癌癥生物標(biāo)志物的制作方法
【專利摘要】基于檢測存在衛(wèi)星重復(fù)和/或Line-1表達(dá)水平升高診斷癌癥的方法。
【專利說明】癌癥生物標(biāo)志物
[0001]優(yōu)先權(quán)要求
[0002]本申請要求2010年10月7日提交的美國臨時專利申請流水號61/390，956和2011年6月6日提交的61/493，800的權(quán)益。前述專利的全部內(nèi)容在此通過提及而收錄。
發(fā)明領(lǐng)域
[0003]本發(fā)明涉及基于檢測存在衛(wèi)星重復(fù)和/或Line-1表達(dá)水平升高診斷癌癥的方法。
[0004]發(fā)明背景
[0005]全基因組測序方法已經(jīng)揭示了越來越多的一批轉(zhuǎn)錄非編碼序列，包括通過與轉(zhuǎn)錄沉默和染色體完整性聯(lián)系的基因組異染色質(zhì)區(qū)實(shí)現(xiàn)的“彌漫轉(zhuǎn)錄(pervasivetranscription)”(J.Berretta,A.MoriI1n, EMBO ReplO, 973 (2009 年 9 月)；Α.Jacquier, Nat Rev GenetlO，833 (2009年12月))。在小鼠中，異染色質(zhì)由形成有絲分裂紡錘體復(fù)合物和可靠的染色體分離需要的著絲粒(次要)和臂間(pericentric)(主要)衛(wèi)星重復(fù)構(gòu)成(M.Guenatri, D.Bailly, C.Maison, G.Almouzni, J Cell Bioll66, 493 (2004年8月16日))，而人衛(wèi)星重復(fù)已經(jīng)分成具有相似功能的多個類別(J.Jurka等，CytogenetGenome ResllO, 462 (2005)) ?酵母中衛(wèi)星的雙向轉(zhuǎn)錄經(jīng)由切酶介導(dǎo)的RNA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄沉默(RITS)及經(jīng)由最近鑒定的切酶依賴性途徑維持著絲粒DNA的沉默(M.Halic，D.MoaZed，Celll40，504(2月19日))，盡管哺乳動物中著絲粒衛(wèi)星沉默機(jī)制限定得不太好(A.A.Aravin, G.J.Hannon, J.Brennecke, Science318, 761 (2007 年 11月 2 日))。小鼠和人細(xì)胞系中衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物的積累源自切酶I缺陷(C.Kanellopoulou等，Genes Devl9, 489 (2005年 2 月 15 日)；T.Fukagawa 等，Nat Cell Biol6, 784 (2004 年 8 月))及源自 DNA 去甲基化、熱休克、或凋亡的誘導(dǎo)(H.Bouzinba-Segard, A.Guais, C.Francastel, Proc Natl Acad SciU S A103, 8709(2006年6月 6 日)；R.Valgardsdottir 等，Nucleic Acids Res36, 423(2008年2月))。還已經(jīng)將培養(yǎng)細(xì)胞中應(yīng)激誘導(dǎo)的衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄與編碼RNA聚合酶活性的反轉(zhuǎn)錄元件諸如 LINE-1 (LlTDl)激活聯(lián)系起來(D.Ugarkovic, EMBO R印6，1035(2005 年 11 月)；D.M.Carone等，Chromosomal 18, 113 (2009年2月))。盡管有這些體外模型，尚未分析原發(fā)性腫瘤中重復(fù)ncRNA的全局表達(dá)，這是由于微陣列平臺偏愛注釋的編碼序列及從標(biāo)準(zhǔn)分析程序明確排除重復(fù)序列所致。
[0006]發(fā)明概述
[0007]本發(fā)明至少部分基于鑒定腫瘤細(xì)胞中衛(wèi)星重復(fù)的大規(guī)模表達(dá)，以及例如腫瘤細(xì)胞，包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)中Line-1的表達(dá)升高。本文中描述了基于存在衛(wèi)星重復(fù)和/或Line-1的表達(dá)水平升高來診斷癌癥，例如上皮起源的實(shí)體惡性，諸如胰腺、肺、乳腺、前列腺、腎、卵巢或結(jié)腸癌的方法。
[0008]在第一個方面，本發(fā)明提供了檢測受試者中癌癥存在的方法，例如體外方法，包括測定來自所述受試者的樣品中的LINE-1水平以獲得測試數(shù)值；并比較所述測試數(shù)值與參照數(shù)值，其中與所述參照數(shù)值相比的測試數(shù)值指示所述受試者是否具有癌癥。
[0009]在一些實(shí)施方案中，參照數(shù)值代表LINE-1的閾值水平，其中所述受試者中存在高于所述參照數(shù)值的LINE-1水平指示所述受試者具有癌癥，且所述受試者中存在低于所述參照數(shù)值的LINE-1水平指示所述受試者不太可能具有癌癥。
[0010]在第一個方面，本發(fā)明提供了檢測受試者中癌癥存在的方法，例如體外方法，包括測定來自所述受試者的樣品中衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物的水平以獲得測試數(shù)值；并比較所述測試數(shù)值與參照數(shù)值，其中與所述參照數(shù)值相比的測試數(shù)值指示所述受試者是否具有癌癥。
[0011]在一些實(shí)施方案中，所述衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物包含下列一種或多種:ALR、HSATII, GSATI1、TARl、和SSTI。在一些實(shí)施方案中，所述衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物是ALR和/或HSATII，且高于所述參照水平的ALR和/或HSATII衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物水平的存在指示所述受試者具有腫瘤。
[0012]在一些實(shí)施方案中，所述衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物是GSATI1、TARl和/或SSTl，且低于所述參照水平的GSATI1、TARl和/或SSTl衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物水平的存在指示所述受試者具有腫瘤。
[0013]在另一個方面，本發(fā)明提供了評估受試者中癌癥的治療效力的方法，例如體外方法。該方法包括測定來自所述受試者的第一樣品中的LINE-1水平以獲得第一數(shù)值；對所述受試者施用癌癥治療；測定在后來的時間時自所述受試者獲得的隨后樣品中的LINE-1水平，以獲得治療數(shù)值；并比較所述第一數(shù)值與所述治療數(shù)值。低于所述第一數(shù)值的治療數(shù)值指示所述治療是有效的。
[0014]在又一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了評估受試者中癌癥的治療效力的方法，例如體外方法。該方法包括測定來自所述受試者的第一樣品中的衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物水平以獲得第一數(shù)值；對所述受試者施用癌癥治療；測定在后來的時間時自所述受試者獲得的隨后樣品中的衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物水平，以獲得治療數(shù)值；并比較所述第一數(shù)值與所述治療數(shù)值，其中低于所述第一數(shù)值的治療數(shù)值指示所述治療是有效的。
[0015]在一些實(shí)施方案中，所述衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物包含下列一種或多種:ALR、HSATII, GSATI1、TARl^P SSTl。
