作為癌癥生物標志物的游離ngal的制作方法

文檔序號：5830643閱讀：688來源：國知局

專利名稱：作為癌癥生物標志物的游離ngal的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及通過確定患者尿樣中游離NGAL水平進行癌癥診斷和預后的非l性方法，所述癌癥例如是包括乳癌和卵巢癌的上皮起源癌癥。
背景技術：
癌癥存活最重要的因素之一是早期檢測。檢測癌癥早期事件的臨床分析提供機會來介入和防止癌癥發(fā)展。隨著基因譜分析和蛋白質組學的發(fā) 展，在鑒定可用于診斷和預后特定癌癥的分子標志物或"生物標志物"當中已經(jīng)取得顯著選艮。例如，對于前列腺癌的情況，可以在血液中檢測PSA (前列腺特異性抗原)，其指示前列腺癌的存在。因此，針對升高的PSA 水平可以快速、簡便并且安全的篩選有前列腺癌風險的男性血液.
盡管癌癥檢測領域中已經(jīng)取得逸艮，本領域中仍然需要鑒定針對各種癌癥的新生物標志物，它們可以方便地用于臨床應用尤其是非^^性癌癥篩查方法。尿分析可能代表了對患者最友好的選擇(如它不需要失血)并且廣泛為健康服務提供者所使用，但是到目前為止，以這種方式用于診斷癌癥的選項似乎仍較少。
多形性上皮細胞粘蛋白(MUC1， polymorphic印ithelial mucin 1)是一種在印巢癌中it^達的跨膜蛋白，并且這種腫瘤表達的MUC1蛋白經(jīng)常被切割而iiA^循環(huán)中，在此其作為肺瘤標志物CA15-3可被檢測到；參見例如Bon Wfl/. Oie挑.43:585 (1997)。然而，4艮多患者具有不表達 MUC1的肺瘤。還已經(jīng)報道血清CA125水平和卵巢癌有關(Skakes， CVmcw 76:2004(1995));但是對這些水平的評價并不是疾病的絕對指標。盡管大致85%的患有臨床顯著的卵巢癌的婦女具有7JC平提高的CA125，但在dfcj^ 的前三個月、經(jīng)期、非-癌癥疾病以及其他部位癌癥中CA125也增加。通過基因表達分析已經(jīng)確定在卵巢癌、結腸癌、肺癌和子宮癌腫瘤組
織(參見例如WO02/102235、 WO02/071928和US2004/0005563 )中，中性粒細胞明膠酶相關脂質載運蛋白(NGAL; lipocalin-2)的基因表達是上調(diào)的。

發(fā)明內(nèi)容
鑒定生物標志物對改進癌癥(如上皮起源的癌癥，包括乳癌和卵巢癌)的診斷、預后和治療特別相關，因此當前需要能快速、容易和安全檢測的生物標志物。本文描述的發(fā)明利用生物標志物一一游離的尿中中性粒細胞明膠酶相關脂質載運蛋白(NGAL， neutrophil genatinase associated lipocalin)來診斷、分期或監(jiān)測患有癌癥尤女是侵襲性、潛在轉移期癌癥的對象的疾病進程或治療。該領域現(xiàn)有的工作尚未表明或提示這可以是檢測癌癥(例如上皮起源癌癥，包括乳癌或卵巢癌)的可靠、非侵入性方式。
如本文所述，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在具有非典型導管增生(ADH， atypical ductal hyperplasia)個體的尿液中未復合或"游離"的NGAL的水平升高，ADH是未來發(fā)生乳癌的重要風險因子；在具有卵巢癌的個體中以及在具有(侵襲性和非侵襲性)乳癌的個體也發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象。因此，本發(fā)明涉及測量未復合的尿中NGAL作為確定個體是否有發(fā)生癌癥的風險或已發(fā)生癌癥的初步篩選，所述癌癥例如是上皮起源的癌癥，比如卵巢癌、前列腺癌或乳癌，以及其它癌癥比如基底細胞癌、腎細胞癌、腺癌、胃腸癌、唇癌、口癌、食管癌、小腸癌、胃癌、結腸癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、宮頸癌、肺癌、皮膚癌和腎癌。本發(fā)明還公開了監(jiān)測尿中NGAL水平作為治療功效標志物的方法。
在一個實施方案中，本發(fā)明包括確定個體是否有發(fā)生癌癥的風險或已經(jīng)發(fā)生癌癥的方法。確定由個體所得測試尿樣中的游離NGAL水平，將該水平與游離NGAL的對照水平進行比較。測試樣品中游離NGAL 水平高于游離NGAL對照水平指示該個體發(fā)生癌癥的風險增加或具有癌癥。在另一個實施方案中，所述個體是癌癥治療后患者；并且當測試樣品中游離NGAL水平高于游離NGAL對照水平時，則指導所述癌癥治療后患者進行癌癥復發(fā)治療。在另一個實施方案中，所述癌癥是上皮起源的癌癥，例如乳癌、基底細胞癌、腺癌、胃腸癌、唇癌、口癌、食管癌、小腸癌、胃癌、結腸癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、皮膚癌、腎癌、前列腺癌或腎細胞癌。在另一個實施方案中，
所檢測的游離NGAL水平是單體NGAL。在另一個實施方案中，所檢測的游離NGAL水平包括單體NGAL。在另一個實施方案中，使用優(yōu) 先結合游離NGAL的基于抗體的結合結構(例如單克隆抗體)以形成抗體-NGAL復合物，并檢測所述抗體-NGAL復合物的存在以測量所存在的游離NGAL水平。所述基于抗體的結合結構可以用可檢測標記物(比如放射性標記物、半抗原標記物、熒光標記物或酶標記物)來標記。
在另一個實施方案中，本發(fā)明包括癌癥分期方法。確定由個體所得測試尿樣中游離NGAL水平，并且將該水平與游離NGAL對照水平進行比較。測試樣品中游離NGAL(例如單體NGAL )水平高于游離NGAL 對照水平指示所述個體發(fā)生惡性癌癥或轉移癌癥的風險增加或者具有惡性癌癥或轉移癌癥。所述游離NGAL的對照水平可以與健康個體相關。
本發(fā)明還包括指導對象治療的方法。在一個實施方案中，測試從對象所得尿樣中游離NGAL水平，臨床人員分析其結果；如果所述尿液具有比游離NGAL對照水平更高的游離NGAL水平，臨床人員則指導該對象進一步進行癌癥測試。所述測試可以在該對象居住國進行，或者在另一國家進行，例如通過Web站點來提供測試結果，或者將測試結果傳送給臨床人員。
本發(fā)明還公開了監(jiān)測癌癥或癌癥風險的方法。測定由個體所得第一測試尿樣中游離NGAL的水平以獲得游離NGAL的初始水平；將該測試尿樣中此游離NGAL水平與由該個體所得第二尿樣中的游離NGAL 水平進行比較以獲得第二游離NGAL水平。隨后在選定時間間隔收集尿液并進行比較，從而收集一組數(shù)據(jù)點，分析這些數(shù)據(jù)點，以確定所述測試樣品中測量的游離NGAL水平對比對照樣品中測量的游離NGAL 水平是否有向上趨勢，這種向上的趨勢指示該個體中癌癥正進一步發(fā)展或者正在轉移；即，如果第二水平大于第一水平，可以認為該個體具有更大的癌癥發(fā)生或發(fā)展的風險，或者該個體具有更大的轉移癌癥發(fā)生或發(fā)展的風險。在另一個實施方案中，所述個體是癌癥治療后患者，并且當?shù)诙酱笥隗室凰綍r，則指導該癌癥治療后患者進行癌癥復發(fā)治療。
