專利名稱：用于檢測癌癥的組合物和方法
技術領域：
本發(fā)明提供了唾液酸化聚糖和特異性結合其的抗體。本發(fā)明的組合物和使用本發(fā)明組合物的方法對于癌癥的早期檢測和診斷是有用的。 背景癌癥是全世界的死亡主因，并且死亡率在很大程度上歸于上皮起源的癌癥，即肺、結腸、乳腺、肝、胃、前列腺、卵巢、子宮內(nèi)膜和胰腺的癌(Parkin等人，2001)。當癌癥被早期診斷出并且疾病限于起源的器官時，存活率得到顯著改善。事實上，用于篩選的物理方法如宮頸癌中的巴氏涂片和乳腺癌中的乳房X線照相術已顯著減少死亡比率(Marcial，1977，Nelson等人，2009b)。因此，針對開發(fā)在可容易接近的體液例如血清、尿或唾液中的新的早期檢測生物標記的研究已得到鼓勵(Srivastava和Gopal-Srivastava, 2002)。某些眾所周知的生物標記(Nossov 等人，2008, Candefjord 等人，2009, Greene 等人，2009, Gupta 和Lis, 2009, Nelson 等人，2009a, Nogueira 等人，2009, van Leeuwen 等人，2009)在疾病的晚期可靠地檢測到，但對于早期癌癥診斷缺乏足夠的靈敏度且尤其是特異性，并且因此主要用于預后、分期、監(jiān)控和治療的選擇(Ludwig和Weinstein, 2005)。備選的有希望的策略是利用針對癌癥的免疫應答，其可以在腫瘤生成的早期引起。這通過針對腫瘤相關抗原的自身抗體的產(chǎn)生部分證實(Raedle等人，1998, Soussi,2000, Desmetz等人，2009a, Desmetz等人，2009b, Tan等人，2009)。然而，特異性和靈敏度已得到限制，主要是由于癌癥的異質(zhì)性質(zhì)，其中不同蛋白質(zhì)在具有相同類型癌癥的患者中是異常表達或調(diào)節(jié)的，引起免疫應答中很大的變異性(Raedle等人，1998，Soussi, 2000, Tan等人，2009)。用于癌癥篩選的新血清生物標記是需要的，因為目前的那些對于早期診斷缺乏足夠的靈敏度且尤其是特異性(18，19)，主要在晚期中是可靠檢測的，并且因此更多用于預后、分期、監(jiān)控和治療選擇(18)。雖然針對腫瘤相關抗原的抗體通常在早期時在癌癥患者中發(fā)現(xiàn)，并且可以潛在成為用于惡性轉(zhuǎn)化的靈敏檢測物(21，22)，但先前描述的自身抗體無一在篩選中顯示足夠的特異性。由于弱靈敏度和特異性，可用的基于血液的測定對于癌癥的早期診斷具有最低限度的臨床效用。一般地，它們用于監(jiān)控轉(zhuǎn)移性癌癥的治療。廣泛用于篩選前列腺癌的前列腺特異性抗原(PSA)是有用的基于血液的癌癥篩選測定的最佳例子，并且在近期公開的隨機化研究中具有邊緣臨床效用。使用下述基于血液的癌癥測試PSA、CA27. 29、CA19. 9、CA125、CEA和aFP。除PSA外，僅a FP用作篩選測試，在這種情況下用于處于關于肝細胞癌的高危中的且具有丙型肝炎誘導的肝硬化的患者。這些測試無一已顯示以合理的經(jīng)濟或發(fā)病成本減少癌癥特異性死亡率。然而，由于關于基于血液的癌癥篩選的極度需要，通常使用PSA和a FP篩選以及CA125篩選。盡管本領域中的進展，仍需要用于癌癥篩選的改良生物標記。發(fā)明概述