`[0016]在一些實(shí)施方案中，第一和第二樣品已知或懷疑包含腫瘤細(xì)胞，例如，已知或懷疑包含循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的血液樣品，或已知或懷疑包含腫瘤細(xì)胞的活組織檢查樣品。在一些實(shí)施方案中,所述樣品包含血清中游離的RNA或血液中外來體內(nèi)的RNA。
[0017]在一些實(shí)施方案中，所述治療包括施用手術(shù)干預(yù)、化學(xué)療法、放射療法、或其組合。
[0018]在本文中所描述的方法的一些實(shí)施方案中，受試者是哺乳動物，例如人或獸醫(yī)受試者，例如實(shí)驗(yàn)動物。
[0019]在本文中所描述的方法的一些實(shí)施方案中，癌癥是上皮起源的實(shí)體瘤，例如胰腺、肺、乳腺、前列腺、腎、卵巢或結(jié)腸癌。
[0020]在一些實(shí)施方案中，本文中所描述的方法包括測量LINE-1轉(zhuǎn)錄物水平。
[0021]在本文中所描述的方法的一些實(shí)施方案中，使用分支DNA測定法測定LINE-1轉(zhuǎn)錄物或衛(wèi)星的水平。
[0022]除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員的通常理解具有相同的意義。本文中描述了本發(fā)明中使用的方法和材料；也可以使用本領(lǐng)域中已知的其它合適的方法和材料。材料、方法和例子僅是例示性，而并不意圖為限制性的。通過提及將本文中提及的所有出版物、專利申請、專利、序列、數(shù)據(jù)庫條目、和其它出版物完整收錄。在沖突的情況中，應(yīng)當(dāng)以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。
[0023]本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)通過以下詳細(xì)描述和圖，以及通過權(quán)利要求書會是顯而易見的。
[0024]附圖簡述
[0025]圖1A是一幅柱形圖，其顯示了不同腫瘤、細(xì)胞系、和組織中占所有基因組比對閱讀的百分比的主要衛(wèi)星水平。每種腫瘤類型和細(xì)胞系下面標(biāo)示原發(fā)性腫瘤和細(xì)胞系的基因型。(Kras=KrasG12D ;Tp53、SMAD4、和 APC 代表缺失的基因)。
[0026]圖1B是所有原發(fā)性腫瘤、癌細(xì)胞系、和正常組織中來自主要衛(wèi)星的序列閱讀分布的示意圖。
[0027]圖2Α顯示了對三種KrasG12D、Tp531ox/+胰腺原發(fā)性腫瘤(腫瘤1_3)和源自腫瘤3的穩(wěn)定細(xì)胞系(CL3)的Northern印跡分析的結(jié)果。
[0028]圖2B顯示了用DNA低甲基化劑(hypomethylating agent) 5-阿扎胞苷(azacitadine, AZA)處理之前(O)和之后(+)對CL3的Northern印跡分析的結(jié)果。
[0029]圖2C顯示了對來自多份成年和胎兒小鼠組織的總RNA的Northern印跡分析的結(jié)果。所有Northern印跡暴露于約30分鐘。
[0030]圖2D是一對顯微照片，其顯示了與Ikb主要衛(wèi)星重復(fù)探針雜交的正常胰腺(左偵D和原發(fā)性胰管腺癌(右側(cè))的RNA原位雜交(ISH)的結(jié)果。
[0031]圖2E是一組三幅顯微照片，其顯示了對新生物前(preneoplastic)PanIN(P)損傷、其相鄰的PDAC(T)和正常胰腺(N)的ISH分析的結(jié)果，顯示PanIN中的正染色，整個癌瘤中表達(dá)升高。PanIN(左側(cè))和PDAC (右側(cè))損傷的較高放大率(40x)。
[0032]圖2F是一組三幅顯微照片，其顯示了對肝(其自身不表達(dá)衛(wèi)星)轉(zhuǎn)移性的PDAC細(xì)胞中衛(wèi)星的明顯表達(dá)(左側(cè)) 。通過標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)評估和衛(wèi)星染色容易地鑒定大的腺性轉(zhuǎn)移性腫瘤沉積物(中間)。衛(wèi)星ISH靈敏得足以檢出通過標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)分析不容易察覺的肝實(shí)質(zhì)中的微轉(zhuǎn)移(右側(cè)；箭頭)。所有圖像為20x放大率(比例尺=100 μ m)。
[0033]圖3A是一幅柱形圖，其顯示了通過DGE定量的人胰管腺癌(PDAC)、正常胰腺、其它癌癥(L:肺，K:腎，O:卵巢，P:前列腺)、和其它正常人組織(1:胎兒腦，2:腦，3:結(jié)腸，4:胎兒肝，5:肝，6:肺，7:腎，8:胎盤，9:前列腺，及10:子宮)中的總衛(wèi)星表達(dá)。衛(wèi)星表達(dá)以與人基因組比對的每百萬的轉(zhuǎn)錄物顯示。
[0034]圖3B是一幅柱形圖，其顯示了作為占測序的人PDAC(黑色，n=15)和正常人組織(白色，n=12)中總衛(wèi)星的百分比的衛(wèi)星重復(fù)類別的分類。衛(wèi)星從腫瘤中的最高絕對差異至正常組織中的最高絕對差異排序(左側(cè)至右側(cè))。誤差棒代表均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。顯示了頂部三種癌癥(左側(cè)，黑色柱形)和正常(右側(cè)，白色柱形)組織衛(wèi)星類別(柱形圖，中心)的倍數(shù)差異。
[0035]圖4A顯示了所有小鼠腫瘤和正常組織中主要衛(wèi)星與其它細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物的多線性相關(guān)分析的結(jié)果，如通過熱圖(heat map)描繪的。x軸是根據(jù)主要衛(wèi)星表達(dá)排序的樣品，而y軸是根據(jù)與主要衛(wèi)星表達(dá)的線性相關(guān)排序的基因。淺灰色(高)和暗灰色(低)顏色是log2(每百萬的閱讀)。主要衛(wèi)星表達(dá)作為通過具有最高線性(R≤0.85)及衛(wèi)星水平的頂部基因的展開圖根據(jù)衛(wèi)星閱讀(X-軸)等級排序的百分比基因組比對閱讀(y軸)。
[0036]圖4B是一幅點(diǎn)圖，其顯示了所有基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與Line-1元件的中值距離，其以與衛(wèi)星表達(dá)的線性(暗灰色；左側(cè)的最高線性)或隨機(jī)(亮灰色)排序。通過在100s中二進(jìn)制化(binned)的基因繪圖[0037]圖4C是一幅顯示了具有最高線性(R>0.85)的頂部基因的點(diǎn)圖，其限定與這些基因的預(yù)期頻率(亮灰色)相比通過針對轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與LINE-1元件的距離的頻率(暗灰色)繪圖的衛(wèi)星相關(guān)基因或SCG。
[0038]圖4D是一組四幅顯微照片，其顯示了小鼠PDAC (KrasG 12D，Tp531ox/+)在神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物嗜鉻粒蛋白A方面的免疫組織化學(xué)的結(jié)果。腫瘤以升高的嗜鉻粒蛋白A染色(暗灰色)的函數(shù)描繪，其中在每幅圖的底部對每個腫瘤記錄主要衛(wèi)星表達(dá)的相對水平(占所有轉(zhuǎn)錄物的百分比)。
[0039]圖5是一幅柱形圖，其標(biāo)示CTC裝置對對照裝置中指定基因的倍數(shù)變化表達(dá)。受試者是新診斷的轉(zhuǎn)移性胰腺腺癌患者。在某個點(diǎn)時在所有患者中看到LINE-1表達(dá)。
[0040]圖6Α是經(jīng)福爾馬林固定的經(jīng)石蠟包埋的組織(頂部圖像)中人新生物前PanIN(P)損傷及相鄰的非癌性基質(zhì)組織(N)和PDAC的細(xì)針抽吸活組織檢查(T)和正常相鄰白細(xì)胞(N)中人衛(wèi)星HSATII的RNA原位雜交(RNA-1SH)圖像。。(暗灰色點(diǎn)=HSATII)。比例尺=100 μ m。