本發(fā)明還公開了用于檢測尿樣中游離NGAL的試劑盒。所述試劑盒包括保持尿樣的容器，和至少一種優(yōu)先結合游離NGAL的抗體；以及使用說明?；蛘?，所述試劑盒可以包括至少兩種優(yōu)先結合NGAL的抗體，其中一種抗體固定到固相上，其中另一種抗體被可檢測性標記。
尿液中NGAL既可以發(fā)現(xiàn)游離NGAL (即未結合基質金屬蛋白酶9 (MMP-9)，也可以發(fā)現(xiàn)復合的NGAL (即NGAL/MMP-9復合物)。在本文所述的方法中測量游離NGAL。
在一個實施方案中，提供一種確定個體是否有發(fā)生癌癥風險或者已發(fā)生癌癥的方法，所述癌癥例如上皮起源的癌癥，包括乳癌和卵巢癌。所述方法包括測量測試樣品尿液中存在的游離和復合的NGAL水平以及將所述測試樣品中所得水平與對照樣品進行比較，其中測試樣品尿液中游離NGAL水平更高則指示該個體發(fā)生癌癥的風險增加或者已經(jīng)具有癌癥。因此，陽性結果(更高水平)指示該個體應該進一步進行癌癥測試并因而進行監(jiān)測。優(yōu)選地，游離NGAL水平是對照水平的1.5倍，更優(yōu)選是2倍或更高。這種水平增加也可以針對對照水平來檢測。
本發(fā)明有利地用于癌癥的風險評價或早期檢測，所述癌癥例如是上皮起源的癌癥，包括乳癌和卵巢癌。例如，可以由醫(yī)生在年度體檢中來篩選對象。陽性測試結果中游離NGAL水平高于對照，這促使進行進一步診斷評價，以確定該個體是否具有癌前病變或癌癥。
如上所述，本發(fā)明還可以用于評價由同一患者所得多個測試樣品中存在的尿中游離NGAL水平，游離NGAL的量隨時間逐漸增加則指示癌癥攻擊性(aggressiveness)(如轉移能力)增加。因此，所述NGAL 水平用作疾病狀態(tài)和分期的預測指標。
在一個實施方案中，在一個或更多個時間間隔處評價NGAL水平以監(jiān)測i殳計用于治療癌癥患者的治療方案的治療功效，所述癌癥例如是上皮起源的癌癥，包括乳癌和卵巢癌。
在本發(fā)明的一個方面，使所述測試樣品或其制備物接觸優(yōu)先特異性結合(游離)NGAL蛋白或其一部分的基于抗體的結合結構，從而測量測試尿樣中存在的NGAL水平。"優(yōu)先"意思是指所述抗體結合游離 NGAL,勝于結合可被復合(例如與MMP-9復合)的NGAL。在一個實施方案中，所述游離NGAL是單體NGAL。所述基于抗體的結合結構與NGAL形成可被檢測的復合物，從而能夠測量NGAL水平。為了區(qū)分游離NGAL和復合的NGAL,例如在ELISA中，可以使用優(yōu)先與游離NGAL相互作用的基于抗體的結合結構。這些抗體結合結構可以針對MMP-9/NGAL結合區(qū)內(nèi)部的表位來制備。
基于抗體的免疫測定是測量NGAL蛋白水平的優(yōu)選方式。然而，本領域技術人員已知的任何方式都可用于評價NGAL水平。例如，在一些實施方案中，通過質語(包括SELDI質鐠)來測定NGAL表達水平。

附圖并入說明書中并構成說明書的一部分，它們舉例說明本發(fā)明的實施方案，并與文字說明一起用于解釋本發(fā)明的目的、優(yōu)點和原理。
圖1A和1B表示卵巢癌細胞系中NGAL轉錄物的表達水平。用實時PCR來測定表達水平。圖1A顯示與GAPDH對照轉錄物比較在瓊脂糖上分離的轉錄物。圖1B是在Y軸標繪出NGAL/GAPDH比率的圖。 HOSE是正常卵巢細胞系；OVCAR-3、 OVCAR-5和SKOV-3是卵巢癌細胞系。
圖2示出卵巢癌細胞系(OVCAR-3、 OVCAR-5和SKOV-3 )在條件培養(yǎng)基中NGAL蛋白分泌的量，其通過Borregaard ELISA來測定。
圖3A和3B顯示乳癌細胞系中NGAL轉錄物表達水平。用實時PCR 來測定表達水平。圖3A顯示與GAPDH對照轉錄物比較在瓊脂糖上分離的轉錄物。圖3B是在Y軸標繪出NGAL/GAPDH比率的圖。T-47D 和MCF-7是"器官限定"的乳癌細胞系，MDA-MB-231是"高度轉移性細胞系"。
圖4示出乳癌細胞系(T-47D、 MCF-7和MDA-MB-231)在條件培養(yǎng)基中NGAL蛋白分泌的量，其通過Borregaard ELISA來測定。
圖5A和5B顯示在來自沒有疾病、具有良性卵巢疾病和惡性卵巢癌癥的患者的尿樣中NGAL蛋白的水平。圖5A顯示^f吏用抗NGAL抗體對尿樣的Western印跡分析。圖5B顯示如圖5A所述Western印跡的定量分析。用密度計量法來定量印跡，以任意密度計量單位來表示水平。
圖6是人NGAL的氨基酸序列(SEQ ID NO:l )。
圖7示出與健康對照樣品相比較，卵巢癌尿樣中NGAL蛋白的表達，其通過Borregaard ELISA來測定。
圖8示出與健康對照樣品相比較，乳癌尿樣中NGAL蛋白的表達，其通過Borregaard ELISA來測定。
圖9示出與健康個體中所見水平相比較，具有非典型導管增生 (ADH)或原位小葉癌(LCIS， lobular carcinoma /" 似)的個體中 NGAL蛋白的表達，其是未來發(fā)生乳癌的重要風險因子。使用R&D ELISA;見實施例1。
圖10示出在乳癌細胞(MCF-7細胞，和兩個過表達NGAL的細胞系克隆Nl和N2)遷移測定中每視野的遷移細胞量(y軸)，其中MCF-7 細胞表達很少NGAL。
圖11示出在乳癌細胞(MCF-7細胞，和兩個過表達NGAL的細胞系克隆N1和N2)的胂瘤侵襲測定中細胞侵襲的量，其中MCF-7細胞表達很少NGAL。
圖12示出與健康個體中所見水平相比較，具有非典型導管增生 (ADH)(未來發(fā)生乳癌的重要風險因子)、具有原位導管癌(DCIS， ductal carcinoma in situ )(最常見類型的非侵襲性乳癌)以及具有侵襲性乳癌(IBC)的個體中NGAL蛋白的表達。使用R&DELISA。
圖13顯示在來自正常、具有良性和惡性腫瘤的患者的卵巢癌尿樣中存在的游離NGAL單體的量。所述惡性胂瘤樣品表現(xiàn)出比良性樣品群體更高的游離NGAL水平。這些研究4吏用NGAL ELISA試劑盒弁DLCN20 (得自R&D Systems, Minneapolis, MN USA)進行。
具體實施方式
定乂
"游離NGAL"可與術語"未復合的NGAL，，互換使用，表示未與基質金屬蛋白酶如MMP-9復合的NGAL。
"上皮起源的癌癥"包括源自上皮細胞的癌癥，包括但不限于乳癌、基底細胞癌、腺癌、胃腸癌、唇癌、口癌、食管癌、小腸癌和胃癌、結腸癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、乳癌和皮膚癌 (比如鱗狀細胞癌和基底細胞癌)、前列腺癌、腎細胞癌、以及影響全身上皮細胞的其它已知癌癥。上皮起源的癌癥可以是激素依賴性癌癥，例如腎癌、乳癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌或前列腺癌。
"對照樣品"包括從據(jù)信沒有癌癥的"正常"或"健康"個體獲得的尿液樣品?？梢允褂帽绢I域公知的方法選擇對照。一旦已經(jīng)很好地確定了對照群體的水平，來自測試尿樣的陣列結果可以直接與所述已知水平進行比較。優(yōu)選地所述對照樣品是年齡和性別匹配的對照尿樣。
