用于癌癥的治療劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及幫助治療腫瘤和病毒感染性疾病W及預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)及病毒誘 導(dǎo)的腫瘤發(fā)生的疫苗，W及設(shè)及用于制備該疫苗的佐劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 已經(jīng)進(jìn)行了為了試驗(yàn)?zāi)康牡膽?yīng)用HLA I類(lèi)結(jié)合膚對(duì)腫瘤的膚免疫治療。然而，從目 前獲得的膚免疫治療結(jié)果判斷，預(yù)期單獨(dú)給藥腫瘤抗原膚并不那么有效(就所設(shè)及的過(guò)去 的報(bào)告而言，沒(méi)有一例在RECIST評(píng)價(jià)中SD的比值超過(guò)10% )(非專利參考文獻(xiàn)1、3)。
[0003] 因此，為了刺激細(xì)胞毒性的T淋己細(xì)胞(CTL)，廣泛地使用了一種方法，其中給藥被 弗氏不完全佐劑(FIA)乳化的膚(非專利參考文獻(xiàn)1-3)。如從MHC四聚體陽(yáng)性CD8 T細(xì)胞或分 泌IFN-丫的細(xì)胞的增加所證實(shí)的那樣，懸浮于FIA中的膚允許膚特異性的T細(xì)胞增殖。然而， 已經(jīng)增殖的CD8 T細(xì)胞不太可能作為效應(yīng)子被完全地活化;它們的治療效果受到了限制(非 專利參考文獻(xiàn)4-6)。在一些情況下，懸浮在FIA中的膚甚至能夠引起抗原特異性的免疫耐受 (非專利參考文獻(xiàn)7)。存在使患者的QOL顯著惡化的另一問(wèn)題，因?yàn)镕IA在皮膚下長(zhǎng)期存在， 并且還因?yàn)榍鹫畛掷m(xù)約2年，并且當(dāng)給藥次數(shù)增加時(shí)皮膚硬化進(jìn)展，盡管在1-2個(gè)月內(nèi)發(fā)紅 會(huì)消失。
[0004] 為了增加膚免疫原性，在臨床研究中測(cè)試了許多佐劑。應(yīng)用運(yùn)些佐劑的目的是通 過(guò)活化抗原呈遞細(xì)胞(APC)和/或輔助T細(xì)胞(Th)從而提供具有抗炎性環(huán)境的CTL。將樹(shù)狀細(xì) 胞用作膚的抗原呈遞細(xì)胞，W誘導(dǎo)更好的腫瘤控制(非專利參考文獻(xiàn)3、8)。已經(jīng)引入了非甲 基化的去氧-CpG、Toll樣受體配體(非專利文獻(xiàn)9)和活化APC的配體，例如Flt3(非專利文獻(xiàn) 10)。就輔助細(xì)胞活性而言，Thl型反應(yīng)誘導(dǎo)最佳的細(xì)胞免疫(非專利文獻(xiàn)11、12)。由化細(xì)胞 和其它免疫增強(qiáng)細(xì)胞分泌的重組細(xì)胞因子被用于臨床研究中。運(yùn)些細(xì)胞因子包括IL-2(非 專利文獻(xiàn)13)、GM-CSF(非專利文獻(xiàn)8)、IFN-a(非專利文獻(xiàn)14)和IL-12(非專利文獻(xiàn)15)。由于 可獲得GMP(Good Manu化Cturing Practice)級(jí)別的商業(yè)化產(chǎn)品，細(xì)胞因子允許容易地進(jìn)行 試驗(yàn)治療。然而，運(yùn)些只能替代一些免疫反應(yīng)，并且主要只刺激APC或化細(xì)胞。此外，細(xì)胞因 子的生物半衰期是很有限的。
[0005] 為了在更自然的條件下活化APC和化細(xì)胞兩者，開(kāi)發(fā)了結(jié)核桿菌細(xì)胞壁骨架(BCG-CWS)的用途(非專利參考文獻(xiàn)16)。然而，BCG-CWS有效地活化細(xì)胞免疫，因此無(wú)法避免開(kāi)口 性潰瘍的發(fā)生。因?yàn)檫\(yùn)一原因，BCG-CWS不能在免疫力降低的患者，例如白血病患者中使用。 BCG-CWS也難W在重復(fù)接種中使用。由于膚易于被血清中的蛋白酶分解，除了與細(xì)胞表面上 的MHC分子結(jié)合的那些外，將在數(shù)天內(nèi)消失，因此需要頻繁地免疫?