[0041]圖6B是使用HB-芯片上捕獲的潛在人胰腺循環(huán)腫瘤細(xì)胞的Affymetrix ViewRNA進(jìn)行HSATII的RNA原位雜交的圖像。HSATII (最亮的區(qū)域；最初為黃色)、DAPI核染色(中等灰色區(qū)域，最初為藍(lán)色)。比例尺=20 μ m。
[0042]發(fā)明詳述
[0043]本發(fā)明至少部分基于鑒定來自小鼠腫瘤模型中的主要衛(wèi)星重復(fù)及來自人癌癥中的ALR和HSATII衛(wèi)星重復(fù)的LINE-1蛋白和雙向ncRNA的大規(guī)模生成。這些癌癥中衛(wèi)星水平的異常幅度是無先例的。這可能源自影響衛(wèi)星和LINE-1反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子兩者的染色體標(biāo)志的一般性去阻抑，及接近潛在影響選定的細(xì)胞mRNA表達(dá)的LINE-1激活?？傊?，衛(wèi)星的非常高的表達(dá)可以影響染色`體完整性和遺傳穩(wěn)定性，而共脫調(diào)節(jié)(co-deregulated)的編碼序列可以影響癌細(xì)胞的細(xì)胞命運(yùn)和生物學(xué)行為。另外，人胰腺癌中特定衛(wèi)星子集的大規(guī)模表達(dá)的發(fā)現(xiàn)為在癌癥的早期檢測中應(yīng)用提供一種新穎的生物標(biāo)志物。最終，LINE-1水平在來自具有新診斷的轉(zhuǎn)移性胰腺腺癌的受試者的循環(huán)腫瘤細(xì)胞中是升高的。如此，本方法可用于早期檢測癌癥，并且可以用于預(yù)測臨床后果。
[0044]俥用轉(zhuǎn)錄物牛物標(biāo)志物診斷癌癥
[0045]可以使用本文中所描述的方法在受試者中診斷癌癥及監(jiān)測癌癥治療效力，所述癌癥例如上皮起源的實(shí)體瘤，例如胰腺、肺、乳腺、前列腺、腎、卵巢或結(jié)腸癌。
[0046]如本文中所使用的，術(shù)語“過度增殖性”指具有自主生長(即，以快速增殖細(xì)胞生長為特征的異常狀態(tài)或狀況)的能力的細(xì)胞。過度增殖性疾病狀態(tài)可以分類為病理學(xué)的，即表征或構(gòu)成疾病狀態(tài)，或者可以表征為非病理學(xué)的，即偏離正常，但是與疾病狀態(tài)沒有聯(lián)系。該術(shù)語意圖包括所有類型的癌性生長或致癌過程、轉(zhuǎn)移性組織或惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織、或器官，而不管組織病理學(xué)類型或侵入性階段。“腫瘤”是過度增殖細(xì)胞的異常生長?！鞍┌Y”指例如以惡性腫瘤生長為特征的病理學(xué)疾病狀態(tài)。
[0047]如本文中表明的，癌癥，例如上皮起源的實(shí)體瘤，例如如由ICD-0(國際疾病分類:腫瘤學(xué))代碼(修正版3)，部分(8010-8790)限定的，例如早期階段癌癥的存在與由于胰腺癌細(xì)胞中衛(wèi)星重復(fù)的轉(zhuǎn)錄和加工升高所致的衛(wèi)星大規(guī)模水平，及循環(huán)腫瘤細(xì)胞中LINE-1表達(dá)水平升高的存在有關(guān)。如此，所述方法可以包括檢測樣品中衛(wèi)星重復(fù)的表達(dá)水平，所述樣品包含已知或懷疑是腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞，例如來自上皮起源的實(shí)體瘤的細(xì)胞，例如胰腺、肺、乳腺(breast)、前列腺、腎、卵巢或結(jié)腸癌細(xì)胞?；蛘?另外，所述方法可以包括例如使用如本文中所描述的微射流裝置來檢測樣品中LINE-1的水平升高，所述樣品例如是已知或懷疑包含腫瘤細(xì)胞，例如循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的樣品。
[0048]上皮起源的癌癥可以包括胰腺癌(例如，胰腺腺癌或管內(nèi)乳頭狀粘液癌(IPMN，胰腺塊))、肺癌(例如，非小細(xì)胞肺癌)、前列腺癌、乳腺癌、腎癌、卵巢癌、或結(jié)腸癌。例如，可以使用本方法來區(qū)別良性IPMN(對其監(jiān)視是標(biāo)準(zhǔn)的處理)和惡性IPMN(其需要切除，即一種與顯著的發(fā)病率且小的但是顯著的死亡概率有關(guān)的規(guī)程)。在一些實(shí)施方案中，在診斷為IPMN的受試者中，可以使用本文中所描述的方法來監(jiān)視/監(jiān)測受試者，例如，可以在選定的時間間隔(例如，每3、6、12、或24個月)重復(fù)所述方法以檢測良性IPMN是否已經(jīng)變?yōu)闇?zhǔn)許手術(shù)干預(yù)的惡性IPMN。另外，在一些實(shí)施方案中，可以在來自懷疑具有非小細(xì)胞肺癌的受試者的樣品中使用所述方法來區(qū)別細(xì)支氣管肺泡癌與反應(yīng)性過程(例如，肺炎后反應(yīng)性過程)。在一些實(shí)施方案中，在來自懷疑具有乳腺癌的受試者的樣品中，可以使用所述方法來區(qū)別導(dǎo)管增生與非典型性導(dǎo)管增生和原位管癌(DCIS)。后兩種種類接受切除/放射；前一種不需要干預(yù)。在一些實(shí)施方案中，在懷疑具有前列腺癌的受試者中，可以使用所述方法來區(qū)別非典型性小腺泡增殖和惡性癌癥。在一些實(shí)施方案中，在懷疑具有膀胱癌的受試者中，可以使用所述方法來檢測例如尿樣本中移行細(xì)胞癌(TCC)。在一些實(shí)施方案中，在診斷為巴雷特(Barrett)氏食管的受試者中(Sharma, N Engl J Med.2009, 24; 361 (26): 2548-56.Erratum in:N Engl J Med.2010年4月15日；362 (15): 1450)，可以使用所述方法來區(qū)別巴雷特氏食管中的發(fā)育異常與反應(yīng)性過程。臨床含意是重大的，因?yàn)榘l(fā)育異常的診斷要求治療性干預(yù)。其它實(shí)施方案包括但不限于診斷充分分化的肝細(xì)胞癌、壺腹和膽管癌、膠質(zhì)瘤對反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)瘤病(reactive gliosis)、黑素瘤對皮膚痣、低度肉瘤、和胰腺內(nèi)分泌腫瘤，等等。
[0049]因此，本文中包括用于診斷受試者中的癌癥的方法，所述癌癥例如是上皮起源的腫瘤，例如胰腺、肺、乳腺、前列腺、腎、卵巢或結(jié)腸癌。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括自受試者獲得樣品，并評估樣品中LINE-1或衛(wèi)星的存在和/或水平，并與一種或多種參照比較所述存在和/或水平，所述`參照物例如是代表LINE-1或衛(wèi)星的正常水平的對照參照，例如不受影響的受試者或來自同一受試者的正常細(xì)胞中水平，和/或代表與癌癥有關(guān)的LINE-1或衛(wèi)星的水平的疾病參照，例如具有胰腺、肺、乳腺、前列腺、腎、卵巢或結(jié)腸癌的受試者中的水平。
[0050]也可以使用本方法來測定癌癥的階段，例如樣品是否包含來自癌前損傷、早期階段腫瘤、或晚期腫瘤的細(xì)胞。例如，可以使用本方法來測定受試者是否具有癌前胰腺、乳腺、或前列腺損傷。在使用的標(biāo)志物是LINE-1、或衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物ALR和/或HSATII的情況中，升高水平與晚期階段相關(guān)聯(lián)。對于衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物GSATI1、TAR1和/或SST1，降低水平與漸增的階段相關(guān)聯(lián)。另外，LINE-1和衛(wèi)星ALR和/或HSATII的水平對于臨床結(jié)果可以是預(yù)后的且預(yù)測的。
[0051]樣品