"對照水平"是根據(jù)其比較分析物之測試水平的分析物水平.所述對照水平可以是來自據(jù)信沒有目標疾病(如癌癥)或沒有目標疾病之特定分期(如良性或早期癌癥對比惡性或晚期癌癥)的個體群的經(jīng)驗確定
的平均或中值分析物水平；其可以是實際樣品(如陽性對照)中的已知分析物水平；或者可以是特定個體(如在兩個或更多個時間點監(jiān)測個體時)先前測定的分析物水平。所述分析物例如是游離NGAL。
"測試樣品"包括從待測對象獲得的尿樣。
"攻擊性"或"侵襲性"包括腫瘤擴張出其邊界進入相鄰組織的傾向(Darnell, J. (1990)， Molecular Cell Biology,第三版，W.H. Freeman, NY)。侵襲性癌癥可以與器官限定的癌癥進行對比，器官限定的癌癥中腫瘤局限于特定器官。肺瘤的侵襲性經(jīng)常伴隨蛋白水解酶如膠原酶的作
的范圍，以及超出肺瘤所在特定組織限定的范圍。
"轉移"包括癌癥在患者中從起源器官擴展至其它遠處部位的狀況。腫瘤轉移過程是多階段事件，涉及局部侵襲和細胞間基質的破壞，滲入血管、淋巴管或其它傳輸通道，在循環(huán)中存活，在其它部位滲出上述管道并在新位置生長(例如見Fidler， et al.，爿rfv. 28， 149-250 (1978)， Liotta, et al" T簡加^及d 40, 223-238 (1988),
Nicolson， fi/ocA/附.爿c似948， 175-224 (1988)和Zetter， iV. 丄322， 605-612 (1990))。惡性細胞遷移率增加已經(jīng)與動物以及人腫瘤中轉移能力增強相關聯(lián)(Hosaka， et al.， GWm 69, 273-276 (1978)和 Haemmerlin， et al" /"f. / C"/ic^ 27， 603-610 (1981))。
"原發(fā)性腫瘤"包括在對象中出現(xiàn)于第一部位的腫瘤，并且可以與 "轉移性肺瘤"相區(qū)分，所述轉移性腫瘤出現(xiàn)于對象身體中遠離原發(fā)性腫瘤的部位。
"NGAL"包括GenBank登記號、Genpept、 CAA58127 (人)(SEQ ID NO:l)的NGAL蛋白(圖6 )。 NGAL也表示為中性粒細胞明膠酶相關的脂質載運蛋白和脂質載運蛋白-2(lipocalin-2)。 "NGAL"還包括物種變體、同源物、等位基因形式、突變形式以及其等同物。在本文所公開方法中用于對照樣品和測試樣品之間或者對照水平和測試樣品水平之間進行比較時，術語"更高水平"包括統(tǒng)計學顯著的
或者顯著高于對照樣品中所見的水平，例如1.3倍高或1.5倍高。優(yōu)選地，所述"更高水平"是至少2倍高或更高。
"統(tǒng)計學顯著"或"顯著"包括統(tǒng)計學顯著性，一般是指在標志物正常濃度以上兩個標準偏差(2SD, standard deviation )或更高。
"LCIS"是原位小葉癌。LCIS也稱為小葉癌(lobular neoplasia )，有時被分類為非侵襲性乳癌類型。它不侵入小葉壁。盡管其自身通常不變成侵襲性癌癥，具有此病況的女性在同側或對側乳房中具有更高的風險發(fā)生侵襲性乳癌。
"DCIS"是原位導管癌。原位導管癌是最常見的非侵襲性乳癌類型。在DCIS中，惡性細胞不通過導管壁轉移入乳房的脂肪組織。粉刺狀癌 (comedocarcinoma )是比其它類型DCIS更可能在乳房肺瘤切除后回到相同區(qū)域的DCIS類型，并且它比其它形式的DCIS與最終發(fā)生侵襲性導管癌有更密切的關聯(lián)。
癌癥的"風險增加"包括與一般群體相比癌癥的風險增加。被視為具有增加風險的人需要監(jiān)測癌癥發(fā)展以及癌癥風險標志物的連續(xù)存在。
如在本公開中進一步詳細描述，來源于高轉移性乳癌的細胞系比如 MDA-MB-231表達并分泌比來源于良性、器官局限性乳癌比如T-47D 和MCF-7更高量的NGAL。而且，在NGAL (-)乳癌細胞系(MCF-7 ) 中過表達NGAL誘導間充質樣的表型，增加遷移和侵襲，并調(diào)節(jié)上皮間充質轉變(EMT， Epithelial Mesenchymal Transition )標志物轉錄和表達，這表明了 NGAL在轉移性疾病中的作用。
本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，游離的尿NGAL可用作檢測癌癥(例如上皮起源的癌癥，包括乳癌和卵巢癌)存在和/或進展的生物標志物，非侵入性測試和檢驗可用作癌癥診斷和治療的必要部分。對于關心癌癥診斷的那些患者，測試的非侵入性多少緩解了對與此過程相關的憂慮。對醫(yī)生和護理人員來說，本文所述方式的尿液測試是快速和可靠的，并且本發(fā)明方法利用標準方法比如ELISA來獲得例如癌癥診斷或者作為治療過程的一部分(癌癥診斷或治療后患者所采取的治療措施)，以確定癌癥是否正變得更有攻擊性或轉移性。其它癌癥包括腹膜癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、結直腸癌、子宮癌、曱狀腺癌、肺癌、腎癌和胰腺癌。例如，確定癌癥復發(fā)、擴展或患者生存的可能性能輔助確定應該采取更保守還是更激進的治療策略、或者是否應該采取聯(lián)合治療方案。例如，當癌癥有可能復發(fā)時，在手術治療之前或之后進行化療、放射治療、免疫治療、
生物修飾物治療(biological modifier therapy )、基因治療、疫苗等將是有利的，或者可以調(diào)整患者治療的時間跨度。本發(fā)明實現(xiàn)這種認識的容易性和速度是亳無疑問的優(yōu)點。
本文所公開方法可用于確定個體是否具有癌癥或者有更大風險發(fā) 生癌癥，所述癌癥例如上皮起源的癌癥，包括乳癌和卵巢癌。所述方法涉及測量從個體所得測試樣品中的游離NGAL的水平，以及將所觀察水平與游離NGAL的對照水平相比較，所述對照水平例如可發(fā)現(xiàn)于對照樣品中，或者對照水平可如上定義。高于對照水平的NGAL水平指示個體發(fā)生癌癥的風險增加或者具有癌癥。NGAL水平可用任意單位來表示，例如表示為從密度計量儀、光度計或ELISA讀板儀中獲得的單位。
為了進行比較，測試樣品和對照樣品是相同類型的，即從尿液獲得。然而，對照樣品也可以是含有NGAL的標準樣品，其中NGAL是與從健康個體所得尿樣中通常發(fā)現(xiàn)相同的濃度。
優(yōu)選處理尿樣以防止NGAL蛋白的降解。抑制或防止降解的方法包括但不限于用蛋白酶抑制劑處理樣品、冷凍樣品、或者將樣品放在冰上。
優(yōu)選地，在分析之前，所述樣品保持于防止NGAL蛋白降解的恒定條件下。
在本發(fā)明的一個方面，可以進行二次診斷步驟。例如，如果發(fā)現(xiàn) NGAL水平指示有癌癥風險或者存在癌癥，則可以實施另外的檢測癌癥風險、或癌癥存在性的方法以證實。例如，為了評價癌癥風險，可以通過本領域已知的方法測定個體中的非典型導管癌癥(ADH )或原位小葉癌(LCIS)，比如可以通過活組織檢查、隨機乳暈細針吸取或導管灌洗來診斷乳房的非典型性。還可以評定風險的遺傳標志物，比如BRCA1 或BRCA2或者任何其它已知的癌癥遺傳標志物.