本發(fā)明提供了用于檢測受試者中的癌癥的方法，其包括在得自受試者的生物學樣品中測定選自下述的一種或多種化合物的水平a)Neu5Gc_唾液酸化抗原，b)Neu5Gc-唾液酸化抗原的表位，c) Neu5Gc-唾液酸化抗原的衍生物，和d)特異性結合所述抗原、表位和衍生物中的一種或多種的抗體，其中當相對于對照正常樣品，檢測到更高水平的一種或多種化合物時，所述受試者鑒定為具有癌癥，并且當化合物的水平無一高于對照正常樣品時，受試者鑒定為無癌癥的。在一個實施方案中，Neu5Gc-唾液酸化抗原選自i)Neu5Gc-唾液酸化聚糖、ii)Neu5Gc-唾液酸化_Lex、和iii)Neu5Gc_唾液酸化_Lea。在一個特定實施方案中，Neu5Gc_唾液酸化聚糖選自Neu5Gc a 2_6GalNAc a -R(聚糖 6)、Neu5Gc9Ac a 2_3Gal β l_4GlcNAc β -R (聚糖 2)、Neu5Gc a 2_6Lac β -R (聚糖 20)、和 Neu5Gc a 2_3Gal β l_3GalNAc β -R (聚糖 34)、Neu5Gc a 2_6GalNAc a -OR (聚糖 6)、Neu5Gc9Ac a 2_3Gal β l_4GlcNAc β -OR (聚糖 2)、Neu5Gc a 2_6Lac β -OR (聚糖 20)、和Neu5Gc a 2_3Gal β l_3GalNAc β -OR (聚糖 34)，其中 R 選自生物素、白蛋白、ProNH2、-CH-、-OH、-OCH3、-OCH2-CH3、-H、hydr i do、羥基、烷氧基、氧、碳、硫、氮、磷、NH2、ProNH2 = O (CH2) 2CH2NH2、(OCH2CH2) 6NH2、O (CH2) 3NHC0CH2 (OCH2CH2) 6NH2、熒光標記 2-氨基苯甲酰胺(AB)和 / 或 2-氨基苯甲酸(AA)、含有烷基胺的2-氨基苯甲酰胺類似物(AEAB)、氨基氧基-基團、甲氨基氧基_基團、酰肼基團、氨基脂質(zhì)I，2-雙十六燒基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DHPE)、氨基氧基(AO)官能化DHPE、糖基磷脂酰肌醇(GPI)，并且其中Lac是Gal β l_4GlcNAc。在一個優(yōu)選實施方案中，Neu5Gc_唾液酸化聚糖包含Neu5Gc a 2_6GalNAc a -R (聚糖6)。在一個備選實施方案中，Neu5Gc-唾液酸化-Lex 包含 Neu5Gc a 2_3Gal β 1-4 (Fuc α 1-3) GlcNAc)。在另外一個實施方案中，Neu5Gc-唾液酸化-Lea 包含(Neu5Gc a 2_3Gal β 1-3 (Fuc α 1-4) GlcNAc和 9-0-乙?；?Gd3 (Neu5，9Ac2 a 2_8Neu5Ac a 2_3Gal β l_4Glc β 1-1 神經(jīng)酰胺)中的一種或多種。雖然不預期將抗體限于任何特定類型或特異性，但在一個實施方案中，抗體特異性結合包含Neu5Gca2-6GalNAca-R(聚糖6)的Neu5Gc_唾液酸化聚糖。在一個進一步的實施方案中，測定步驟包括檢測特異性結合Neu5Gc-唾液酸化抗原、抗原的表位和抗原的衍生物中的一種或多種的抗體。在某些實施方案中，當檢測到一種或多種化合物的水平中的增加時，受試者指示用于開始抗癌治療。在備選實施方案中，檢測到一種或多種化合物的水平中的增加時，受試者指示用于確證診斷癌癥測試。在再進一步的實施方案中，本發(fā)明的方法進一步包括在具有一種或多種化合物的水平的增加的受試者中開始抗癌治療。在特定實施方案中，該方法可以進一步包括在具有一種或多種化合物的水平的增加的受試者中執(zhí)行確證診斷癌癥測試。在某些實施方案中，受試者缺乏可檢測的癌癥癥狀，具有一種或多種可檢測的癌癥癥狀，和/或處于癌癥的危險中。在特定實施方案中，癌癥包含癌。在備選實施方案中，癌癥選自乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、結腸癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌。