，將聚丙締酷胺凝膠和轉(zhuǎn)膜 濾紙放入轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡平衡5min"PVDF膜先浸入甲醇20s活化，再用水洗，置于轉(zhuǎn)移緩 沖液中浸泡平衡2min。用BioRad半干法轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜，設(shè)置電流5mA/cm2，恒流轉(zhuǎn)膜30min。轉(zhuǎn) 膜結(jié)束后，根據(jù)目的蛋白的大小分別剪開(kāi)后放入含5% (W/V)脫脂奶粉的1XTBST中室溫解 育化。封閉結(jié)束，用含5% (W/V)脫脂奶粉的IX TBST稀釋一抗，置于雜交袋中，室溫解育化 后，4°C解育過(guò)夜。用1XTBST洗Ξ次，每次lOmin。之后用含5%(W/V)脫脂奶粉的1XTBST稀 釋相應(yīng)二抗，置于雜交袋中，室溫解育化。從雜交袋中取出PVDF膜，用1 X TBST洗Ξ次，每次 lOmin。顯色:在膜的正面，即轉(zhuǎn)有蛋白的一面加入適量增強(qiáng)型HRP(辣根過(guò)氧化物酶)底物化 學(xué)發(fā)光液化化)A、B液的混合液(按1:1比例現(xiàn)用現(xiàn)配），立即置于凝膠成像儀中顯色。
[0068] 4)顯色結(jié)果，用ImageJ軟件進(jìn)行掃描，定量處理。結(jié)果見(jiàn)圖3。
[0069] 多柔比星化oxorubicin，D0X)可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生DNA損傷，使得p53蛋白的382位賴氨 酸發(fā)生乙酷化。為了驗(yàn)證化合物在胞內(nèi)的去乙酷化功能并且考察功能作用的發(fā)揮對(duì)SIRT1 的依賴性，加入SIRT1特異性抑制劑EX-527。隨著化合物（I)濃度的升高，乙酷化p53蛋白的 表達(dá)量隨濃度梯度明顯降低，而細(xì)胞內(nèi)總的p53蛋白的量沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明p53蛋白去乙 酷化程度增加了。加入SIRT1蛋白的特異性抑制劑EX-527，Ac-p53蛋白的表達(dá)量又增加了。 因而本發(fā)明闡述了化合物（I)對(duì)胞內(nèi)SIRT1底物去乙酷化作用有明顯的上調(diào)作用，并且運(yùn)一 作用依賴于SIRT1。
[0070] 實(shí)施例4.化合物(I)與SIRT1蛋白的分子間相互作用力測(cè)定
[0071] 本測(cè)定體系中所用的緩沖液溶液組成為:皿陽(yáng)S lOmmol/L，化C1 150mmol/L，DTT lmmol/L，NAD+lmmol/L，甘油 10% (V/V)，DMS0 2% (V/V)。緩沖液W及樣品均由0.45皿濾膜 過(guò)濾，使用前超聲去除氣泡。由Biacore T200 System(GE Healthcare)儀器完成。
[0072] 測(cè)定方法：
[0073] 1)忍片表面的預(yù)處理:取出maintenance忍片，更換為CM5忍片，選擇Prime，用緩沖 液沖洗忍片表面。選擇Normalize，采用Biacore標(biāo)準(zhǔn)化試劑（BIA normalizing solution 70%)對(duì)CM5忍片進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。使用兩個(gè)忍片通道進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)SIRTl蛋白包被所需要的pH 值條件進(jìn)行摸索（immobilization pH-scouting for pre-concentration)。首先選擇3.5< pH<pI ASIRTl)范圍內(nèi)的pH的醋酸鋼溶液進(jìn)行預(yù)富集，根據(jù)預(yù)富集結(jié)果，選擇抑4.0醋酸鋼 溶液稀釋蛋白至50μg/ml，進(jìn)行偶聯(lián)。設(shè)置流速為ΙΟμΙ/min，結(jié)合時(shí)間為2min，最后W50mM的 NaO取中洗忍片表面20s去除殘留的SIRT1蛋白。
[0074] 2)蛋白包被忍片表面:將抓C/NHS等體積混合，W ΙμL/min的流速進(jìn)樣lOmin，對(duì)CM5 忍片表面簇基進(jìn)行活化。按照忍片表面預(yù)處理的摸索結(jié)果，選擇pH值為4.0的醋酸鋼溶液作 為緩沖液將SIRT1蛋白稀釋至50μg/ml，設(shè)置流速為ΙΟμΙ/min，結(jié)合時(shí)間為20min，并通過(guò)氨 基偶聯(lián)作用將其包被在CM5忍片的表面，設(shè)置目標(biāo)偶聯(lián)量為7000RU，同時(shí)設(shè)定一個(gè)空白通道 作為對(duì)照通道。進(jìn)樣結(jié)束后，加入乙醇胺，Wl〇yl/min的流速進(jìn)樣10min，W封閉忍片表面未 結(jié)合氨基的活性簇基位點(diǎn)，最終偶聯(lián)結(jié)果為7056 RU。