多種其它診斷步驟的任一種都可用于證實癌癥的存在性，比如超聲、乳房造影、PET掃描、MRI、熱成像、或者任何其它成像技術、活組織檢查、導管灌洗、導管造影、臨床檢查、或者本領域已知的任何其它方法。癌癥風險增加的患者優(yōu)選進行癌癥檢測方案，比如常規(guī)乳頭分泌物涂片和乳房造影、以及分析其它風險標志物?；颊哌€可以進行預防性方案，比如施用血管生成抑制劑或選擇性激素受體調(diào)節(jié)劑，預防性方案是本領域技術人員公知的。癌癥患者被指導進行本領域公知的癌癥治療。
此外，可通過跟蹤個體患者中的NGAL水平(比如游離NGAL水平)來評定疾病進程。例如，個體狀況的變化可通過比較個體中NGAL 表達水平隨時間的變化來評價，例如通過對患者針對相關狀況實施縱向研究的標準方法。NGAL水平的逐漸增加指示具有癌癥、腫瘤侵襲和轉移、和/或更晚期癌癥的潛力增加，這取決于監(jiān)測個體隨時間變化的原因。作為替代，通過在一段時間監(jiān)測個體中NGAL水平可以監(jiān)測治療方案的療效。例如，NGAL水平隨時間降低可以指示治療方案的功效。可以在兩個或更多個時間點進行縱向監(jiān)測。
以上段落概述的方法還可以優(yōu)先用于縱向監(jiān)測已進行癌癥治療的患者，例如針對癌癥復發(fā)進行治療。因為本文公開內(nèi)容已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，尿中 NGAL (例如游離NGAL)是有用的癌癥生物標志物，因此可通過例如進一步診斷或適當時通過進一步治療來應對治療后患者中尿液NGAL 水平增加。在治療后患者中將建立尿液NGAL的對照水平，例如使用一個或多個尿液NGAL的測量值，其中任何一個都適于分析。然后根據(jù)需要可通過比較個體中NGAL表達水平的變化來監(jiān)測治療后患者狀況的變化。根據(jù)適于患者、患者群體或特定癌癥的條件，尿液NGAL 水平的逐漸或進行性增加或者快速升高可以指示復發(fā)。確定癌癥復發(fā)可幫助確定應該采取更保守還是更激進的治療策略、或者是否應該進行聯(lián) 合治療方案。當癌癥有可能復發(fā)時，在手術治療之前或之后進行化療、放射治療、免疫治療、生物修飾物治療、基因治療、疫苗等將是有利的，或者可以調(diào)整患者治療的時間跨度。
作為替代，能用于篩選癌癥復發(fā)的個體中尿液游離NGAL水平可以與經(jīng)驗確定的對照水平進行比較。如上所述，個體中測試水平大于對照水平指示復發(fā)，然后可以進行進一步治療或監(jiān)測。
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游離的尿液NGAL水平優(yōu)選地可通過使用抗體或抗體等同物來測量，以檢測游離NGAL水平。其它方法比如WO2004/088276中公開的方法也是適用的；還可以通過質鐠分析來監(jiān)測NGAL水平。在一個實施方案中，通過將尿液樣品與優(yōu)先結合游離NGAL或游離 NGAL片段的基于抗體的結合結構相接觸來測量NGAL蛋白的水平。然后檢測抗體—NGAL復合物的形成作為游離NGAL水平的量度。
"基于抗體的結合結構"或"抗體"包括免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子的免疫活性決定簇(determinant),例如含有優(yōu)先結合(免疫學相互作用于)NGAL (或本發(fā)明其它生物標志物)的抗原結合位點的分子。"基于抗體的結合結構"包括完整抗體(例如任何抗體亞型(IgG、 IgA、 IgM、 IgE等))以及其也與NGAL蛋白特異性反應的片段，所述抗體更優(yōu)選優(yōu)先結合未復合(游離)的NGAL.可以用常規(guī)技術將抗體片段化。因此，該術語包括抗體分子中能選擇性與某種蛋白反應的蛋白水解切割或者重組制備部分區(qū)段(segments )。這種蛋白水解和/或重組片段的非限制性實例包括Fab、 F(ab，)2、 Fab，、 Fv、 dAb以及含通過肽連接子連接的VL和VH結構域的單鏈抗體(scFv )。所述scFv可以共價連接或非共價連接以形成具有兩個或更多個結合位點的抗體。因此， "基于抗體的結合結構"包括多克隆抗體、單克隆抗體、或者其它的純化的抗體制備物以及重組抗體。術語"基于抗體的結合結構"意思還包括人源化抗體、雙特異性抗體、以及具有來源于抗體分子的至少一個抗原結合決定簇的嵌合分子。在一個優(yōu)選實施方案中，所述基于抗體的結合結構被可檢測性標記。
"標記抗體"包括用可檢測手段所標記的抗體，包括被酶標記、放射性標記、熒光標記和化學發(fā)光標記的抗體。還可以用可檢測標簽(比如c-Myc、 HA、 VSV畫G、 HSV、 FLAG、 V5或HIS)來標記抗體。
本發(fā)明的一些診斷和預后方法使用基于抗體的結合結構來檢測 NGAL，在這些方法中，尿樣中游離NGAL蛋白的水平與從可檢測標記抗體所發(fā)出信號的強度相關聯(lián)。
在一個優(yōu)選實施方案中，通過將抗體與酶連接來可檢測性標記基于抗體的結合結構。當所述酶暴露于其底物時，所述酶進而將與該底物以產(chǎn)生能被檢測的化學結構的方式進行反應，例如通過分光光度法、熒光光度法或通過視覺工具來檢測。能用于可檢測性標記本發(fā)明抗體的酶包括蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、A-V-類固醇異構酶、酵母醇脫氫酶、 a-甘油磷酸脫氫酶、磷酸三糖異構酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、P-半乳糖普酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖-VI-磷酸脫氫酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰膽堿脂酶?；瘜W發(fā)光是能用于檢測基于抗體的結合結構的另一種方法。
還可以使用任意的多種其他免疫測定來完成測定。例如，通過放射性標記抗體，有可能通過使用放射免疫測定來檢測抗體。通過使用y計數(shù)器或閃爍計數(shù)器或通過放射自顯影等手段可以檢測放射性同位素。尤
其可用于本發(fā)明目的的同位素是311、 mI、 35S、 "C、以及優(yōu)選的1251。
還可以用熒光化合物來標記抗體。當熒光標記抗體暴露于適當波長的光時，由于其熒光可檢測其存在。最常使用的熒光標記化合物中有
CYE染料、熒光素異疏氰酸酯、羅丹明、藻紅蛋白、藻藍蛋白、別藻藍蛋白、鄰苯二甲醛和熒光胺。
還可以用發(fā)熒光金屬如^Eu或其它鑭系金屬來可檢測性標記抗體。這些金屬可以用金屬螯合基團如二乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)等來附著于抗體。