在特定實施方案中，本發(fā)明的方法進一步包括治療受試者以減少一種或多種癌癥癥狀。在進一步的實施方案中，抗體特異性結合包含Neu5Gc a 2_6GalNAc a -R (聚糖6)的Neu5Gc-唾液酸化聚糖。在另一個實施方案中，抗體具有大于O. 50的關于癌癥的接受者操作特性(ReceiverOperator Characteristic (ROC))曲線的曲線下面積(AUC),和/或具有大于50%的癌癥特異性，和/或具有大于50%的癌癥靈敏度。本發(fā)明進一步提供了選自下述的經(jīng)分離的Neu5Gc_唾液酸化抗原i)Neu5Gc_唾液酸化聚糖、ii)Neu5Gc-唾液酸化-LexJP iii)Neu5Gc_唾液酸化_Lea。本文另外提供的是特異性結合本文描述的一種或多種Neu5Gc_唾液酸化抗原的抗體。本發(fā)明還提供了特異性結合一種或多種抗體的抗體，所述一種或多種抗體特異性結合本文描述的一種或多種Neu5Gc_唾液酸化抗原。本發(fā)明還提供的是包含組合物的試劑盒，所述組合物含有本文描述的一種或多種 Neu5Gc-唾液酸化抗原、和/或本文描述的一種或多種抗體。在某些實施方案中，一種或多種Neu5Gc-唾液酸化抗原包含在陣列中。附圖
簡述圖I.用于檢測抗Neu5Gc抗體的唾液酸聚糖(sialoglycan)微陣列載玻片的驗證。將具有末端Neu5Gc或Neu5Ac的多種聚糖對(如表2中詳述的聚糖#1_40)點在環(huán)氧化物包被的載玻片上，隨后使用(A)通過Cy3-抗-雞IgY檢測的親和力純化的雞抗-Neu5GcIgY(l 10, 000) (34) (O. 5 μ g/ml);或(B)通過 Cy3 抗人 IgG 檢測的人抗 Neu5GcIg陽性人血清(I 100 ；S34(5) (I. 5 μ g/ml)顯色。數(shù)據(jù)用Excel樞軸表分析，代表超過三次獨立實驗，并且顯示4個重復點的平均值土 SD (以125 μ M印刷的聚糖)。圖2.接受者操作特性(“R0C”)曲線。在左上圖中是二元分類測試的簡化圖示。TP是真陽性，F(xiàn)P是假陽性，F(xiàn)N是假陰性，并且TN是真陰性。圖3.抗GcSTn是用于癌癥病例/對照的分類器，并且表明為人特異性和腫瘤相關的癌生物標記。使用邏輯回歸計算成為癌癥病例的概率，其中預測物是兩個參數(shù)，α和β，其概括針對20種Neu5Ac聚糖的泛抗體(pan antibody)水平對于聚糖6 (Neu5Gc-唾液酸基-Tn ；GcSTn)的抗-Neu5Gc抗體應答。(A)關于用于選擇聚糖6的訓練數(shù)據(jù)的ROC曲線，所述訓練數(shù)據(jù)具有67個非轉(zhuǎn)移性乳腺癌病例和25個對照。(B)關于第一個驗證數(shù)據(jù)集的ROC曲線，所述第一個驗證數(shù)據(jù)集具有74個新的非轉(zhuǎn)移性乳腺癌病例和25個新對照。(C)關于第二個驗證數(shù)據(jù)集的ROC曲線，所述第二個驗證數(shù)據(jù)集具有99個其他癌癥類型病例和55個對照。示意性呈現(xiàn)了用于生成新型人癌生物標記的生物化學和遺傳學原理。(D)體細胞Cosmc突變生成不完全O聯(lián)糖基化，導致在許多癌中唾液酸化的Tn抗原的腫瘤相關表達(左圖)。通過此類癌的飲食-Neu5Gc摻入生成通過體液適應性免疫系統(tǒng)檢測為外源的Neu5Gc-唾液酸基Tn，從而生成針對其的抗體。對于Neu5Gc-唾液酸基Tn特異性的此類異種-自身抗體在本文中顯示為新型生物標記，用于癌的早期篩選和/或潛在免疫治療工具(右圖)。圖4.作為用于癌癥病例/對照的分類器的抗GcSTn的ROC分析的交叉驗證。