[0052]在本方法的一些實(shí)施方案中，樣品是或者包括血液、血清、和/或血漿、或其部分或亞級分，例如血清中游離的RNA或血液中外來體內(nèi)的RNA。在一些實(shí)施方案中，樣品包含(或懷疑包含)CTC。在一些實(shí)施方案中，樣品是或者包含尿液或其部分或亞級分。在一些實(shí)施方案中，樣品包含已知或懷疑的腫瘤細(xì)胞，例如是活組織檢查樣品，例如細(xì)針抽吸物(FNA)、內(nèi)窺鏡活組織檢查、或芯針活組織檢查；在一些實(shí)施方案中,樣品包含來自受試者的胰腺、肺、乳腺、前列腺、腎、卵巢或結(jié)腸的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，樣品包含自痰樣品或通過刷、清洗、支氣管鏡活組織檢查、經(jīng)支氣管活組織檢查、或FNA，例如支氣管鏡、熒光鏡、或CT引導(dǎo)的FNA(也可以使用此類方法來自其它組織獲得樣品)自受試者的肺獲得肺細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，將樣品冷凍，固定和/或透化，例如是經(jīng)福爾馬林固定的經(jīng)石蠟包埋的(FFPE)樣品。
[0053]衛(wèi)星表達(dá)水平
[0054]在一些實(shí)施方案中，例如在已知或懷疑包含腫瘤細(xì)胞的樣品中檢測衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物的水平。在一些實(shí)施方案中，將已知或懷疑的腫瘤細(xì)胞(例如，測試細(xì)胞)中的衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物水平與參照水平比較。
[0055]在一些實(shí)施方案中，所述方法包括檢測alpha(ALR)衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物(D.Lipson等，NatBiotechnol27, 652 (2009 年 7 月))或 HSATII 衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物(J.Jurka 等,Cytogenet GenomeResllO, 462(2005))的水平；在一些實(shí)施方案中，將那些水平與參照比較。在一些實(shí)施方案中，參照水平是正常(非癌性)細(xì)胞，例如來自同一受試者的正常細(xì)胞中的ALR和/或HSATII衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物水平，或自正常細(xì)胞分組測定的參照水平；測試細(xì)胞中高于正常細(xì)胞中的ALR和/或HSATII水平的ALR和/或HSATII水平的存在指示測試細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞(例如，測試細(xì)胞來源的受試者具有或可以診斷為癌癥)。在一些實(shí)施方案中，ALR和/或HSATII轉(zhuǎn)錄物的參照水平是閾值水平，并且高于閾值水平的ALR和/或HSATII衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物水平的存在指示細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞(例如，測試細(xì)胞來源的受試者具有或可以診斷為癌癥)。
[0056]在一些實(shí)施方案中，所述方法包括檢測GSATI1、TARl和/或SSTl轉(zhuǎn)錄物的水平；在一些實(shí)施方案中，將那些水平與參照比較。在一些實(shí)施方案中，參照水平是正常(非癌性)細(xì)胞，例如來自同一受試者的正常細(xì)胞中的GSATI1、TARl和/或SSTl衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物水平，或自正常細(xì)胞分組測定的參照`水平；測試細(xì)胞中低于正常細(xì)胞中的GSATI1、TAR1和/或SSTl水平的GSATI1、TAR1和/或SSTl水平的存在指示測試細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞(例如，測試細(xì)胞來源的受試者具有或可以診斷為癌癥)。在一些實(shí)施方案中，GSATI1、TARl和/或SSTl轉(zhuǎn)錄物的參照水平是閾值水平，并且低于閾值的GSATI1、TAR1和/或SSTl衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物水平的存在指示細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞(例如，測試細(xì)胞來源的受試者具有或可以診斷為癌癥)。
[0057]在一些實(shí)施方案中，相對非變體轉(zhuǎn)錄物諸如GAPDH、肌動蛋白、或微管蛋白標(biāo)準(zhǔn)化衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物水平，例如將衛(wèi)星的表達(dá)水平與非變體轉(zhuǎn)錄物比較。例如，可以計(jì)算表達(dá)水平的比率，并且可以將該比率與正常(非癌性)細(xì)胞中的比率比較。例如，在一些實(shí)施方案中，超過10:1，例如超過50: 1、超過100: 1、或超過150:1 ^ ALR:GAPDH比率的存在指示測試細(xì)胞是癌細(xì)胞；在一些實(shí)施方案中，約3:1或5:1的ALR:GAPDH比率的存在指示測試細(xì)胞是正常細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，超過10:1，例如20:1、30:1、40:1、或45:1的HSATII衛(wèi)星:GAPDH轉(zhuǎn)錄物比率的存在指示測試細(xì)胞是癌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，HSATII的顯著(例如，t匕對的每百萬的超過約100個轉(zhuǎn)錄物)水平的存在指示測試細(xì)胞是癌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，HSATII的非常低的水平(例如，比對的每百萬的小于約20個轉(zhuǎn)錄物)的缺乏或存在指示測試細(xì)胞是正常細(xì)胞。[0058]下文是可以用于ALR(包括其變體)和HSATII轉(zhuǎn)錄物的例示性參照序列:
[0059]>ALR SAT 人
[0060]aattctcagtaacttccttgtgttgtgtgtattcaactcacagagttgaacgatcctttacacagagcag acttgaaacactctttttgtggaatttgcaagtggagatttcagccgctttgaggtcaatggtagaatag gaaatatcttcctatagaaactagacagaat(SEQ ID NO:1)
[0061]>ALR1 SAT 人
[0062]teattctcagaaactretttgtgatgtgtgcrttcaactcacagagtttaacctttcttttgatagagca gtttggaaacactctgtttgtaaagtctgcaagtggatatttggacctctttgaggccttcgttggaaac gggatttcttcatataatgctagacagaaga(SEQ ID NO:2)
[0063]>ALR2 SAT 人
[0064]agctttctgagaaactgctttgtgatgtgtgcattcatctcacagagttaaacctttcttttgattcagc agtttggaaacactgtttttgtagaatctgtgaagggatatttgggagctcattgaggcctatggtgaaa aagaaaatatcttcagataaaaactagaaggaagctatc(SEQ ID NO:3)
[0065]>ALRa SAT 靈長類
[0066]ctatctgagaaactgctttgtgatgtgtgcattcatctcacagagttaaacctttcttttgattcagcag tttggaaacactgtttttgtagaatctgcgaagggacatttgggagctcattgaggcctatggtgaaaaa gcgaatatccccagataaaaactagaaagaag(SEQ ID NO:4)
[0067]>ALRa—SAT 靈長類