[0075] 3)加入化合物（I)進(jìn)行結(jié)合檢測(cè):對(duì)于SIRT1包被的CM5忍片，將不同濃度的化合物 (0、0.39、1.56、3.12、6.25、12.扣M)依次進(jìn)樣，使化合物W30μl/min的流速流經(jīng)忍片表面， 結(jié)合時(shí)間設(shè)置為60s，解離時(shí)間為120s之后，摸索忍片表面的再生條件，發(fā)現(xiàn)化合物在一定 時(shí)間內(nèi)可W完全自然解離。
[0076] 由圖4,通過(guò)RU值的變化可見(jiàn)化合物（I)能夠W劑量依賴的方式與人重組SIRT1結(jié) 合，Kd值為9.61μΜ。小分子與蛋白結(jié)合的Kd值一般為10-3至10-6Μ，因此，化合物（I)與蛋白 SIRT1之間具有很強(qiáng)的親和力。
[0077] 實(shí)施例5.化合物(I)對(duì)LXRs去乙酷化程度的測(cè)定
[0078] 為了考察化合物對(duì)LXRs去乙酷化程度的影響，我們利用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn) 證。
[0079] 本實(shí)驗(yàn)采用化pG2細(xì)胞，將其鋪于直徑為90mm大培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞完全貼壁后，分 別加入ΙΟμΜ的化合物（I)，設(shè)置溶劑對(duì)照孔，處理細(xì)胞20至2地。提取細(xì)胞核蛋白，分別與LXR 曰和LX祕(mì)抗體W及Protein A/G agarose beads共同在4°C條件解育地，洗涂beads,煮樣，用 acetylated-Lys抗體來(lái)進(jìn)行western blot檢測(cè)。曝光后的膜用膜再生液按北京普利來(lái)基因 技術(shù)有限公司的實(shí)驗(yàn)步驟再生后，再用相應(yīng)的LXI?s抗體檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)圖5。
[0080] 從圖5可W看出，加入化合物（I)后，LXRa和LX祕(mì)的表達(dá)量基本恒定，乙酷化LX地的 表達(dá)量有一定程度的下降，然而，乙酷化LXRa的表達(dá)量下降顯著，表明SIRT1激活劑化合物 (I)能夠調(diào)節(jié)肝細(xì)胞中LXRa和LX祕(mì)的乙酷化水平。
[0081 ] 實(shí)施例6.化合物(I)對(duì)LXRs激動(dòng)活性的測(cè)定
[0082]本活性測(cè)定采用LXRs的激動(dòng)劑篩選模型進(jìn)行化合物活性的測(cè)定。
[00削測(cè)定原理：
[0084]本檢測(cè)的原理是，根據(jù)LXRs結(jié)構(gòu)中的兩個(gè)主要結(jié)構(gòu)域:配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域化BD)和 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)，W及酵母中轉(zhuǎn)錄因子GAL4具有核受體相似結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，應(yīng)用酵母雙 雜交的原理，分別構(gòu)建兩個(gè)質(zhì)粒:pBIND-LXRs質(zhì)粒含有GAL4基因的D抓部分和LXRs的L抓結(jié) 構(gòu)域，可W在受到配體激活時(shí)改變構(gòu)象；另一個(gè)質(zhì)粒是PGL4-GAL4，含有GAL4基因啟動(dòng)子區(qū) 域反應(yīng)元件的巧光素酶報(bào)告基因 Luc。本發(fā)明將兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至肥K293細(xì)胞中，W研究化 合物對(duì)LXRs的激活作用。在該檢測(cè)體系中，化合物如果能夠激活LXRs,表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)的LXRs 蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，與報(bào)告質(zhì)粒相結(jié)合，此時(shí)化合物組巧光素酶的表達(dá)活性高于未加化合 物的對(duì)照組;反之當(dāng)化合物對(duì)LXRs無(wú)活性時(shí)，則LXRs蛋白構(gòu)象不發(fā)生改變，不與報(bào)告質(zhì)粒相 結(jié)合，那么化合物組巧光素酶的表達(dá)活性不產(chǎn)生變化。
[00化]測(cè)定方法：