使用邏輯回歸模型計算成為病例的概率，其中預測物是兩個參數(shù)，α和β，其概括針對20種Neu5Ac-聚糖的表達水平的聚糖6 (Neu5Gc-唾液酸基-Tn ；GcSTn)的抗Neu5Gc抗體應答。十倍交叉驗證用于評估預測能力。對ROC曲線水平地求平均值，以計算在所需靈敏度水平的特異性，并且對于特異性制備箱形圖。(A)關于訓練數(shù)據(jù)的ROC曲線，所述訓練數(shù)據(jù)具有67個非轉(zhuǎn)移性乳腺癌病例和25個對照，基于500次十倍交叉驗證運行，平均AUC = O. 63，在 AUC 上的 95% Cl = (O. 29,0.91), IQR= (O. 46，O. 71)。(B)關于第一個驗證數(shù)據(jù)集的ROC曲線，所述第一個驗證數(shù)據(jù)集具有74個新的非轉(zhuǎn)移性乳腺癌病例和25個新對照，基于500次十倍交叉驗證運行，平均AUC = O. 58，在AUC上的95% Cl = (O. 167，O. 917)，IQR =(0.458,0.708)。(C)關于第二個驗證數(shù)據(jù)集的ROC曲線，所述第二個驗證數(shù)據(jù)集具有99個其他癌癥類型的非轉(zhuǎn)移性病例和55個對照，基于500次十倍交叉驗證運行，平均AUC =O. 57，在 AUC 上的 95% Cl = (O. 283，O. 817)，IQR= (O. 483，O. 683)。定義為了促進本發(fā)明的理解，下文定義了許多術語。如本文使用的，術語“純化的”、“分離的”及其語法等價物指來自樣品的至少一種·不希望的組分(例如細胞類型、蛋白質(zhì)和/或核酸序列)的量的減少，包括從5%到100%的任何數(shù)目百分比的減少，例如但不限于從10%到100%、從20%到100%、從30%到100%、從 40%到 100%、從 50%至Ij 100%、從 60%到 100%、從 70%到 100%、從 80%到 100%、和從90%到100%。因此，純化導致“富集”，即樣品中希望的細胞類型、蛋白質(zhì)和/或核酸序列的量的增加。在一個實施方案中，本發(fā)明考慮了純化或分離的唾液酸化聚糖。如本文使用的，術語“治療”、“處理”和語法等價物指對抗疾病或病癥，如例如在患者的管理和護理中。在一個實施方案中，治療疾病(例如癌癥、轉(zhuǎn)移等)包括減少一種或多種疾病癥狀。如本文使用的，術語“診斷”指通過其體征和癥狀(例如對常規(guī)治療的抗性)的疾病識別，或遺傳分析、病理學分析、組織學分析等。如本文使用的，術語“癌細胞”和“腫瘤細胞”指經(jīng)歷多步贅生性進展的早、中或晚期的細胞，如通過引用合并入本文的先前描述的(Pitot等人,Fundamentals of Oncology,15-28(1978))。贅生性進展的早、中或晚期的特征已使用顯微鏡檢查進行描述。在贅生性進展的三個階段各自的癌細胞一般具有異常核型，包括易位、倒轉(zhuǎn)、缺失、等臂染色體、單體和額外染色體。惡性進展的早期中的細胞被稱為“增生細胞”，并且特征在于不受控制的分裂和/或以比相同組織中相同細胞類型的正常細胞更大的速率分裂。增生可以是緩慢或快速的，但持續(xù)不減弱的。贅生性進展的中期中的細胞被稱為“發(fā)育不良細胞”。發(fā)育不良細胞類似未成熟的上皮細胞，在組織內(nèi)一般是空間紊亂的且喪失其專門結構和功能。在贅生性進展的中期過程中，增加百分比的上皮變得由發(fā)育不良細胞組成?！霸錾焙汀鞍l(fā)育不良”細胞被稱為“前腫瘤”細胞。在贅生性進展的晚期中，發(fā)育不良細胞變成“贅生性”細胞。贅生性細胞一般是侵襲性的，即它們侵入鄰近組織，或從原發(fā)部位脫落且通過血液和淋巴循環(huán)至體內(nèi)的其他位置，在其中它們開始繼發(fā)性癌癥。