[0068]ttgtagaatctgcgaagggacatttgggagctcattgaggcctatggtgaaaaagcgaatatccccagat aaaaactagaaagaagctatctgagaaactgctttgtgatgtgtgcattcatctcacagagttaaacctt tcttttgattcagcagtttggaaacactgttt(SEQ ID NO:5)
[0069]>ALRb SAT 靈長類
[0070]ttgtggaatttgcaagtggagatttcaagcgctttgaggccaawnktagaaaaggaaatatcttcgtata aaaactagacagaataattctcagtaacttctttgtgttgtgtgtattcaactcacagagttgaaccttc ctttagacagagcagatttgaaacactcttt(SEQ ID NO:6)
[0071]>ALR—SAT 靈長類
[0072]ttgtagaatctgcaagtggatatttggasckctttgaggmcttcgktggaaacgggaatatcttcacata aaaactagacagaagcattctcagaaacttctttgtgatgtttgcattcaactcacagagttgaacmttc cttttgatagagcagttttgaaacactcttt(SEQ ID NO:7)
[0073]>HSATII SAT 靈長類
[0074]ccattcgattccattcgatgattccattcgattccattcgatgatgattccattcgattccattcgatga ttccattcgattccattcgatgatgattccattcgattccattcgatgattccattcgattccattcgat gatgattccattcgattccattcgatgatt(SEQ ID NO:8)
[0075]Line-1 水平
[0076]長散在核苷酸元件(LINE)非LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(Singer, Cell28 (3):433 - 4 (1982))是一組大量存在于真核基因組中，并且生成插入突變，促成基因組不穩(wěn)定性及革新，并且可以改變基因表達(dá)的遺傳元件。
[0077]規(guī)范的全長LINE-1元件是長度約6千堿基(kb)，并且包括具有內(nèi)部RNA聚合酶11啟動子的 5’非翻譯區(qū)(UTR) (Swergold, Mol Cell Biol.10(12): 6718-29 (1990))、兩個可讀框(稱作ORFl和0RF2)和含有以可變長度的富含寡dA的尾部結(jié)束的多聚腺苷酸化信號的3’UTR(Babushok and Kazazian, Hum Mutat.28 (6): 527-39 (2007))。雖然存在有人基因組中插入的超過500，000個LI元件，但是僅約80-100個拷貝是有反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座能力的(Brouha等，Proc Natl Acad Sci USA.100 (9): 5280-5.(2003))。關(guān)于更多詳情，見 Cordaux andBatzer, Nat Rev Genet.10(10):691 - 703(2009))。
[0078]例示性LINE-1序列包括變體(1)的GenBank參照號(Ref.N0.)NM_001164835.1 (核酸)和NP_001158307.1 (蛋白質(zhì));和變體2 (其是較短的轉(zhuǎn)錄物)的GenBank參照號ΝΜ_019079.4 (核酸)和ΝΡ_061952.3 (蛋白質(zhì))。變體2與變體I相比在5’UTR中有所不同，但是變體I和2兩者都編碼相同蛋白質(zhì)。還可見Gene ID: 54596。
[0079]在一些實(shí)施方案中，本文中所描述的用于診斷癌癥的方法包括測定細(xì)胞(例如，在存在于受試者血液中的CTC中)中的LINE-1mRNA水平以獲得LINE-1數(shù)值，并將該數(shù)值與合適的參照數(shù)值比較，所述參照數(shù)值例如是代表閾值水平的數(shù)值，高于所述閾值水平，受試者可以診斷為癌癥。參照也可以是數(shù)值范圍，例如其指示受試者中癌癥的嚴(yán)重性或階段?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域中已知的方法測定合適的參照數(shù)值。
[0080]在一些實(shí)施方案中，參照水平是正常(非癌性)細(xì)胞，例如來自同一受試者的正常細(xì)胞中的LINE-1轉(zhuǎn)錄物水平，或者自正常細(xì)胞分組測定的參照水平；測試細(xì)胞中高于正常細(xì)胞中的LINE-1水平的LINE-1水平的存在指示測試細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞(例如，測試細(xì)胞來源的受試者具有或可以診斷為癌癥)。在一些實(shí)施方案中，LINE-1轉(zhuǎn)錄物的參照水平是閾值水平，并且高于閾值水平的LINE-1轉(zhuǎn)錄物水平的存在指示細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞(例如，測試細(xì)胞來源的受試者具有或可以診斷為癌癥)。
[0081]檢測方法
[0082]可以使用本領(lǐng)域中已知的任何方法來檢測和/或量化生物標(biāo)志物的水平，如本文中所描述的。例如，可以使`用本領(lǐng)域中已知的方法,例如Northern印跡、RNA原位雜交(RNA-1SH)、RNA表達(dá)測定法,例如微陣列分析、RT-PCR、深度測序(deep sequencing)、克隆、Northern印跡、和定量實(shí)時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)來評估衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物或LINE-1mRNA(轉(zhuǎn)錄物)的水平。測定RNA表達(dá)的分析技術(shù)是已知的。見例如Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 3 版，Cold Spring Harbor Press, ColdSpring Harbor, NY(2001)。
[0083]在一些實(shí)施方案中，檢測LINE-1蛋白的水平?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的方法，例如，使用定量免疫測定方法諸如酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、免疫沉淀、免疫熒光、免疫組織化學(xué)、酶免疫測定法(EIA)、放射性免疫測定法(RIA)、和Western印跡分析來評估蛋白質(zhì)的存在和/或水平。
[0084]在一些實(shí)施方案中，所述方法包括使選擇性結(jié)合生物標(biāo)志物，例如衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物或LINE-1mRNA或蛋白質(zhì)(諸如寡核苷酸探針、抗體或其抗原結(jié)合部分)的藥劑與樣品接觸，以評估樣品中生物標(biāo)志物的水平。在一些實(shí)施方案中，所述藥劑攜帶可檢測標(biāo)記物。術(shù)語“標(biāo)記的”就藥劑而言涵蓋通過將可檢測物質(zhì)與所述藥劑偶聯(lián)(即，物理連接)直接標(biāo)記藥劑，及通過與可檢測物質(zhì)的反應(yīng)性間接標(biāo)記所述藥劑?？蓹z測物質(zhì)的例子是本領(lǐng)域中已知的，并且包括化學(xué)發(fā)光、熒光、放射性、或比色標(biāo)記物。例如，可檢測物質(zhì)可以包括各種酶、非朊基(prosthetic)基團(tuán)、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料、和放射性材料。合適的酶的例子包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、beta-半乳糖苷酶、或乙酰膽堿酯酶；合適的非朊基基團(tuán)復(fù)合物的例子包括鏈霉抗生物素蛋白/生物素和親合素/生物素；合適的熒光材料的例子包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三吖嗪基胺(dichlorotriazinylamine)突光素、丹磺酰氯、量子點(diǎn)、或藻紅蛋白；突光材料的例子包括魯米諾；生物發(fā)光材料的例子包括螢光素酶、螢光素、和水母發(fā)光蛋白，而合適的放射性材料的例子包括1251、m1、35S或3H。一般地，在要檢測蛋白質(zhì)的情況中，可以使用抗體?？贵w可以是多克隆，或更優(yōu)選的是單克隆。可以使用完整的抗體，或其抗原結(jié)合片段(例如Fab或 F(ab’)2)。