[00化]1)在96孔板進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前一天，皿K293細(xì)胞鋪板，密度為1.5-3. ο X ΙΟ5個(gè)/ml 細(xì)胞。待肥K293細(xì)胞長(zhǎng)至90%匯合并且其生長(zhǎng)狀態(tài)良好，按照25μ1/孔化ti-MEM培養(yǎng)基稀釋 〇.5μ1 脂質(zhì)體Lipofectamine ? 2000 Reagent,室溫解育5miru2扣1/孔Opti-MEM培養(yǎng)基稀 釋200ng質(zhì)粒DNA，包括PGL4-GAL4和pBIND-LXRa/β，后與稀釋脂質(zhì)體合并混勻，室溫解育 20min〇
[0087] 2)將合并后的DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物溶液按照每孔10化1加入MEM完全培養(yǎng)基，使培養(yǎng) 基與DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物充分混勻，此時(shí)將細(xì)胞板中的培養(yǎng)基吸去，將混合后的細(xì)胞培養(yǎng) 液-DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物溶液加到96孔板中，每孔15化1。將96孔板置于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)37 Γ。
[0088] 3)培養(yǎng)化，吸出轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，將化合物（I)從40μΜ的最高濃度開(kāi)始，W 2倍濃度梯度 逐級(jí)稀釋成8個(gè)濃度，同時(shí)陰性對(duì)照孔加入0.1%的DMS0,分別處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)1她。
[0089] 4) 1化后，吸出96孔板每孔中的培養(yǎng)基。每孔加入15化1 PBS輕輕漂洗細(xì)胞，翻轉(zhuǎn)96 孔板倒掉PBS并甩干。每孔中加入20μ1 1X(XLR細(xì)胞裂解液，37°C裂解細(xì)胞20-30min(根據(jù) 細(xì)胞數(shù)目多少確定時(shí)間），在顯微鏡下觀察細(xì)胞是否完全裂解。將裂解液全部轉(zhuǎn)移至巧光分 析用96孔不透明白板的相應(yīng)孔內(nèi)，注意裂解液盡量避免氣泡，否則會(huì)使影響讀數(shù)(如果使用 96孔透明底白板則不需要將裂解液轉(zhuǎn)移）。
[0090] 5)在每孔中迅速加入50μ1巧光分析試劑(Promega公司），立即將分析白板放入酶 標(biāo)儀中檢測(cè)。
[0091] 6)用如下方程計(jì)算待測(cè)樣品對(duì)巧光素酶活性的改變率：
[0092] 改變率（％)=A/BX100
[0093] 其中，A為加入待測(cè)樣品后測(cè)定的細(xì)胞巧光素酶活性(RLU)，B為加入陰性對(duì)照樣品 (DMS0)后測(cè)定的細(xì)胞巧光素酶活性(RLU)。改變率（％ )視為化合物對(duì)LXR的激動(dòng)活性，用％ 百分比表示，或者用倍數(shù)表示均可。W化合物濃度的對(duì)數(shù)值作為橫坐標(biāo)，改變率為縱坐標(biāo)， 用Gra地Pad Prism軟件擬合曲線，結(jié)果見(jiàn)圖6。
[0094] 該測(cè)定結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明中化合物（I)對(duì)LXRa/β具有顯著的轉(zhuǎn)錄激活作用，并且得 到了化合物（I)在LXRa/β激動(dòng)劑篩選模型上的量效關(guān)系曲線。從圖6可W看出，化合物（I)W 劑量依賴性方式激動(dòng)LXRa/β，對(duì)LXRa最大激動(dòng)活性為188.14 %，ECsq值為0.65μΜ;對(duì)LX祕(mì)最 大激動(dòng)活性為182.32%，EC5q值為0.0祉M。由于核受體LXR在參與膽固醇代謝和脂肪酸、糖類 代謝等生理過(guò)程匯中具有重要意義，因此該結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明中的化合物（I)能夠通過(guò)激動(dòng) LXR的轉(zhuǎn)錄在調(diào)控設(shè)及相關(guān)生理過(guò)程的疾病中發(fā)揮作用。
[0095] 實(shí)施例7.化合物(I)對(duì)ABCA1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的測(cè)定
[0096] 本活性測(cè)定采用ABCA1上調(diào)劑篩選模型進(jìn)行化合物活性的測(cè)定。
[0097] 測(cè)定原理：