；旧蠎?yīng)答原本為免疫 耐受對(duì)象的腫瘤自身抗原蛋白質(zhì)的T細(xì)胞很可能喪失活性;其細(xì)胞毒活性會(huì)變?nèi)?，除非每?給藥一次。因此，由于難W重復(fù)地給藥，作為腫瘤免疫治療的佐劑，BCG-CWS是有嚴(yán)重缺陷 的。 非專利參考文獻(xiàn)I: Rosenberg，S. A.等人，Nat.Med.，vol. 10，P. 909-915(2004) 非專利參考文獻(xiàn) 2: Oka, Y.等人，Proc.化 tl. Acad. Sci. USA, vol. 101，p. 13885-13890 (2004) 非專利參考文獻(xiàn)3:Mosolits，S.等人，Ann.Oncol.，vol. 16，p.847-862(2005) 非專利參考文獻(xiàn)4: Nagorsen，D.等人，Cl in. Cancer Res.，vol. 12，P. 3064-3069 (2006) 非專利參考文獻(xiàn)5:Nencioni，A.等人，Ann.Oncol.，vol.l5，p. 153-160(2004) 非專利參考文獻(xiàn)6:Rome;ro，P.等人，化ncer Immunol. Immunother.，vol .53，p.249-255 (2004) 非專利參考文獻(xiàn) 7 Joes, R.E.M.等人，Proc.化 tl. Acad. Sci. USA, vol. 93，p. 7855-7860 (1996) 非專利參考文獻(xiàn)8:Slingluff，C丄.等人，J.Clin.Oncol.，卷21，p.4016-4026(2006) 非專利參考文獻(xiàn)9:Speiser，D.E.等人，J.Clin. Invest.，卷 115，p.739-746(2005) 非專利參考文獻(xiàn) 10: Fong, L.等人，Proc.化 tl. Acad. Sci. USA,卷 98, p. 8809-8814 (2001) 非專利參考文獻(xiàn)11:化Ilarino，F(xiàn).等人，J Immunol，卷165,P.5495-5501 (2000) 非專利參考文獻(xiàn) 12:Dredge，K.等人，Cancer Immunol. Immunother.，卷51 ,P.521-531 (2002) 非專利參考文獻(xiàn) 13:Rosenberg，S.等人，Nat.Med.，卷4，p.321-327( 1998) 非專利參考文獻(xiàn) 14:Di 化cchio，T.等人，Cancer Res.，卷66，p.4943-4950(2006) 非專利參考文獻(xiàn) 15 :Peterson，A.等人，J. Clin. Oncology,卷 21，p. 2:342-2348(2006) 非專矛ij參考文南犬 16:Nak曰jim曰，H.等人，Cancer Immunol. Immunother .，卷53:，p. 617- 624(2004)

【發(fā)明內(nèi)容】
本發(fā)明要解決的問(wèn)題
[0006] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于癌抗原膚或病毒抗原膚疫苗的佐劑，其中該佐劑在 腫瘤特異性免疫治療或病毒感染性疾病的免疫治療中有效，并且因此提供在免疫治療中有 效的用于癌癥或病毒感染性疾病的治療劑。 解決問(wèn)題的手段
[0007] 就上述問(wèn)題，本申請(qǐng)人深入地進(jìn)行了研究，并且發(fā)現(xiàn)全細(xì)胞百日咳疫苗活化抗原 呈遞細(xì)胞(APS)和輔助T細(xì)胞(Th)兩者，并且包含腫瘤抗原膚或病毒抗原膚W及作為佐劑的 全細(xì)胞百日咳疫苗的疫苗顯示出出色的抗腫瘤活性或抗病毒活性。此外，本申請(qǐng)人確認(rèn)，與 BCG-CWS不同，百日咳疫苗可W W-周的間隔被重復(fù)地給藥，因?yàn)樵撘呙绮恍枰鏔IA那樣 在使用前乳化，并且?guī)缀醪划a(chǎn)生發(fā)紅和腫脹，并且開(kāi)發(fā)了本發(fā)明。 因此，本發(fā)明提供了下列：
[1] 用于癌癥的治療劑或用于癌癥轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的預(yù)防劑，其包含癌抗原膚和百日咳疫 苗；