癌癥包括例如癌例如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、宮頸癌、胰腺癌、結腸癌、卵巢癌；胃癌、食管癌、口癌、舌癌、齒齦癌(gum cancer)、皮膚癌(例如黑素瘤、基底細胞癌、卡波濟氏肉瘤等)、肌肉癌、心臟癌、肝癌、支氣管癌、軟骨癌、骨癌、睪丸癌、腎癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮癌、膀胱癌、骨髓癌、淋巴瘤癌、脾臟癌、胸腺癌、甲狀腺癌、腦癌、神經(jīng)元癌、間皮瘤、膽囊癌、眼癌(例如角質(zhì)層癌、葡萄膜癌、脈絡膜癌、斑翳(macula)癌、玻璃體癌等)、關節(jié)癌(例如滑膜癌)、成膠質(zhì)細胞瘤、淋巴瘤和白血病。惡性贅生物通過肉瘤(例如骨肉瘤和卡波濟氏肉瘤)進一步例
/Jn ο術語“癌癥”或“瘤形成”指多個癌細胞?！疤幱谵D(zhuǎn)移危險中的癌癥”指可以分化成轉(zhuǎn)移性癌的癌癥。此類危險可以基于家族史、遺傳因素、癌癥類型、環(huán)境因素等?！鞍敝赣缮掀ぜ毎麡嫵傻膼盒孕律L，其趨于浸潤外圍組織且產(chǎn)生轉(zhuǎn)移。
“轉(zhuǎn)移性”癌細胞指從原發(fā)癌部位(即在其中癌細胞最初由正常、增生或發(fā)育不良細胞形成的位置)易位到除原發(fā)部位外的部位的癌細胞，易位的癌細胞在其中寄居且增生?？梢垣@益于本發(fā)明的方法“受試者”和“動物”可互換地包括任何多細胞動物，優(yōu)選哺乳動物。哺乳動物受試者包括人、非人靈長類動物、鼠類、綿羊科動物、?？苿游?、反芻動物、兔類動物、豬科動物、羊科動物、馬科動物、犬科動物、貓科動物、鳥類等)。因此，非人哺乳動物受試者通過小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、雪貂和栗鼠例示。需要減少一種或多種疾病癥狀例如需要減少癌癥轉(zhuǎn)移和/或需要減少一種或多種癌癥癥狀的“受試者”包括顯示出一種或多種疾病癥狀和/或處于顯示出一種或多種疾病癥狀的危險中的受試者。例如，基于家族史、遺傳因素、環(huán)境因素等，受試者可以處于危險中。這個術語包括疾病的動物模型。因此，給需要減少疾病和/或減少一種或多種疾病癥狀的受試者施用組合物(其減少疾病和/或減少一種或多種疾病癥狀)包括組合物的預防施用(即在疾病和/或一種或多種疾病癥狀可檢測前)和/或組合物的治療施用(即在疾病和/或一種或多種疾病癥狀可檢測后)?！疤幱诩膊?例如癌癥)的危險中”的受試者指傾向于招致(contracting)和/或表達一種或多種疾病癥狀的受試者。這種傾向可以是遺傳的(例如表達一種或多種疾病例如可遺傳病癥等癥狀的特定遺傳趨勢)，或由于其他因子(例如環(huán)境條件、暴露于環(huán)境中存在的有害化合物，包括致癌物等)。術語“處于危險中”的受試者包括“患有疾病”的受試者，即經(jīng)歷一種或多種疾病癥狀的受試者。不預期本發(fā)明限于任何特定體征或癥狀。因此，預期本發(fā)明包含經(jīng)歷任何范圍的疾病，從亞臨床癥狀到充分發(fā)展的疾病的受試者，其中受試者顯示出與疾病相關的至少一種標記(例如體征和癥狀)。如本文使用的，術語“樣品”和“樣本”以其最廣泛含義使用，以包括得自和/或衍生自生物學或環(huán)境來源的任何組合物，以及達到與生物學或環(huán)境樣品接觸的取樣裝置(例如拭子)?！吧飳W樣品”包括得自動物的那些，包括體液樣品例如血清、血漿、血液、尿、腦脊髓液(CSF)、痰、唾液、細胞提取物、組織提取物等，以及固體樣品例如組織(例如活組織檢查材料)、細胞等。