還可以通過將抗體偶聯(lián)至化學發(fā)光化合物來可檢測性標記抗體。然后通過檢測化學反應過程中發(fā)出光的存在性來確定化學發(fā)光抗體的存在性。特別有用的化學發(fā)光標記化合物的實例是魯米諾、蟲螢光素 (luciferin)、異魯米諾、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶総鹽和草酸酯。
如上所爿iHf，可通過免疫測定來檢測游離NGAL水平，比如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、免疫放射性計量測定 (IRMA)、 Western印跡或免疫組織化學，其中每種在下面有更詳細描述。也可以利用抗體陣列或蛋白質芯片，例如見美國專利公開號 20030013208A1 、 20020155493A1和20030017515以及美國專利號 6,329,209和6,365,418。
名瘦浙定
"放射免疫測定"是使用標記(如放射性標記)形式的抗原來檢測和測量抗原濃度的技術?？乖派湫詷擞浀膶嵗?11、 "C和1251。通過使生物學樣品中的抗原與標記(如放射性標記)抗原竟爭抗原與抗體的結合來測量生物學樣品中游離NGAL的濃度。為確保標記抗原與非標記抗原之間的竟爭性結合，標記抗原的濃度足以飽和抗體的結合位點。樣品中抗原濃度越高，將與抗體結合的標記抗原的濃度越低。
在放射免疫測定中，為了確定與抗體結合的標記抗原的濃度，必須將抗原-抗體復合物與游離抗原分開。一種將抗原-抗體復合物與游離抗原分離開的方法是通過用抗-亞型抗血清來沉淀抗原-抗體復合物。另一種將抗原—抗體復合物與游離抗原分離開的方法是通過用福爾馬
林殺死的金黃色葡萄球菌(S. aureus.)來沉淀抗原-抗體復合物。另外一種將抗原-抗體復合物與游離抗原分離開的方法是通過實施"固相放射免疫測定"，其中抗體連接(如共價)至Sepharose瓊脂糖珠、聚苯乙烯孔、聚氯乙烯孔或微滴定板孔。通過將結合抗體的標記抗原的濃度與標準曲線進行比較，能夠確定生物學樣品中的抗原濃度，其中所述標準曲線基于具有已知濃度抗原的樣品獲得。
"免疫放射性計量測定"(IRMA)是抗體試劑被放射性標記的免疫測定。IRMA需要通過諸如與蛋白質(如兔血清白蛋白RSA)綴合的技術產(chǎn)生多價抗原綴合物。所述多價抗原綴合物必須每分子有至少兩個抗原殘基，所述抗原殘基必須離開得足夠遠，以允許至少兩個抗體與該抗原結合。例如，在IRMA中所述多價抗原綴合物能夠附著至固體表面比如塑料球。未標記的"樣品"抗原和放射性標記的抗原之抗體加到含有用所述多價抗原綴合物包被之球的試管中。樣品中的抗原與所述多價抗原綴合物竟爭抗原抗體結合位點。適當孵育時間后，通過清洗除去未結合的反應物，測定固相上的放射性量。結合放射性抗體的量與樣品中抗原的濃度成反比。
最常見的酶免疫測定是"酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)"。 ELISA是使用標記(如酶連接)形式的抗體來檢測和測量抗原濃度的技術。本領域技術人員公知，有多種不同形式的ELISA。本領域已知的ELISA標準技術描述于"Methods in Immunodiagnosis"，第2版，Rose和Bigazzi， eds. John Wiley & Sons， 1980; Campbell et al.， "Methods and Immunology", W. A. Benjamin, Inc., 1964;和Oellerich， M. 1984， / C7/ii. C7i亂C7/".腸cA亂22:895-卯4。
在"夾心ELISA，，中，抗體(如抗-NGAL或抗-游離NGAL)被連接至固相(即微滴定板)并暴露于含抗原(如NGAL)的生物學樣品。然后清洗所述固相以除去未結合的抗原。然后標記抗體(如酶連接的) 結合到所述結合抗原(如果有的話)，形成抗體-抗原-抗體夾心。能夠連接至抗體的酶的實例是堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、縈光素酶、脲酶和p-半乳糖苷酶。所述酶連接的抗體與底物反應從而產(chǎn)生能夠被測量的有色反應產(chǎn)物。
在"竟爭性ELISA"中，抗體(如抗-NGAL或抗-游離NGAL)與含抗原(即NGAL)的樣品一起醉育。然后抗原-抗體混合物與用抗原(即NGAL)包被的固相(如微滴定板)接觸。樣品中抗原越多，可供結合固相的游離抗體越少。然后將標記(如酶連接)第二抗體加到固相，以確定與固相結合的第一抗體的量。
在"免疫組織化學測定"中，通過將組織暴露于對所測定蛋白質有特異性的抗體從而測定組織切片中的該特異性蛋白質。然后通過任意的多種方法使抗體顯示以確定所述蛋白質的存在性及其量。用于顯示抗體的方法的實例是例如通過與抗體連接的酶(例如螢光素酶、堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、或p-半乳糖苷酶)、或者化學方法(如DAB/底物發(fā)色團)。
根據(jù)執(zhí)行者的優(yōu)先考慮并基于本公開內(nèi)容，其它技術也可用于檢測本發(fā)明的生物標志物。這種技術之一是Western印跡(Towbin et at.， iV"t Jcflrf. 5W. 76:4350 (1979))。其中將適當處理的樣品跑SDS-PAGE 膠，隨后轉移到固相支持物比如硝酸纖維素濾膜上。優(yōu)先結合NGAL 的可檢測標記的抗體(如抗-NGAL或抗-游離NGAL)然后可用于評估 NGAL水平，其中來自可檢測標記的信號強度對應NGAL的存在量。可以定量水平，例如通過密度計量法。
質謬
此外，NGAL (如游離NGAL)可用質鐠如MALDI/TOF (飛行時間)、SELDI/TOF、液相色譜-質鐠(LC-MS )、氣相色鐠-質謙(GC-MS )、高效液相色鐠-質鐠(HPLC-MS)、毛細管電泳-質鐠(CE-MS)、核磁共振鐠、或串聯(lián)質鐠(如MS/MS、 MS/MS/MS、 ESI-MS/MS等)來檢測。例如見美國^iS開號20030199001、 20030134304和20030077616。
質譜方法是本領域公知的，已經(jīng)用于定量和/或鑒定蛋白質(例如見 Li et al. (2000) Tibtech 18:151-160; Rowley et al. (2000) Methods 20: 383-397;和Kuster and Mann (1998) Curr. Opin. Structural Biol. 8: 393-400)。而且，已經(jīng)開發(fā)了允許至少部分從頭測序分離蛋白質的質鐠技術。Chait et al" Science 262:89-92 (1993); Keough et al" Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:7131-6 (1999);綜述見Bergman, EXS 88: 133-44 (2000)