[0098] 本檢測(cè)的原理是，將在巧光素酶的報(bào)告基因上游克隆有ABCA1基因上游調(diào)控序列 的重組質(zhì)粒PGL3-ABCA1與PCDNA3.1共轉(zhuǎn)染至人肝癌細(xì)胞化pG2細(xì)胞，經(jīng)G418篩選得到穩(wěn)定 轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，命名為ABCA1-LUC HepG2細(xì)胞。通過(guò)加入化合物檢測(cè)細(xì)胞巧光素酶的表達(dá)活性 的變化，可W看出化合物對(duì)ABCA1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響，進(jìn)而判斷出對(duì)ABCA1的上調(diào)率。
[0099] 測(cè)定方法：
[0100] 消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ABCA1-LUC HepG2細(xì)胞，用培養(yǎng)基稀釋并細(xì)胞計(jì)數(shù)，W5X105 個(gè)/ml的密度接種至96孔板，每孔加入100μΙ單細(xì)胞懸液。6h后，待細(xì)胞充分貼壁，移去含血 清的培養(yǎng)基，用PBS輕輕漂洗細(xì)胞一次，每孔加入含不同化合物濃度的無(wú)血清RPMI-1640培 養(yǎng)基20化1，同時(shí)對(duì)照孔內(nèi)加入相應(yīng)濃度的DMS0。18-2地后移去培養(yǎng)基，按照實(shí)施例6中測(cè)定 方法(4)-(6)中所述的方法測(cè)定、計(jì)算并作圖，結(jié)果見(jiàn)圖7。
[0101] 化合物（I)W劑量依賴性地方式增加 ABCA1-LUC HepG2細(xì)胞巧光素酶活性。化合物 (I)上調(diào)ABCA1表達(dá)活性達(dá)最高值226.67%，其ECsq值為0.25μΜ。由于ABCA1在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn) 過(guò)程中具有重要意義，因此該結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明中的化合物（I)能夠增強(qiáng)ABCA1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活 性，在設(shè)及相關(guān)生理過(guò)程的疾病中發(fā)揮作用。
[0102] 實(shí)施例8.化合物（I)在RAW264.7巨隧細(xì)胞中對(duì)ABCA1和ABCG1蛋白表達(dá)水平的影 響。
[0103] 1)化合物處理細(xì)胞:小鼠單核巨隧細(xì)胞RAW264.7W4X105個(gè)/ml接種于6孔板貼壁 后，用0.1、1和ΙΟμΜ的化合物（I)處理，W濃度為0.1 %DMS0作為陰性對(duì)照組，同時(shí)設(shè)置ΙΟμΜ 的化合物（I)+ΕΧ-527組，均在37°C，5%C02條件下培養(yǎng)20-2地。
[0104] 2)Western blot方法測(cè)定ABCA1和ABCG1蛋白表達(dá)水平，并用軟件定量處理。結(jié)果 見(jiàn)圖8。
[0105] ABCA1和ABCG1是LXR直接調(diào)控的祀蛋白，二者在巨隧細(xì)胞中的主要功能都是將細(xì) 胞內(nèi)多余的膽固醇外排，促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，防止巨隧細(xì)胞中的氧化低密度脂蛋白 (Ox-LDL)蓄積造成巨隧細(xì)胞泡沫化。由圖8看出，經(jīng)過(guò)化合物（I)20-24h的作用，可W在1- ΙΟμΜ時(shí)劑量依賴地上調(diào)ABCA1和ABCG1的表達(dá)，ABCA1最大上調(diào)2.17倍，而ABCG1可達(dá)2.48倍。 因而本發(fā)明闡述了化合物（I)對(duì)巨隧細(xì)胞中促進(jìn)膽固醇外排相關(guān)蛋白有明顯的上調(diào)作用。
[0106] 實(shí)施例9.化合物（I)在化pG2細(xì)胞中對(duì)ABCG5和ABCG8表達(dá)水平的影響
[0107] 1)化合物處理細(xì)胞:預(yù)先將接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的化pG2細(xì)胞加入不同濃度的 化合物（I)處理，W濃度為0.1 % DMS0作為陰性對(duì)照組，在37 °C，5 % C〇2條件下培養(yǎng)20-24h。
[0108] 2)Western blot方法測(cè)定ABCG5和ABCG8蛋白表達(dá)水平，并用軟件定量處理。