[2] 前述[1]的試劑，其中所述百日咳疫苗是佐劑；
[3] 前述[1]或[2]的試劑，其中所述百日咳疫苗是全細(xì)胞百日咳疫苗；
[4] 前述[1]-[3]中任一項(xiàng)的試劑，其中所述癌抗原膚是選自W下的蛋白：WT1、存活蛋 白和前列腺特異性抗原、或包含其氨基酸序列一部分的膚；
[5] 前述[1]-[4]中任一項(xiàng)的試劑，其中所述癌是惡性腫瘤，其高度地表達(dá)選自WT1、存 活蛋白和前列腺特異性抗原的蛋白；
[6] 前述[1]-[引中任一項(xiàng)的試劑，其中所述試劑允許至少3次的免疫接種；
[7] 用于病毒感染性疾病的治療劑，其包含衍生自引起病毒感染性疾病的病毒的膚W 及百日咳疫苗；
[引前述[7]的試劑，其中所述百日咳疫苗是佐劑；
[9] 前述[7]或[引的試劑，其中所述百日咳疫苗是全細(xì)胞百日咳疫苗；
[10] 前述[7]-[9]中任一項(xiàng)的試劑，其中所述病毒是誘導(dǎo)惡性腫瘤的病毒；
[11] 前述[10]的試劑，其中所述試劑用于預(yù)防/治療病毒誘導(dǎo)的惡性腫瘤；
[12] 前述[7]-[9]中任一項(xiàng)的試劑，其中所述病毒選自：丙型肝炎病毒、流感病毒和登 革病毒；
[13] 前述[7]-[12]中任一項(xiàng)的試劑，其中所述試劑允許至少3次的免疫接種；
[14] 用于疫苗的佐劑，其包含作為主要成分的百日咳疫苗W及作為活性成分的癌抗原 膚或病毒膚；
[1引上述[14]的佐劑，其中所述百日咳疫苗是全細(xì)胞百C日疫苗；
[16] 上述[14]或[1引的佐劑，其中所述病毒是誘導(dǎo)惡性腫瘤的病毒；
[17] 上述[14]或[15]的佐劑，其中所述癌抗原膚是選自W下的蛋白：WT1、存活蛋白和 前列腺特異性抗原、或包含其氨基酸序列一部分的膚；W及
[1引上述[14]或[15]的佐劑，其中所述病毒選自：丙型肝炎病毒、流感病毒和登革病 O 本發(fā)明的效果
[0008] 本發(fā)明的用于癌癥或病毒感染性疾病的治療劑和用于癌癥轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)或病毒誘 導(dǎo)的惡性腫瘤發(fā)生的預(yù)防劑包含癌抗原膚或病毒膚W及百日咳疫苗。在給藥癌抗原膚和病 毒膚中，百日咳疫苗顯示出出色的佐劑活性。百日咳疫苗可W就其作為疫苗本身被廣泛地 應(yīng)用，并且可獲得GMP級(jí)別的疫苗。因此，本發(fā)明提供了有效且安全的用于癌癥和病毒感染 性疾病的治療劑。
【附圖說(shuō)明】
[0009] [圖1 ]顯示在產(chǎn)生針對(duì)百日咳毒素及纖維血細(xì)胞凝集素的IgG抗體中百日咳疫苗 的誘導(dǎo)輔助細(xì)胞的活性的圖。每周一次地用PBS或Ac或Wc百日咳疫苗皮下免疫B6小鼠。應(yīng)用 丫鏈特異性的二抗，通過(guò)化ISA檢測(cè)血清中針對(duì)百日咳毒素及纖維血細(xì)胞凝集素的IgG抗體 活性。此處顯示了在第3次免疫后一周的抗體活性。數(shù)據(jù)顯示為兩只小鼠的平均值和SD。
[圖2]顯示在不同免疫組中相比較的細(xì)胞毒活性的誘導(dǎo)的圖。每周一次地用有或沒(méi)有 百日咳疫苗的OVA-I膚免疫B6小鼠。在第4次免疫后，檢查脾細(xì)胞針對(duì)卵清蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞 ￡67(日、。、日、旨）、或其母細(xì)胞系化4(13、(1^、11)的細(xì)胞毒性。顯示了^不同6/1'比例的在5小時(shí) 解育期間的特異性裂解。通過(guò)各自的虛線顯示從單個(gè)小鼠的脾細(xì)胞收集的數(shù)據(jù)。
[圖3 ]顯示EGFP+OTI細(xì)胞體內(nèi)增殖的圖。靜脈內(nèi)注射EGFP+OTI細(xì)胞。次日，給小鼠靜脈 內(nèi)注射有或沒(méi)有百日咳疫苗的OVA-I膚。在下一周，W相同的方式重復(fù)免疫。在第二次免疫 一周W后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢查脾細(xì)胞。此處顯示