在某些實施方案中使用氣相離子光度計。在另一些實施方案中，使用激光解吸/電離質鐠來分析樣品?，F(xiàn)代激光解吸/電離質譜(LDI-MS) 可以兩種主要變型來操作基質輔助激光解吸/電離(MALDI)質鐠和表面增強激光解吸/電離(SELDI)。在MALDI中，分析物與含基質的溶液混合，將所述液體滴在襯底表面上。然后基質溶液與生物分子共結晶。將襯底插入質語儀。將激光能量導向襯底表面，從而解吸并離子化生物分子，同時并沒有使生物分子顯著片段化。然而，MALDI作為分析工具有其限制。它不能提供樣品分級的手段，并且基質材料能干擾檢測，尤其是對于低分子量分析物。例如見美國專利號5，118，937和 5,045,694。
在SELDI中，襯底表面被修飾，使得其主動參與解吸過程。在一種變型中，表面用選擇性結合目標蛋白的吸附劑和/或捕獲試劑衍生化。在另一種變型中，用在激光沖擊時不解吸的能量吸收分子來衍生化所述表面。在另一種變型中，用結合目標蛋白并且含有光解鍵的分子來衍生化所述表面，其中當施加激光時所述光解鍵斷裂.在各種這些方法中，衍生試劑一般定位到施加樣品的襯底表面上的特定位置。例如見美國專利號5,719,060和W098/59361。所述兩種方法可以相組合，例如通過使用SELDI親和表面來捕獲分析物并將含基質的液體加到捕獲的分析物以提供能量吸收物質。
對于質i普儀相關的其它信息，例如見Principles of Instrumental Analysis,第3版，Skoog， Saunders College Publishing, Philadelphia, 1985;和Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology,第4版 Vol. 15 (John Wiley & Sons, New York 1995), pp. 1071-1094。
檢測標志物或其它物質的存在通常涉及檢測信號強度。這進而能夠反映與襯底結合的多肽的量和特性。例如，在某些實施方案中，可以比較(如目測、通過計算機分析等)來自第一樣品和第二樣品的鐠圖的峰值信號強度，以確定特定分子的相對量?？墒褂密浖绦虮热鏐iomarker Wizard程序(Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, Calif.)用于輔助分析質譜圖。質鐠儀及其技術對本領域技術人員是公知的。
本領域任何技術人員明白，質譜儀的任何組件(如解吸源、質量分析器、檢測器等)以及各種樣品制備可以與本文描述或者本領域技術人員已知的其它合適的組件和制備相組合。例如，在一些實施方案中，對照樣品可以含有重原子(如13C )，從而允許測試樣品與已知對照樣品在同一質鐠操作中相混合。
在一個優(yōu)選實施方案中，使用激光解吸飛行時間(TOF)質鐠儀。在激光解吸質鐠中，將具有結合標志物的襯底導入入口系統(tǒng)中。所述標志物被來自離子源的激光解吸并電離進入氣相。所產(chǎn)生的離子被離子光學組件收集，然后在飛行時間質量分析器中，通過短高壓電場加速離子并使之漂移進入高真空室。在高真空室的遠端，已被加速的離子在不同時間撞擊敏感檢測器表面。因為飛行時間是離子質量的函數(shù)，在離子形成和離子檢測器撞擊之間所花時間能夠用于鑒定是否存在特定質核比的分子。
在一些實施方案中，確定第一或第二樣品中所存在一種或多種生物分子的相對量部分地是通過用可編程數(shù)字計算機執(zhí)行算法。所述算法在第一質諳圖和第二質譜圖中鑒定至少一個峰值。然后所述算法比較第一質譜圖中峰值信號強度與第二質譜圖中峰值信號強度。所述相對信號強
度指示第一和第二樣品中存在的生物分子(如NGAL或游離NGAL) 的量。含已知量生物分子的標準品可作為第二樣品進行分析以更好地定量第一樣品中存在的生物分子的量。在某些實施方案中，還可以鑒定第一和第二樣品中所述生物分子的身份。在一個優(yōu)選實施方案中，通過 MALDI-TOF質i普來測量生物標志物水平。
拔沐
可以從商業(yè)來源獲得用于本發(fā)明的游離NGAL結合抗體(例如，抗游離NGAL抗體可見于NGAL ELISA試劑盒弁DLCN20，來自R&D Systems, Minneapolis, MN USA)。作為替4義，可針對游離NGAL或所述生物標志物多肽的一部分(例如通常被掩蓋于MMP-9/NGAL復合物中的氨基酸部分)來制備抗體，以產(chǎn)生僅與游離NGAL而不與 MMP-9/NGAL相互作用的抗體。這種抗體結合結構可由普通技術人員針對MMP-9/NGAL結合區(qū)內(nèi)部的表位來制備，在此不需要更詳細的公開。
可使用制備抗體的標準方法來制備本發(fā)明所用抗體，例如通過單克隆抗體生產(chǎn)(Campbell, A.M., Monoclonal Antibodies Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, the Netherlands (1984); St. Groth et al" J. Immunology, (1990) 35: 1-21;和Kozbor et al" Immunology Today (1983) 4:72 )。還可以通過使用所述蛋白質的抗原性部分來篩選抗體文庫(比如通過本領域公知方法篩選噬菌體展示文庫) 容易地獲得抗體。例如，美國專利號5，702，892和WO01/18058公開了噬菌體展示文庫和產(chǎn)生抗體結合結構域片段的選擇方法。
檢浙試浙盒
根據(jù)本公開內(nèi)容提供用于檢測和預后性評價卵巢癌以及用于檢測和預后性評價乳癌的商品試劑盒。所述試劑盒可以是普通技術人員公知的任何構造，可用于實施本文所述用于檢測NGAL的一種或多種方法。所述試劑盒是方便的，它們供應很多(如果不是全部)用于實施檢測尿樣中NGAL之測定的關鍵試劑。此外，所述測定優(yōu)選與試劑盒中包括的一或多個標準品(比如預定量的NGAL蛋白)同時進行，使得測試結果可以定量或驗證。
所述試劑盒包括用于檢測NGAL水平的工具，即NGAL結合抗體或選擇性結合NGAL蛋白的抗體片段。所述診斷測定試劑盒優(yōu)先配置成標準的兩抗體結合格式，其中一種NGAL特異性抗體捕獲患者樣品中的NGAL，另一種NGAL特異性抗體用于檢測所捕獲的NGAL。例如，所述捕獲抗體固定到固相(如測定板、測定孔、硝酸纖維素膜、珠、蘸棒或洗脫柱組分)上。第二抗體(即檢測抗體)通常用可檢測標記物 (比如量熱劑或放射性同位素)進行標簽化。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述試劑盒包含用于檢測尿樣中游離 NGAL水平的工具。在一個特定實施方案中，所述試劑盒包含具有其上固定有抗NGAL抗體或其片段的"蘸棒"，所述抗體或片段優(yōu)先結合 NGAL蛋白。然后可以檢測優(yōu)先結合的NGAL蛋白，例如4吏用用比色計量劑或放射性同位素可檢測性標記的第二抗體，本領域普通技術人員將會知道，由此可以定量確定游離NGAL的量。