[0109] 肝臟中ABCG5，ABCG8蛋白也是LXR下游的祀蛋白，它們受到LXR的直接調(diào)控，運(yùn)兩個(gè) 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在肝細(xì)胞小管的膜上表達(dá)，從而驅(qū)動(dòng)膽固醇向膽汁中轉(zhuǎn)運(yùn)表達(dá)，促使膽固醇分泌。 如圖9所示，本發(fā)明中化合物（I)在0 . ΙμΜ時(shí)對(duì)ABCG5的上調(diào)倍數(shù)最高，可達(dá)1.2倍左右；在 0.1 -1 ΟμΜ范圍內(nèi)劑量依賴地上調(diào)ABCG8的表達(dá)，在1 OiiM時(shí)對(duì)ABCG8上調(diào)最高可達(dá)2.2倍。說(shuō)明 化合物（I)有可能會(huì)通過(guò)上調(diào)ABCG5和ABCG8表達(dá)而促進(jìn)肝臟中膽固醇分泌。
[0110] 實(shí)施例10.化合物(I)促進(jìn)巨隧細(xì)胞膽固醇外排實(shí)驗(yàn)
[0111] 1)小鼠單核-巨隧細(xì)胞RAW264.7用含10%FBS的DMEM-高糖培養(yǎng)基(500μ1/孔），W2 X 1〇5個(gè)/孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，于37 °C，5 % C〇2條件下過(guò)夜培養(yǎng)。
[0112] 2)棄細(xì)胞液，換為含有0.2%(胖八)854的0161-高糖培養(yǎng)基(50041/孔），加入1，2- 巧]膽固醇并使其終濃度為化^/1111，37°(：，5%0)2條件下解育2地。
[0113] 3)用PBS( 1ml/孔）洗細(xì)胞2次，加入含一定濃度化合物的測(cè)定培養(yǎng)基（DMEM加入 0.2%BSA，0.1%DMS0,25mM 肥陽(yáng)S，抑7.4)，37°C解育 18~2地。
[0114] 4作85(11111知1)洗細(xì)胞2次，加入培養(yǎng)基（0161加入0.2%854,0.1%0150,251111 肥陽(yáng)S，抑7.4)，10μg/ml的apoA-I或50μg/ml的皿L，解育地。
[0115] 5川欠集培養(yǎng)基，10，000 X g離屯、5min，取上清待測(cè)。
[0116] 6)用O.IM NaOH 0.5ml室溫裂解細(xì)胞30min，收集裂解液待測(cè)。
[0117] 7)測(cè)定:將待測(cè)樣品分別轉(zhuǎn)移至3mm濾紙上，75°C烘干，將紙片放在液閃杯中，加入 10ml液閃液(質(zhì)量濃度為0.5%PP0和0.05%P0P0P)與體積分?jǐn)?shù)為55%二甲苯和45%乙二醇 二甲酸的溶劑混合配制，置于棟色容器內(nèi)存放，過(guò)夜使用，液閃計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 分為對(duì)照組(不加膽固醇但是加 apoA-I /HDL、加膽固醇)和加樣組（同時(shí)加入膽固醇、apoA- 1/皿L和一定濃度的待測(cè)樣品）。
[011引膽固醇流出率（％ )=培養(yǎng)液cpm值/總cpm值X 100%
[0119] =培養(yǎng)液cpm值/(培養(yǎng)液cpm值+細(xì)胞cpm值）X 100%
[0120] 巨隧細(xì)胞中的膽固醇外排結(jié)果如圖10所示，化合物（：〇在0.1、1、10μΜ作用下，可W 促進(jìn)1，2-[3扣膽固醇的流出到膽固醇接受體，并且隨著化合物濃度的增加，1，2-[3Η]膽固醇 流出水平也增大，流出至apoA-I的倍數(shù)在1.2-1.7倍之間，流出至HDL的倍數(shù)比至apoA-I的 倍數(shù)高，大約在1.5-2.0倍之間。該結(jié)果符合本發(fā)明前部分所述的，化合物(I)通過(guò)上調(diào)巨隧 細(xì)胞內(nèi)ABCA1和ABCG1蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的外排，符合LXR激動(dòng)劑的生理學(xué)活 性，且對(duì)于皿L作為膽固醇接受體的影響更顯著，而ABCG1主要負(fù)責(zé)將多余的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至 皿L，運(yùn)與之前所探討的化合物可W顯著上調(diào)ABCG1的蛋白和mRNA表達(dá)的發(fā)明結(jié)果一致。
[0121] 實(shí)施例11.化合物(I)抑制巨隧細(xì)胞泡沫化作用的實(shí)驗(yàn)
[0122] 小鼠的單核巨隧細(xì)胞RAW264.7用含10 % FBS的DMEM-高糖培養(yǎng)液于透明96孔細(xì)胞 培養(yǎng)板上培養(yǎng)。貼壁后，換為無(wú)血清DMEM-高糖培養(yǎng)基（100μΙ/孔）。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、 泡沫細(xì)胞組和加藥組，加入終濃度為80μg/ml的化-LDL到泡沫細(xì)胞組和加藥組，24h后，加藥 組加入一定濃度的化合物（1)。37°(：，5%〇)2條件下培養(yǎng)2地后，進(jìn)行油紅0染色。將96孔板從 0)2解箱中取出，細(xì)胞用4 %多聚甲醒固定（1扣1 /孔）lOmin，棄溶液，雙蒸水洗兩次，再加入 60%異丙醇（150μ1/孔），放置5min，棄去溶液。將油紅0使用液(現(xiàn)用現(xiàn)配，過(guò)濾）加入各孔 中，150μ1/孔，染色化。棄去溶液，用60%異丙醇（150μ1/孔)洗孔，然后用雙蒸水（150μ1/孔） 洗兩次，最后每孔加15化1雙蒸水置于顯微鏡下觀察、拍照，結(jié)果見(jiàn)圖11。