[0085]在一些實(shí)施方案中，可以使用高通量方法，例如如本領(lǐng)域中已知的蛋白質(zhì)或基因芯片(見例如第12章，“Genomics, ”于Griffiths等編Modern geneticAnalysis，1999，ff.H.Freeman and Company;Ekins and Chu，Trends in Biotechnology,1999;17:217-218;MacBeath and SchreiberjScience2000，289 (5485):1760-1763;Simpson，Proteins and Proteomics:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress;2002;Hardimanj Microarrays Methods and Applications:Nuts&Bolts,DNAPress, 2003)來檢測衛(wèi)星或LINE-1的存在和/或水平。
[0086]在一些實(shí)施方案中，所述方法包括使用經(jīng)修飾的RNA原位雜交技術(shù)使用分支鏈DNA測定法來直接檢測并評估樣品中的生物標(biāo)志物mRNA的水平(見例如Luo等，美國專利 N0.7，803，541B2, 2010; Canales 等，Nature Biotechnology24 (9):1115-1122(2006) ;Nguyen等，Single Molecule in situ Detection and Direct Quantiication of miRNA inCells and FFPE Tissues,告不在 panomics.com/index.php?id=product_87 可獲得)。用于實(shí)施此測定法的試劑盒可購自Affymetrix(ViewRNA)。
[0087]CTC中LINE-1和下星轉(zhuǎn)錄物的檢測
[0088]在一些實(shí)施方案中，微射流(例如“芯片上的實(shí)驗(yàn)室(lab-on-a-chip) ”)裝置可以在本方法中使用。此類裝置已經(jīng)成功用于微射流流式細(xì)胞術(shù)、基于大小的連續(xù)分離、和層析分離。一般地，可以使用在循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)中檢測衛(wèi)星或LINE-1的表達(dá)的方法來早期檢測癌癥，例如早期檢測上皮起源的腫瘤，例如胰腺、肺、乳腺、前列腺、腎、卵巢或結(jié)腸癌。
[0089]可以使用所述裝置來從細(xì)胞混合物分離CTC，或者制備富集的CTC群體。具體地，可以使用此類裝置來從復(fù)雜的混合物諸如全血分離CTC。
[0090]可以使用多種辦法來從異質(zhì)樣品分離CTC。例如，所述裝置可以包含在區(qū)塊屏障上游的微射流通道中以六邊形包裝樣式排列的多個立柱(post)的陣列?？梢杂貌煌Y(jié)合模塊使立柱和區(qū)塊屏障功能化。例如，可以用抗EPCAM抗體功能化立柱以捕捉循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)；見例如Nagrath等，Nature450:1235-1239 (2007)，任選地將下游區(qū)段屏障功能化以捕捉LINE-1核酸或蛋白質(zhì)、或衛(wèi)星。見例如(S.Maheswaran等，N Engl JMed.359，366 (2008 年 7 月 24 日)；S.Nagrath 等，Nature.450，1235 (2007 年 12 月 20 日)；S.L.Stott等，Sci Transl Med2, 25ra23 (3月31日))及本文中應(yīng)用的申請和參考文獻(xiàn)。
[0091]用于從樣品富集特定顆粒的方法一般基于序貫加工步驟，每個所述步驟減少混合物中不想要的細(xì)胞/顆粒的數(shù)目，但是一個加工步驟在一些實(shí)施方案中可以足夠。用于實(shí)施多個加工步驟的裝置可以是分開的或者整合到一個微射流系統(tǒng)中。所述裝置包括用于細(xì)胞/顆粒結(jié)合的裝置、用于細(xì)胞裂解的裝置、用于排列細(xì)胞的裝置、和用于顆粒分離(例如基于大小、形狀和/或變形性或其它標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行)的裝置。在某些實(shí)施方案中，使用加工步驟來減少細(xì)胞數(shù)目，之后將它們導(dǎo)入裝置或系統(tǒng)中。在一些實(shí)施方案中，與初始樣品混合物相t匕，裝置保留至少75%，例如80%、90%、95%、98%、或99%期望的細(xì)胞，同時相對于一種或多種不想要的細(xì)胞類型，將期望細(xì)胞的群體富集至少100倍，例如1000、10，000、100，000、或甚至 1，000, 000 倍。
[0092]用于分離顆粒的一些裝置依賴于在有或沒有同時細(xì)胞結(jié)合情況下基于大小的分離。一些基于大小的分離裝置包括引起CTC和其它流體組分的側(cè)向移位，由此提供富集或以其它方式加工此類組分的機(jī)制的一個或多個障礙物陣列。依照大小分離顆粒的障礙物陣列通常限定缺口網(wǎng)絡(luò)，其中將通過缺口的流體不相等地分入隨后的缺口中。基于篩和陣列大小的分離裝置兩者可以相對于細(xì)胞結(jié)合裝置選擇性并入如上文所描述的透性障礙物。
[0093]包含形成缺口網(wǎng)絡(luò)的障礙物陣列的裝置可以包括例如交錯的二維障礙物陣列，例如使得每個連續(xù)行以前一行的時段的小于一半補(bǔ)償。也可以以不同樣式排列障礙物?？赡艿恼系K物性狀和樣式的例子在W02004/029221中更為詳細(xì)地討論。
[0094]在一些實(shí)施方案中，所述裝置可以提供CTC的分離和/或富集，其使用基于陣列的大小分離方法進(jìn)行，例如如記載于美國專利公開文本N0.2007/0026413的。一般地，所述裝置包括選擇性透性障礙物的一個或多個陣列，所述選擇性透性障礙物引起流體樣品中懸浮的大顆粒諸如CTC和其它組分的側(cè)向移位，由此提供富集或以其它方式加工此類組分的機(jī)制，同時還提供選擇性結(jié)合其它較小的顆粒的可能性，所述其它較小的顆?？梢源┻^構(gòu)成障礙物的納米管(nanotube)的密集矩陣中的空隙。采用此類選擇性透性障礙物進(jìn)行顆粒的基于大小、形狀、或變形性的富集的裝置，包括濾器、篩、和富集或分離裝置記載于國際公開文本 N0.2004/029221and2004/l 13877, Huang 等 Science304:987-990 (2004)，美國公開文本N0.2004/0144651，美國申請N0.5，837，115和6，692，952，及美國申請N0.60/703，833，60/704，067，和11/227，904 ;可用于親和力捕捉的裝置，例如那些記載于國際公開文本N0.2004/029221和美國申請流水號11/071,679的；可用于優(yōu)先裂解樣品中的細(xì)胞的裝置，例如那些記載于國際公開文本N0.2004/029221,美國專利N0.5，641，628，及美國申請N0.60/668, 415的`；可用于排列細(xì)胞的裝置，例如那些記載于國際公開文本N0.2004/029221,美國專利 N0.6，692，952，及美國申請流水號 10/778，831 和 11/146，581的；及可用于流體投遞的裝置，例如那些記載于美國申請N0.11/071，270和11/227，469的。兩種或更多種裝置可以連續(xù)組合，例如如記載于國際公開文本N0.W02004/029221的。所有前述參考文獻(xiàn)通過提及并入本文。