在另一些實施方案中，所述測定試劑盒可以利用(但不限于)以下技術竟爭性和非竟爭性測定、放射免疫測定(RIA)、生物發(fā)光和化學發(fā)光測定、熒光計量測定、夾心測定、免疫放射計量測定、點印跡、酶聯(lián)測定包括ELISA、微滴定板和免疫細胞化學。對于每種試劑盒，通過本領域技術人員公知的手段來建立所述測定的范圍、靈敏度、準確性、可靠性、特異性和重復性。
還進一步通過以下實施例來舉例說明本發(fā)明。提供這些實施例用于幫助理解本發(fā)明，它們不構成對本發(fā)明的限制。
實施例1
7V04i: #為伊夷痛和#乙痛^^遂^#標^參本實施例表明，游離NGAL可用作癌癥生物標志物，所述癌癥例如是上皮起源的癌癥，比如乳癌和/或卵巢癌。而且，它證明游離NGAL 可用于癌癥診斷、預后和分期。圖la和lb顯示多種卵巢癌細胞系中 NGAL轉錄物的表達水平。圖3A和3B顯示多種乳癌細胞系中NGAL 轉錄物的表達水平。用實時PCR確定表達水平。這些結果證實，與非癌癥(HOSE)細胞系相比，NGAL在癌癥細胞系中過表達。
圖2顯示的圖舉例說明卵巢癌細胞系在條件培養(yǎng)基中NGAL蛋白分泌的量，這使用Borregaard博士提供的抗NGAL抗體通過Borregaard EL1SA來測定，描述于Kjeldsen L， Koch C, Amljots K, Borregaard N., Characterization of two ELISAs for NGAL: a newly described lipocalin in human neutrophils. //附附《/1< /MefAorfs. 1996 Nov 13;198(2):155畫64。 OVCAR-5顯示i高水平的分泌；與OVCAR-5相比，SKOV-3具有顯著更少的分泌。圖4顯示的圖舉例說明乳癌細胞系在條件培養(yǎng)基中 NGAL蛋白分泌的量，其中使用Borregaard ELISA。 MDA-MB-231(來源于高轉移癌癥的細胞系)顯示最高水平的NGAL分泌；而來源于器官局限性癌癥的細胞系(MCF-7和T-47D )中有顯著更少的分泌。
然而，發(fā)明人在以下數(shù)據(jù)中表明，游離的尿液NGAL蛋白可用作乳癌和/或卵巢癌的生物標志物。具體來說，與來自不具有癌癥之患者的對照尿樣相比，來自具有惡性癌癥之患者的尿樣中游離NGLA的水平增加。
使用Western印跡分析測定來自無疾病、具有良性卵巢癌或具有惡性卵巢癌之患者的尿樣中的NGAL蛋白的水平(圖5A和5B)。在還原性條件下跑SDS-PAGE，以測量游離和復合的NGAL。圖5A顯示使用來自R&D Systems ( Minneapolis, MN USA )的抗人NGAL抗體進行尿樣的Western印跡分析。圖5B顯示來自無疾病、具有良性卵巢疾病或惡性卵巢癌的患者的至少5個尿樣中結果的定量分析。與來自無疾病個體的樣品相比，具有惡性卵巢癌的患者顯示更高量的尿中NGAL。這通過Borregaard ELISA測定得以證實(圖7 )。來自乳癌患者的類似尿樣分析也顯示，與無疾病患者相比，具有惡性癌癥患者的尿中有更高水平的NGAL (圖8 )。
進一步發(fā)現(xiàn)，與健康個體中所見水平相比，具有非典型導管增生 (ADH)(未來發(fā)生乳癌的重要風險因子)的個體具有更高水平的尿中游離NGAL。使用抗NGAL抗體(其僅識別游離NGAL，來自NGALELISA試劑盒存DLCN20，來自R&D Systems, Minneapolis, MN USA ) 的ELISA測定被用于評價游離NGAL的水平，其結果示于圖9。使用 R&D ELISA,與健康個體中所見水平相比，還在具有原位導管癌 (DCIS)(最常見類型的非侵襲性乳癌)的個體以及具有侵襲性乳癌 (IBC)的個體中檢測到游離NGAL的水平增加(圖12)。
游離NGAL至少以單體、二聚體和三聚體形式存在于尿液中。根據(jù)本發(fā)明公開內(nèi)容有可能檢測尿液中游離的單體NGAL 。在此情況下，使用NGAL ELISA試劑盒弁DLCN20 (來自R&D Systems, Minneapolis, MNUSA)進行了研究。單體NGAL的存在性似乎尤其指示良性和惡性卵巢癌癥，如圖13所示。圖13顯示，與正常樣品相比，在來自具有良性和惡性腫瘤之患者的卵巢癌尿樣中存在的游離NGAL單體的量。惡性腫瘤樣品表現(xiàn)出比良性樣品群體高得多的游離NGAL水平。
因此，測量尿液中游離NGAL水平提供了可用于確定個體是否具有癌癥或者發(fā)生癌癥的風險是否增加，其中所述癌癥例如是上皮起源的細胞，比如乳癌和/或卵巢癌。與年齡和性別匹配的對照樣品相比較，更高的尿中游離NGAL水平指示了所述個體或者具有癌癥，或者有發(fā) 生乳癌和/或卵巢癌。陽性測試指示了應該進一步測試個體中癌癥并相應地監(jiān)測所述癌癥。
實施例2
iVC^4丄#與丄發(fā)-/可尤^#換(^AfTV
上皮-間充質轉換(EMT)是重要的過程，其中上皮細胞獲得間充
腫瘤進展和惡性轉化期間發(fā)生EMT樣事件，從而向癌細胞賦予侵襲性和轉移性(Laruel et al. (2005)24， 7443-7454 )。
為了評估NGAL在攻擊性癌癥發(fā)展中的潛在作用，我們制備了過表達NGAL的穩(wěn)定MCF-7細胞系Nl和N2。MCF-7是很少表達NGAL 的乳癌細胞系。我們發(fā)現(xiàn)，Nl和N2細胞克隆(過表達NGAL的MCF-7 細胞)表現(xiàn)出間充質樣表型，這些細胞喪失了細胞接觸，更均勻地散布于細胞表面(數(shù)據(jù)未示出)。
過表達NGAL之細胞的遷移使用BD Falcon HTS FluoroBlok 24-多孔插入系統(tǒng)(BD Bioscience, Bedford, MA)根據(jù)制造商說明來評價。 MCF-7對照和過表達NGAL的細胞(Nl/N2 )生長到70%匯合，然后用胰酶處理并重懸于無血清培養(yǎng)基中。將5xl04個細胞種植于頂部室中。使用完全培養(yǎng)基(750 nl )作為趨化劑并加入下部室中。在37。C、 5% C02 培養(yǎng)箱中孵育24小時后，從上部室中去除培養(yǎng)基。然后將插板轉至新的24孔板中并在37。C、 5% C02下孵育1小時，其中所述24孔板含 0.5ml/孔的10 jiM CellTracker CMFDA (Molecular Probes )。 BD FluoroBlok膜只允許在熒光顯微鏡下顯示遷移通過膜的標記細胞。該測定的結果清楚表明，過表達NGAL增加遷移率。過表達NGAL的細胞比親本MCF-7細胞遷移得更快(圖10 )。