[0123] 將只加入化-U)L作為泡沫化細(xì)胞組，通過(guò)油紅0染色，在顯微鏡下觀察細(xì)胞的著色 程度。從圖11中可W看出，（a)空白組沒(méi)有紅色脂滴形成，（b)化-LDL溶劑對(duì)照組形成明顯的 紅色脂滴存在，（C)化合物（I)處理組，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)紅色油狀顆粒與對(duì)照組相比明顯減少，說(shuō) 明化合物（I)能夠減少脂質(zhì)在巨隧細(xì)胞中蓄積，有效抑制巨隧細(xì)胞泡沫化，（d)加入ΙΟμΜ 9CRA( LXRs激動(dòng)劑)細(xì)胞中脂質(zhì)積累也明顯減少。
[0124] 實(shí)施例12.化合物(I)降低胞內(nèi)總膽固醇
[0125] 利用BioVision公司膽固醇定量試劑盒推薦方法測(cè)定胞內(nèi)總膽固醇，測(cè)定方法如 下：
[0126] 1)配制膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度:0、1、2、3、4、5yg/we 11。
[0127] 2川欠集細(xì)胞，加入200μ1 邸3(：1:1口4:肥-40(7:11:01)，12,000邑室溫離屯、5111111。
[0128] 3)將上清轉(zhuǎn)移到新的ΕΡ管中，置于5(TC烘箱將液體烘干。
[01 巧]4)加入100μΙ cholesterol assay buffer溶解混合。
[0130] 5)方口入2μ1 esterase、2yl substrate mix、2yl cholesterol enzyme 44ul樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，37°C避光解育30minD450nm波長(zhǎng)下讀取光吸收值并計(jì)算。
[0131] 胞內(nèi)總膽固醇主要包括游離膽固醇和膽固醇醋，總膽固醇的量也是細(xì)胞泡沫化的 一個(gè)主要特征。由圖12看出，化合物（I)在UiM和ΙΟμΜ時(shí)降低胞內(nèi)總膽固醇含量顯著。說(shuō)明加 入的化合物能夠抑制巨隧細(xì)胞泡沫化，減少脂質(zhì)在巨隧細(xì)胞中蓄積。
[0132] 實(shí)施例13.化合物(I)對(duì)ΤΗΡ-1細(xì)胞中炎癥關(guān)鍵蛋白ρ65表達(dá)的影響
[0133] 1)化合物處理細(xì)胞:預(yù)先將接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的ΤΗΡ-1在加入終濃度50ηΜ佛 波醋ΡΜΑ誘導(dǎo)2地后，向其中加入ΙΟμΜ的E1231，37°C解育化，再加入終濃度為lOng/ml的LPS 刺激細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，繼續(xù)37 °C解育1她。
[0134] 2)Western blot方法測(cè)定p65蛋白表達(dá)水平，并用軟件定量處理。結(jié)果見(jiàn)圖13。
[0135] 熱量限制后的另一顯著特征是抑制炎癥反應(yīng)。化合物（I)作為SIRT1的激活劑，對(duì) 炎癥因子的釋放應(yīng)該具有一定的抑制作用，對(duì)于預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化有積極的意義。由圖13 可看出，化合物（I)在ΙμΜ和ΙΟμΜ時(shí)降低p65蛋白表達(dá)，最高可抑制35%。因而本發(fā)明闡述了 化合物(I)對(duì)巨隧細(xì)胞中炎癥相關(guān)蛋白有明顯的抑制作用。
[0136] 實(shí)施例14.化合物(I)在apoE-/-小鼠體內(nèi)的藥效學(xué)評(píng)價(jià)
[0137] A)apoE-/-小鼠動(dòng)脈硬化模型的構(gòu)建
[013引 l)apoE-/-小鼠，7周齡，普通飼料喂養(yǎng)一周；
[0139] 2)將apoE^/^小鼠稱體重，隨機(jī)分組，共分為3組（空白對(duì)照組、模型組、給藥組），每 組6-8只；
[0140] 3)從8周齡開(kāi)始，模型組和給藥組喂養(yǎng)高脂飼料飲食，空白組繼續(xù)喂養(yǎng)普通飼料；
[0141] 4)化合物（I)加樣組（20mg/kg)，灌胃給藥；空白對(duì)照組和模型組給簇甲基纖維素 鋼溶液，灌胃給藥;給藥4周；