術語“抗體”包含得自任何來源(例如鳥、人、嚙齒類動物、非人靈長類動物、公山羊、牛科動物、馬科動物、綿羊科動物等)的任何免疫球蛋白(例如IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等)。在這個定義內(nèi)包括的是多克隆抗體、單克隆抗體和嵌合抗體?！岸嗫寺】贵w”指由漿細胞的超過一個單個克隆產(chǎn)生的免疫球蛋白；相比之下“單克隆抗體”指由漿細胞的單個克隆產(chǎn)生的免疫球蛋白?！扒逗峡贵w”含有兩種不同抗體，一般是兩個不同物種的部分。參見例如給予Cabilly等人的美國專利號4，816，567 ;給予Shoemaker等人的美國專利號4，978，745 ;給予Beavers等人的美國專利號4，975，369 ;和給予Boss等人的美國專利號4，816，397。當對于分子做出提及時，術語“抗原”、“免疫原”、“抗原的”、“免疫原性的”、“抗原
活性的”、“免疫學的”和“免疫學活性的”，指能夠誘導特異性體液免疫應答(包括引起可溶性抗體應答)和/或細胞介導的免疫應答(包括引起CTL應答)的任何物質(zhì)。在一個實施方案中，抗原包含表位。術語“表位”和“抗原決定簇”指在抗原上的結構，由于分子互補性，其與抗體的結合位點或T細胞受體相互作用。表位可以與它由其衍生的完整抗原競爭結合抗體。一般地，分泌抗體及其相應膜結合形式能夠?qū)V泛多樣的物質(zhì)識別為抗原，而T細胞受體能夠僅識別蛋白質(zhì)的片段，其與細胞表面上的MHC分子復合。由B細胞上的免疫球蛋白受體識別的抗原再分成三個分類T細胞依賴性抗原、I型T細胞不依賴性抗原；和2型T細胞不依賴性抗原。此外，例如，當?shù)鞍踪|(zhì)或蛋白質(zhì)的片段用于免疫接種宿主動物時，蛋白質(zhì)的眾多區(qū)域可以誘導抗體的產(chǎn)生，所述抗體特異性結合蛋白質(zhì)上的給定區(qū)域或三維結構；這些區(qū)域或結構被稱為抗原決定簇?？乖瓫Q定簇可以與完整抗 原(即用于引起免疫應答的免疫原)競爭結合抗體。當對于第一種分子(例如多肽、糖蛋白、核酸序列、多糖、抗原等)與第二種分子(例如多肽、糖蛋白、核酸序列、多糖、抗體等)的結合做出提及時，術語“特異性結合”、“結合特異性”及其語法等價物指與在第二種分子與第三種分子之間的相互作用相比較，在第一種分子與第二種分子之間的優(yōu)先相互作用。特異性結合是不要求結合的絕對特異性的相對術語；換言之，術語“特異性結合”不要求在不存在第二種分子與第三種分子之間的相互作用的情況下，第二種分子與第一種分子相互作用。相反，在第一種分子與第二種分子之間的相互作用水平高于在第二種分子與第三種分子之間的相互作用水平是足夠的。第一種分子與第二種分子的“特異性結合”還意指在第一種分子與第二種分子之間的相互作用取決于在第一種分子上或其內(nèi)的特定結構的存在。例如，如果第二種分子對于在第一種分子上或其內(nèi)的結構“Α”是特異性的，那么含有結構A的第三種核酸序列的存在將減少結合第一種分子的第二種分子的量。方法和/或分子對于疾病的“特異性”，例如與“癌癥特異性”可互換使用的“對于癌癥的特異性”，指正確鑒定的否定(即不具有疾病的健康個體)的比例(例如百分比、部分等)，即正確鑒定為不具有疾病的健康受試者的百分比。特異性可以根據(jù)下式進行計算特異性=真陰性的數(shù)目/(真陰性的數(shù)目+假陽性的數(shù)目)因此，在某些實施方案中，本發(fā)明的組合物和/或方法具有大于50%的“癌癥特異性”，包括從 51%到 100%的任何數(shù)值，例如 52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%和 99%。雖然 100%特異性是最希望的，即不將來自健康組的任何一個預測為具有癌癥，但它不是必需的。本文數(shù)據(jù)顯示在某些實施方案中，假陽性率(靈敏度)和假陰性率(特異性)都是1/6 = 20% (實施例4)。在另一個實施方案中，本文數(shù)據(jù)顯示靈敏度是37/176 = 21. I %，并且特異性是34/60 = 68%(實施例5)。在一個進一步的實施方案中，當靈敏度是O. 25時，平均特異性是O. 79 (實施例