[0095]在一些實(shí)施方案中，裝置可以含有包含選擇性結(jié)合特定細(xì)胞類型，例如上皮起源的細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞的結(jié)合模塊，例如單克隆抗EpCAM抗體或其片段的障礙物。裝置的所有障礙物可以包含這些結(jié)合模塊；或者，僅障礙物的亞組包含它們。裝置還可以包含別的模塊，例如細(xì)胞計(jì)數(shù)模塊或檢測模塊，其與微射流通道裝置處于流體通信中。例如，檢測模塊可以配置為顯現(xiàn)裝置的輸出樣品。
[0096]在一個例子中，檢測模塊可以與分離或富集裝置處于流體通信中。檢測模塊可以使用本文中公開的任何檢測方法，或本領(lǐng)域中已知的其它方法運(yùn)行。例如，檢測模塊包括顯微鏡、細(xì)胞計(jì)數(shù)器、磁體、生物空腔(biocavity)激光器(見例如Gourley等，J.Phys.D:Appl.Phys.，36:R228-R239 (2003))、質(zhì)譜儀、PCR 裝置、RT-PCR 裝置、微陣列、RNA 原位雜交系統(tǒng)、或超光譜(hyperspectral)成像系統(tǒng)(見例如Vo-Dinh等,IEEE Eng.Med.Biol.Mag.，23:40-49 (2004)) ο在一些實(shí)施方案中，可以連接計(jì)算機(jī)終端與檢測模塊。例如，檢測模塊可以檢測選擇性結(jié)合感興趣的細(xì)胞、蛋白質(zhì)、或核酸，例如LINE-lDNA、mRNA、或蛋白質(zhì)、或衛(wèi)星DNA或mRNA的標(biāo)志物。
[0097]在一些實(shí)施方案中，微射流系統(tǒng)包含(i)用于分離或富集CTC的裝置；(ii)用于裂解富集的CTC的裝置；和(iii)用于檢測LINE-lDNA、mRNA、或蛋白質(zhì)、或衛(wèi)星DNA或mRNA的裝置。[0098]在一些實(shí)施方案中，使用如本文中所描述的微射流裝置制備的CTC群體用于使用已知的分子生物學(xué)技術(shù)分析LINE-1和/或衛(wèi)星的表達(dá)，例如如上文及在Sambrook, Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版(Cold Spring HarborLaboratory Press;第 3 版(2001 年 I 月 15 日))；及 Short Protocols in MolecularBiology, Ausubel 等編(Current Protocols;第 52 版(2002 年 11 月 5 日))中描述的。
[0099]一般地，本文中描述了用于檢測和/或量化富集的CTC群體中衛(wèi)星或LINE-1表達(dá)的裝置，并且可以用于早期檢測癌癥，例如上皮起源的腫瘤，例如早期檢測胰腺、肺、乳腺、前列腺、腎、卵巢或結(jié)腸癌。
[0100]監(jiān)測疾病進(jìn)展或治療效力的方法
[0101]在一些實(shí)施方案中，一旦測定出對象具有癌癥，或者具有升聞的形成癌癥的風(fēng)險，則可以施用治療，例如如本領(lǐng)域中已知的?？梢允褂帽疚闹兴枋龅姆椒▉肀O(jiān)測治療的效力；可以治療后(或期間)，例如在施用一劑或多劑治療后評估別的樣品，并且LINE-1j/或ALR和/或HSATII衛(wèi)星表達(dá)水平降低，或樣品中表達(dá)LINE-1jP /或ALR和/或HSATII衛(wèi)星的細(xì)胞數(shù)目減少會指示治療是有效的，而LINE-1jP /或ALR和/或HSATII衛(wèi)星表達(dá)水平或表達(dá)LINE-1、和/或ALR和/或HSATII衛(wèi)星的細(xì)胞沒有變化或升高會指示治療不是有效的(相反的事物對于GSATI1、TARl和/或SSTl衛(wèi)星的水平當(dāng)然會是正確的)。在治療過程期間和/或已經(jīng)終止治療后可以將該方法重復(fù)幾次，例如以監(jiān)測潛在的疾病復(fù)發(fā)。
[0102]在一些實(shí)施方案中，例如，對于已經(jīng)診斷為可導(dǎo)致癌癥的良性狀況的受試者，已經(jīng)成功治療癌癥的受試者，或具有升高的癌癥風(fēng)險的受試者(例如由于遺傳素因或環(huán)境暴露于癌癥引起劑)，可以在選定的時間間隔，例如在3、6、12、或24個月時間間隔時重復(fù)所述方法，以監(jiān)測受試者中的疾病，從而早期檢測對惡性的進(jìn)展或受試者中癌癥的形成。
實(shí)施例
[0103]本發(fā)明在以下實(shí)施例中進(jìn)一步描述，所述實(shí)施例沒有限制權(quán)利要求書中描述的本發(fā)明的范圍。
[0104]實(shí)施例1:與細(xì)胞系和IH常組織相比，主要衛(wèi)星水平在腫瘤組織中大規(guī)模升高
[0105]利用來自Helicos BioSciences的下一代數(shù)字基因表達(dá)(DGE)應(yīng)用(D.Lipson等，Nat Biotechnol27，652(2009年7月))來比較原發(fā)性癌癥及其衍生的轉(zhuǎn)移前體中的腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)。我們首先測定經(jīng)由組織靶向性表達(dá)激活的Kras和Tp53的喪失生成的原發(fā)性小鼠胰管腺癌(PDAC) (KrasG12D, Tp53lox/+)的 DGE 概況(N.Bardeesy 等，Proc Natl AcadSci U S Α103，5947(2006年4月11日))。這些腫瘤是人PDAC的組織病理學(xué)和遺傳模擬物，其展現(xiàn)出實(shí)質(zhì)上普遍的突變體KRAS (>90%的病例)和ΤΡ53的損失(50-60%)。[0106]將具有不同基因型的胰腺癌的小鼠繁殖，如先前記載于Bardeesy實(shí)驗(yàn)室(Bardeesy 等，Proc Natl Acad Sci U S A103, 5947 (2006))的。正常的野生型小鼠購自Jackson laboratories。按照動物方案指南將動物實(shí)施安樂死。將胰腺腫瘤和正常組織在無菌情況下提取，然后用液氮快速冷凍。將組織于-80° C貯存。對于動物AH367和AH368生成新鮮的細(xì)胞系，如先前描述的(Aguirre等，Genes Devl7，3112 (2003))，并將建立細(xì)胞系在RPM1-1640+10%FBS+l%Pen/Str印(Gibco/Invitrogen)中培養(yǎng)。來自結(jié)腸和肺的其它小鼠腫瘤由 Kevin Haigis (Massachusetts General Hospital)和 Kwok-Kin Wong (DanaFarber Cancer Institute)懷慨提供。
[0107]將新鮮冷凍的組織在干冰上在微量離心管中用無菌杵棒磨碎。將細(xì)胞系培養(yǎng)，并在液氮中快速冷凍，之后進(jìn)行核酸提取。來自細(xì)胞系及快速冷凍的腫瘤和正常組織的RNA
和DNA均以相同的方式加工。使用TR丨ζοΗ式劑(Invitrogen)按照制造商的用法說明書
提取RNA。使用QIAamp微量試劑盒(QIAGEN)按照制造商的方案提取來自組織和細(xì)胞系的DNA。[0108]將純化的RNA進(jìn)行數(shù)字基因表達(dá)(DGE)樣品制備，并在來自Helicos BioSciences的HeliScope?單分子測序儀上分析。此方法先前已經(jīng)描述過(Lipson等，NatBiotechnol27, 652(2009))。簡言之，用 dTU25V 引物和 Superscript III cDNA 合成試劑盒
(Invitrogen)從RNA逆轉(zhuǎn)錄單鏈cDNA。將RNA消化，并用AgetlCOUrt? AMPure?磁珠使
用固相可逆固定化(SPRI)技術(shù)純化單鏈cDNA。將單鏈cDNA變性，然后，使用末端轉(zhuǎn)移酶(New England Biolabs)將多聚-A尾部添加至3’端。