[0142] 5)將給藥4周的apoE-/-小鼠禁食化;摘眼球取血，用肝素潤(rùn)洗過(guò)的EP管收集血，上 下顛倒，置于冰上，4000r/min，4°C離屯、3min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中（分兩份），置于- 20°C保存。
[0143] 6)固定小鼠，剪開(kāi)胸腔，剪去胸骨，暴露屯、臟，立即進(jìn)行屯、臟灌流，先用4%的多聚 甲醒灌入大約1ml，然后換成PBS灌入大約4ml，待肝臟變白后停止；
[0144] 7)分離自主動(dòng)脈至骼骨總分支的動(dòng)脈全長(zhǎng)，取出屯、臟和動(dòng)脈。解剖后，將屯、臟和主 動(dòng)脈放入4%的多聚甲醒中，37°C固定化，然后放入20%的薦糖溶液中，4°C過(guò)夜。
[0145] B)血脂水平的測(cè)定
[0146] 將離屯、后的血清，按照普利來(lái)生物技術(shù)有限公司試劑盒所述方法進(jìn)行測(cè)定。
[0147] C)冰凍切片的制作方法
[0148] 1)將1.5ml EP管從中部切斷，留下帶蓋的部分，將蓋子蓋上，做好標(biāo)記；
[0149] 2)將0CT包埋劑加到EP管中，注意不要有氣泡；
[0150] 3)將20%薦糖中浸泡的組織放入到0CT中，屯、臟包埋時(shí)，留大約1/3屯、臟，切平，將 屯、尖部分朝上，慢慢放入0CT中；
[0151 ] 4)將包有組織的EP管慢慢放入到液氮中；
[0152] 5)用錫紙立即包好冷凍好的EP管，-20°C避光保存，長(zhǎng)期保存放在-80°C。
[0153] D)主動(dòng)脈油紅0染色
[0154] 1)將主動(dòng)脈從20 %薦糖取出，PBS洗一次；
[0155] 2)在解剖顯微鏡下，將主動(dòng)脈縱向剖開(kāi)；
[0156] 3)將剪開(kāi)的主動(dòng)脈用蒸饋水洗3次；
[0157] 4)60 %異丙醇浸泡lOmin，進(jìn)行同步化；
[0158] 5)將同步化好的放入新配好的油紅工作液中（油紅儲(chǔ)存液配置，過(guò)濾1-化內(nèi)用）， 30min；
[0159] 6)放入60%異丙醇分色I(xiàn)min;
[0160] 7)雙蒸水洗3次；
[0161] 8)將解剖開(kāi)的主動(dòng)脈平鋪在黑蠟上，照相機(jī)立即照相。
[0162] E)冰凍切片油紅0染色（屯、臟流出道）
[0163] 1)將切片在室溫下放置30min，吹干冰凍切片；
[0164] 2)將切片放入4%多聚甲醒中，固定lOmin;
[0165] 3)棄多聚甲醒溶液，加入雙蒸水，洗3次，每次3min;
[0166] 4) 60 %異丙醇浸泡切片3min，進(jìn)行同步化；
[0167] 5)然后將同步化好的切片放入新配好的油紅工作液中（油紅儲(chǔ)存液配置，過(guò)濾1- 化內(nèi)用），30min;
[0168] 6)將切片放入60%異丙醇分色，隨時(shí)在顯微鏡下觀察；
[0169] 7)雙蒸水洗3次；
[0170] 8)蘇木精染2-3min，復(fù)染細(xì)胞核；
[0171] 9)雙蒸水洗3次后，將切片放在蒸饋水中；
[0172] 10)水性封片劑封片(9份醫(yī)用甘油+1份雙蒸水）；
[0173] 將封好的片子四周涂指甲油，陰涼處陰干，立即照相。
[0174] apoE-/-小鼠血脂水平的測(cè)定結(jié)果如表2。從表2可W看出高脂飲食喂養(yǎng)的apoE-/-小 鼠，經(jīng)化合物（I)給藥后，血脂中總膽固醇(TC)、甘油立醋巧6)、低密度脂蛋白膽固醇化0心 C)W及高密度脂蛋白膽固醇化DkC)的含量。給藥組與模型組相比，都有一定降低TC、TG、 LDkC的效果，并升高皿kC的含量。說(shuō)明化合物（I)能夠調(diào)節(jié)血脂水平。
[01巧]apoE-/-小鼠主動(dòng)脈全長(zhǎng)進(jìn)行油紅染色，結(jié)果如圖14。從圖14b可W看出，高脂飲食 模型組的整個(gè)主動(dòng)脈出現(xiàn)明顯的動(dòng)脈硬化斑塊，說(shuō)明動(dòng)脈硬化模型構(gòu)建成功。與高脂飲食 模型組相比，給藥組（圖14c)小鼠主動(dòng)脈斑塊明顯較少、減小，說(shuō)明化合物（I)能對(duì)動(dòng)脈硬化 的治療起到積極作用。
[0176] 將apoE-/-小鼠屯、臟冰凍切片結(jié)果如圖15。從圖15中可W看出，高脂飲食模型組（圖 15b)屯、臟流出道的整個(gè)主動(dòng)脈出現(xiàn)大面積的動(dòng)脈硬化斑塊，脂滴大而且密實(shí)。空白對(duì)照組 (圖15a)可W看到較小的動(dòng)脈斑塊，可能由于apoE^/^小鼠自發(fā)產(chǎn)生。與高脂飲食組相比，化 合物（I)組（圖15c)動(dòng)脈斑塊面積明顯減少。
[0177] 綜合圖14-15結(jié)果，化合物（I)能顯著減少apoE^/^小鼠主動(dòng)脈全長(zhǎng)和屯、臟流的斑塊 面積和數(shù)量。apoE-/-小鼠體內(nèi)的結(jié)果均表明化合物(I)具有良好的抗動(dòng)脈粥樣硬化效果。