7)。在另外一個實施方案中，當靈敏度是O. 2和O. 3時，平均特異性分別是O. 84和O. 75 (實施例8)。另外的特異性值顯示于實施例9中。
在備選實施方案中，特異性表示(連同靈敏度)為二元分類測試的性能的統(tǒng)計測量，例如使用接受者操作特性(“R0C”)曲線”。對于任何測試，在特異性和靈敏度之間通常存在權衡。例如在人受試者的癌癥篩選測試中，由于高成本，不希望冒險將健康人錯誤地鑒定為具有癌癥(低特異性)。這些成本是身體(不必需的危險程序)和經(jīng)濟上的。這種權衡可以使用ROC曲線圖解表示(圖2)?！敖邮苷卟僮魈匦郧€”和“R0C曲線”指真陽性率(AKA靈敏度)對真陰性率(AKA I-特異性)的曲線圖。測試的測量結果在X軸上表示，而y軸表示對照(例如健康)或病例(例如癌癥)受試者的數(shù)目。對于任何給定切割點(沿著X軸的每個點)，可以測量測定的靈敏度和特異性。對于任何給定測定的靈敏度和特異性的范圍可以在0%到100%中變化，取決于所選的切割點。為此，在某些優(yōu)選實施方案中，AUC用作測定的特異性和/或靈敏度的標準測量。關于ROC曲線曲線圖的“曲線下面積”(“AUC”)等于分類器排序隨機選擇的肯定情形高于隨機選擇的否定情形的概率。因此，AUC是成功區(qū)分病例(例如癌癥)與對照(例如健康)受試者的測試能力的一般測量。隨機機率將生成O. 5的AUC。因此，在一個實施方案中，有用的測試優(yōu)選具有大于O. 50的 AUC，包括從O. 51到I. 00的任何值，例如從O. 55到I. 00、從O. 60到I. 00、從O. 65到I. 00、從 O. 70 到 I. 00、從 O. 75 到 I. 00、從 O. 80 到 I. 00、從 O. 85 到 I. 00、從 O. 90 到 I. 00、從 O. 95到 I. 00，且最優(yōu)選 I. 00。大于 O. 50 的 AUC 值包括 O. 51,0. 52,0. 52,0. 54,0. 55,0. 56,0. 57、O. 58、0· 59、0· 60、0· 61 >0. 62、0· 63、0· 64、0· 65、0· 66、0· 67、0· 68、0· 69、0· 70、0· 71、0· 72、O. 73,0. 74,0. 75,0. 76,0. 77,0. 78,0. 79,0. 80,0. 81,0. 82,0. 83,0. 84,0. 85,0. 86,0. 87、O. 88,0. 89,0. 90,0. 91,0. 92,0. 93,0. 94,0. 95,0. 96,0. 97,0. 98 和 O. 99。本文數(shù)據(jù)顯示抗GcSTn抗體給出在乳腺癌受試者與女性對照比較的兩個獨立集上O. 67和O. 60的AUC，和在肺、卵巢、胰腺、子宮內(nèi)膜、前列腺和結腸癌與對照比較的獨立集上O. 69的AUC。內(nèi)部交叉驗證證實這些結果分別具有O. 63,0. 68和O. 67的平均AUCs?；趦?nèi)部交叉驗證的非常嚴格的排列檢驗，確定了關于每個獨立集的平均AUC的96%置信區(qū)間。對于訓練乳腺癌集、驗證乳腺癌集和對于其他癌癥驗證集，這些分別是O. 29-0. 91,0. 167-0. 917、和O. 283-0. 817。