[0109]將純化的DNA進(jìn)行來自Helicos的DNA測序樣品制備方案，其先前已經(jīng)描述過(Pushkarev, N.F.Neff, S.R.Quake, Nat Biotech27, 847 (2009))。簡言之，用 Covaris S2 聲學(xué)近距離聲波定位器(sonicator)剪切基因組DNA,所述Covaris S2聲學(xué)近距離聲波定位器生成平均值200bp和范圍為100-500bp的片段。然后，用SPRI清潔剪切的DNA。然后，將DNA變性，并使用末端轉(zhuǎn)移酶將多聚A尾部添加至3’端。
[0110]然后，使加尾的cDNA或DNA與測序流動池雜交，接著是“填充和鎖定(Fill andLock) ”和單分子測序。然后，使用DGE程序?qū)⒒虮磉_(dá)序列閱讀與已知的人或小鼠轉(zhuǎn)錄物組文庫比對。將基因組DNA序列閱讀與小鼠基因組比對，并計(jì)數(shù)以測定主要小鼠衛(wèi)星(CNV)的拷貝數(shù)目。
[0111]分析的第一小鼠胰腺腫瘤AH284是值得注意的，因?yàn)榕c來自相同小鼠的正常肝轉(zhuǎn)錄物的3-4%差異相比，DGE序列與注釋的小鼠轉(zhuǎn)錄物組展示48-52%差異。幾乎所有差異的序列定位至臂間(主要)小鼠衛(wèi)星重復(fù)。與正常胰腺或肝中的0.02-0.4%(196-4，115tpm)相比，衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物占腫瘤中所有細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物的約49%(495，42Itpm)(表1)。
[0112]表1
[0113]總基因組比對閱讀及主要衛(wèi)星和轉(zhuǎn)錄物組閱讀的分類。括號中為占總基因組比對閱讀的百分比
【權(quán)利要求】
1.一種檢測受試者中癌癥存在的體外方法，該方法包括: 測定來自所述受試者的樣品中的LINE-1水平以獲得測試數(shù)值；并 比較所述測試數(shù)值與參照數(shù)值， 其中與所述參照數(shù)值相比的測試數(shù)值指示所述受試者是否患有癌癥。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述參照數(shù)值代表LINE-1的閾值水平，其中所述受試者中存在高于所述參照數(shù)值的LINE-1水平指示所述受試者患有癌癥，且所述受試者中存在低于所述參照數(shù)值的LINE-1水平指示所述受試者不太可能患有癌癥。
3.—種檢測受試者中癌癥存在的體外方法，該方法包括: 測定來自所述受試者的樣品中衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物的水平以獲得測試數(shù)值；并 比較所述測試數(shù)值與參照數(shù)值， 其中與所述參照數(shù)值相比的測試數(shù)值指示所述受試者是否患有癌癥。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物包含下列一種或多種:ALR、HSATII,GSATII, TARl^P SSTl0
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物是ALR和/或HSATII，且高于所述參照水平的ALR和/或HSATII衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物水平的存在指示所述受試者具有腫瘤。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物是GSATI1、TARl和/或SSTl，且低于所述參照水平的GSATI1、TARl和/或SSTl衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物水平的存在指示所述受試者具有腫瘤。
7.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品已知或懷疑包含腫瘤細(xì)胞。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述樣品是已知或懷疑包含循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的血液樣品，或已知或懷疑包含腫瘤細(xì)胞的活組織檢查樣品。
9.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品包含血清中游離的RNA或血液中外來體內(nèi)的RNA。
10.權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者是人。
11.權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的方法，其中所述癌癥是上皮起源的實(shí)體瘤。
12.—種評估受試者中癌癥的治療效力的體外方法，該方法包括: 測定來自所述受試者的第一樣品中的LINE-1水平以獲得第一數(shù)值； 對所述受試者施用癌癥治療； 測定在后來的時間時自所述受試者獲得的隨后樣品中的LINE-1水平，以獲得治療數(shù)值；并 比較所述第一數(shù)值與所述治療數(shù)值， 其中低于所述第一數(shù)值的治療數(shù)值指示所述治療是有效的。
13.—種評估受試者中癌癥的治療效力的體外方法，該方法包括: 測定來自所述受試者的第一樣品中的衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物水平以獲得第一數(shù)值； 對所述受試者施用癌癥治療； 測定在后來的時間時自所述受試者獲得的隨后樣品中的衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物水平，以獲得治療數(shù)值；并 比較所述第一數(shù)值與所述治療數(shù)值， 其中低于所述第一數(shù)值的治療數(shù)值指示所述治療是有效的。
14.權(quán)利要求12或13的方法，其中所述衛(wèi)星轉(zhuǎn)錄物包含下列一種或多種:ALR、HSATI1、GSATI1、TARUP SSTl0
15.權(quán)利要求12至14中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一和第二樣品已知或懷疑包含腫瘤細(xì)胞。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述樣品是已知或懷疑包含循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的血液樣品，或已知或懷疑包含腫瘤細(xì)胞的活組織檢查樣品。
17.權(quán)利要求12至16中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品包含血清中游離的RNA或血液中外來體內(nèi)的RNA。
18.權(quán)利要求12至17中任一項(xiàng)的方法，其中所述治療包括施用手術(shù)干預(yù)、化學(xué)療法、放射療法、或其組合。
19.權(quán)利要求12至18中任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者是人。
20.權(quán)利要求12至19中任一項(xiàng)的方法，其中所述癌癥是上皮起源的實(shí)體瘤。
21.權(quán)利要求1、2、或12的方法，包括測量LINE-1轉(zhuǎn)錄物水平。
22.權(quán)利要求13至21中任一項(xiàng)的方法，其中使用分支DNA測定法測定所述水平。
23.權(quán)利要求11或20的方法，其中所述上皮起源的實(shí)體瘤是胰腺、肺、乳腺、前列腺、腎、卵巢或結(jié)腸癌。`
【文檔編號】C12Q1/68GK103517990SQ201180058942
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2011年10月6日 優(yōu)先權(quán)日:2010年10月7日
【發(fā)明者】D.T.廷, D.A.哈伯, S.馬休斯瓦蘭, D.利普森 申請人:通用醫(yī)療公司, 富魯達(dá)公司