[0178] 實(shí)施例15.小鼠主動(dòng)脈中衰老相關(guān)標(biāo)記分子mRNA水平檢測(cè)
[0179] A)小鼠飼養(yǎng):C57MV6小鼠，7周齡，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，清潔飲水，自由取食。陰性 對(duì)照組喂養(yǎng)簇甲基纖維素鋼，給藥組喂養(yǎng)E1231，20mg/kg，灌胃。喂養(yǎng)16周。
[0180] B)RT-PCR法檢測(cè)化合物（I)對(duì)主動(dòng)脈中p66shc、PAI-l、p21的mRNA水平
[0181] 1)RNA 的提?。?br>[0182] 將組織樣品的離屯、管從液氮罐中取出放入液氮預(yù)冷的研鉢中，加入一定量的 Trizol，用研磨棒反復(fù)研磨至均勻。按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取，并測(cè)定0〇26日和OD280 的比值，用W評(píng)價(jià)所提取RNA的質(zhì)量(OD260/OD280介于1.8-2.0即可），定量后用06?(：水將各組 RNA調(diào)整為同樣的濃度。
[0183] 2)逆轉(zhuǎn)錄-cDNA的合成
[0184] 采用Reve;rtAid? First Shand cDNA Synthesis Kit試劑盒化e;rmen1:as)進(jìn)行。 將步驟1)所得的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA(200ngAU)，于-20°C保存或繼續(xù)進(jìn)行W下的PCR反應(yīng)。
[0185] 3)RT-PCR 反應(yīng)
[0186] 將稀釋步驟2)中反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA模板（50ngAU)W及所有cDNA樣品分別配置 RT-PCR反應(yīng)體系。采用Roche的hstStart Universal SYBR Green Master(R0X)試劑盒配 審化CR反應(yīng)體系，然后將其置于RT-PCR(Biorad)儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。各組引物（Invitrogen公 司合成）分別進(jìn)行溶解曲線實(shí)驗(yàn)。各樣品的目的基因（p66shc、PAI-l、p21)和管家基因（β- actin)分別進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。根據(jù)每個(gè)樣品的目的基因的Ct值和其管家基因的Ct值來(lái)計(jì)算 調(diào)節(jié)倍數(shù)。上調(diào)倍數(shù)二2_[(祐。賄目值-祐。腳夠ct值)-(結(jié)目值-結(jié)峻ct值)]
[0187] 鼠 p66shc引物序列：
[0188] F3:5，-AAGTACAACCCACTTCGGAATGA-3 '
[01 例 R3:5 '-GGGTCCCAGGGATGAAG-3 '
[0190] 鼠 PAI-1引物序列：
[0191] F1:5 '-CTCCGAGAATCCCACACAG-3 '
[0192] R1:5 '-ACTTTGAATCCCATAGCATC-3 '
[0193] 鼠 p21引物序列：
[0194] F2:5 '-TCTCAGGGCCGAAAACGGAG-3 '
[01 巧]R2:5 '-ACACAGAGTGAGGGCTAAGG-3 '
[0196] 鼠 β-actin引物序列：
[0197] F4:5 '-CCTTCCTTCTTGGGTATGGAATC-3 '
[0198] R4:5 '-AGCACTGTGTTGGCATAGAGGT-3 '
[0199] 由圖16與簇甲基纖維素鋼對(duì)照小鼠相比，化合物（I)喂養(yǎng)的小鼠，主動(dòng)脈中 p66化C、PAI-1、p2 ImRNA水平明顯下降。說(shuō)明了化合物（I)在體內(nèi)具有延緩血管老化、抗衰老 的作用。
[0200] 表1不同取代基的化合物及活性
[0201]

[0205] (#表示模型組與空白組相比胖<0.05，*表示給藥組與模型組相比沖<0.05)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.取代的哌嗪-I，4-二酰胺類化合物在制備治療和/或預(yù)防衰老的藥中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K31/495GK105878247SQ201610251822
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2014年5月26日
【發(fā)明人】司書(shū)毅, 馮婷婷, 許艷妮
【申請(qǐng)人】中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所