此外，過表達NGAL還刺激細胞侵襲。過表達NGAL細胞的侵襲性4吏用24孑L BD BioCoat腫瘤寸曼襲系統(tǒng)(BD Bioscience, Bedford, MA)根據(jù)制造商說明來評價。在該系統(tǒng)中，F(xiàn)luoroBlok膜用Matrigel 層覆蓋。MCF-7對照和過表達NGAL的細胞(Nl/N2 )生長到70%匯合，然后用胰酶處理并重懸于無血清培養(yǎng)基中。將5"04個細胞種植于頂部室中。使用完全培養(yǎng)基(750 pi)作為趨化劑并加入下部室中.在 37。C、 5% C02培養(yǎng)箱中孵育24小時后，從上部室中去除培養(yǎng)基.然后將插板轉至新的24孔板中并在37。C、 5% C02下孵育l小時，其中所述24孔板含0.5ml/孔的10 jiM CellTracker CMFDA (Molecular Probes )。 BD FluoroBlok膜只允許在熒光顯微鏡下顯示侵入通過BD MatrigelTM膜的標記細胞。該測定的結果表明，過表達NGAL可增加侵: 襲性(圖11 )。
我們還評估了 NGAL調(diào)節(jié)已知參與上皮間充質轉換(EMT )的分子的能力。使用RT-PCR和所述過表達NGAL的細胞系，我們發(fā)現(xiàn)過表達NGAL可增加間充質標志物波形蛋白和纖連蛋白的表達(數(shù)據(jù)未示出)。過表達NGAL可減少ERa和E-鉤粘蛋白表達，然而其增加Slug (調(diào)節(jié)EMT的轉錄因子)的表達。因此，NGAL參與細胞表型的發(fā)育，這與在攻擊性癌癥中的發(fā)現(xiàn) 相一致。
等同物
本領域技術人員將意識到或者能夠確定，使用不超過常規(guī)實驗，有多種與本文所述特定過程等同的方案。這種等同方案被認為在本發(fā)明
范圍內(nèi)并且涵蓋于以下的權利要求中?？梢詫Ρ景l(fā)明做出各種替代、變化和改進，而不背離權利要求所定義的本發(fā)明的宗旨和范圍。其他方面、優(yōu)點和改進也在本發(fā)明范圍內(nèi)。本申請中引用的所有參考文獻、授權專利和公開專利申請的內(nèi)容通過參考并入本文。這些專利、申請和其他文獻中合適的組分、過程和方法可選用于本發(fā)明及其實施方案。
參考文獻
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權利要求
1. 用于檢測個體是否有發(fā)生癌癥的風險或者是否已經(jīng)發(fā)生癌癥的方法，其包括以下步驟a)測定由個體所得測試尿樣中游離NGAL的水平；b)將所述測試尿樣中游離NGAL水平與游離NGAL的對照水平進行比較；其中測試尿樣中游離NGAL水平高于游離NGAL的對照水平指示所述個體發(fā)生癌癥的風險增加或者所述個體有癌癥。
2. 權利要求l的方法，其中所述癌癥是上皮起源的癌癥。
3. 權利要求l的方法，其中所述上皮起源的癌癥選自乳癌、基底細胞癌、腺癌、胃腸癌、唇癌、口癌、食管癌、小腸癌、胃癌、結腸癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、皮膚癌、腎癌、前列腺癌和腎細胞癌。
4. 權利要求l的方法，其中所述癌癥是乳癌和/或卵巢癌。
5. 權利要求l的方法，其中所檢測的游離NGAL的水平包括單體 NGAL。
6. 權利要求l的方法，其中通過包括以下步驟的方法測量所述游離NGAL水平a)使所述測試樣品或其制備物接觸基于抗體的結合結構以形成抗體-NGAL復合物，所述基于抗體的結合結構優(yōu)先結合游離NGAL;和b )檢測所述抗體-NGAL復合物的存在性，從而測量所存在的游離NGAL水平。
7. 權利要求l的方法，其中所述基于抗體的結合結構用可檢測標記物標記。
8. 權利要求l的方法，其中所述標記物選自放射性標記物、半抗原標記物、熒光標記物和酶標記物。
9. 權利要求l的方法，其中所述基于抗體的結合結構是抗體。
10. 權利要求l的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
11. 權利要求l的方法，還包括評估所述結果的步驟，并且如果所述尿具有比游離NGAL對照水平更高的游離NGAL水平，則指導所述個體進一步檢測癌癥。
12. 權利要求l的方法，其中通過質鐠方法測量所述游離NGAL 水平。
13. 權利要求l的方法，其中所述個體是癌癥治療后患者，當所述測試樣品中游離NGAL水平高于游離NGAL的對照水平時，則指導所述癌癥治療后患者進行癌癥復發(fā)治療。
14. 癌癥分期方法，其包括以下步驟a)測定由個體所得測試尿樣中游離NGAL的水平；b )將所述測試尿樣中游離NGAL水平與游離NGAL的對照水平進行比較；其中測試尿樣中游離NGAL水平高于游離NGAL的對照水平指示所述個體發(fā)生惡性或轉移性癌癥的風險增加或者所述個體有惡性或轉移性癌癥。
15. 權利要求1的方法，其中所述游離NGAL包括單體NGAL。
16. 權利要求l的方法，其中所述對照水平是與健康個體相關的游離NGAL水平。
17. 檢測尿樣中游離NGAL的試劑盒，其包含保持尿樣的容器、至少一種優(yōu)先結合游離NGAL的抗體、和使用說明。
18. 權利要求l的試劑盒，其中所述試劑盒包含至少兩種優(yōu)先結合 NGAL的抗體，其中一種抗體固定到固相上，另一種抗體被可檢測性標記。
19. 監(jiān)測個體中癌癥或癌癥發(fā)生風險的方法，其包括以下步驟a) 測定由個體所得第一測試尿樣中游離NGAL的水平以獲得第一游離NGAL水平；b) 測定由個體所得第二測試尿樣中游離NGAL的水平以獲得第二游離NGAL氷平；和c) 比較第一和笫二游離NGAL水平。
20. 權利要求l的方法，其中當?shù)诙礁哂诘谝凰綍r，所述個體具有或發(fā)生癌癥的風險增加，或者所述個體具有或發(fā)生轉移性癌癥的風險增加。
21. 權利要求l的方法，其中所述個體是癌癥治療后患者，并且當第二水平高于第一水平時，指導所述癌癥治療后患者進行癌癥復發(fā)治療。
22. 監(jiān)測癌癥治療后患者中癌癥復發(fā)的方法，其包括以下步驟a) 測定由癌癥治療后患者所得第一測試尿樣中游離NGAL的水平以獲得第一游離NGAL水平；b) 測定由癌癥治療后患者所得第二測試尿樣中游離NGAL的水平以獲得第二游離NGAL水平；和c) 比較第一和第二游離NGAL水平；其中當?shù)诙礁哂诘谝凰綍r，指導所述癌癥治療后患者進行癌癥復發(fā)治療。
全文摘要
在具有非典型導管增生(ADH)3(未來發(fā)生乳癌的重要風險因子)的個體、具有卵巢癌的個體以及具有侵襲性和非侵襲性乳癌的個體中存在水平增加的非復合的中性粒細胞明膠酶相關脂質載運蛋白(NGAL)。因此，本發(fā)明涉及測量尿中非復合的NGAL水平作為初步篩選以確定個體是否有發(fā)生癌癥的風險或已經(jīng)發(fā)生癌癥，所述癌癥如上皮起源的癌癥，包括乳癌和卵巢癌。
文檔編號G01N33/574GK101421622SQ200780013595
公開日2009年4月29日申請日期2007年2月16日優(yōu)先權日2006年2月17日
發(fā)明者江楊, 瑪莎·A·莫塞斯申請人:兒童醫(yī)學中心公司

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