方法和/或分子對于疾病的“靈敏度”，例如與“癌癥靈敏度”可互換使用的“對于癌癥的靈敏度”，指陽性(即具有癌癥的個體)的比例(例如百分比、部分等)，其像這樣正確鑒定(例如其鑒定為具有該狀況的具有癌癥的人的百分比)。靈敏度可以根據(jù)下式進行計算靈敏度=真陽性的數(shù)目/(真陽性的數(shù)目+假陰性的數(shù)目)。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明的組合物和/或方法具有大于50%的“癌癥特異性”，包括從 51%到 100%的任何數(shù)值，例如 52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%和 99%。雖然 100%靈敏度是最希望的(即將來自癌癥組的所有受試者預測為具有癌癥)，但它不是必需的。在備選實施方案中，本發(fā)明的組合物和/或方法具有等于或低于50 %的“癌癥靈敏度”，包括從O %到50 %的任何數(shù)值，例如I %、2 %、3 %、4 %、6 %、6 %、7 %、8 %、9 %、10%,11 %>12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%,19%,20%,21 %,22%,23%,24%,25%,26%,27%,28%,29%,30%,31 %,32%,33%,34%,35%,36%,37%,38%,39%,40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%和49%。本文數(shù)據(jù)顯示在某些實施方案中，假陽性率(靈敏度)和假陰性率(特異性)都是1/6 = 20% (實施例4)。在另一個實施方案中，本文數(shù)據(jù)顯示靈敏度是37/176 = 21. I %，并且特異性是34/60 = 68% (實施例5)。在一個進一步的實施方案中，當靈敏度是O. 25時，平均特異性是0.79(實施例7)。在另外一個實施方案中，當靈敏度是O. 2和O. 3時，平均特異性分別是O. 84和O. 75 (實施例
8)。另外的靈敏度值顯示于實施例9中。在某些實施方案中，靈敏度表示(連同特異性)為二元分類測試的性能的統(tǒng)計測量，例如使用ROC曲線的AUC，如上文就特異性而言討論的?！熬厶恰敝付嗵腔蚬烟?。聚糖還可以用于指糖綴合物例如糖蛋白、糖脂或蛋白聚糖的碳水化合物部分。聚糖通常由單糖的O-糖苷鍵組成。例如，纖維素是由β-1，4-連接的D-葡萄糖組成的聚糖(或更具體而言葡聚糖)，并且殼多糖是由β_1，4-連接的N-乙?；?D-葡糖胺組成的聚糖。聚糖可以是單糖殘基的同或異聚物，并且可以是線性或分支的。在本發(fā)明中測試的聚糖顯示于表3中。 “唾液酸化”和“唾液酸基”化合物(例如唾液酸化抗原、唾液酸化聚糖、唾液酸化-Lex和唾液酸化-Lea)可互換地指含有唾液酸的化合物。“Neu5Gc_唾液酸化”化合物(例如Neu5Gc_唾液酸化抗原、Neu5Gc_唾液酸化聚糖、Neu5Gc-唾液酸化-Lex和Neu5Gc-唾液酸化-Lea)指含有末端N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(“Neu5Gc”)的唾液酸化化合物。相比之下，“Neu5Ac唾液酸化”化合物(例如Neu5Ac唾液酸化抗原、Neu5Ac唾液酸化聚糖、Neu5Ac唾液酸化-Lex和Neu5Ac唾液酸化-Lea)指含有N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)的唾液酸化化合物。例如，“Neu5Gc-唾液酸化聚糖”通過Neu5Gc a 2_6GalNAc a -R(聚糖6)例示，其中“R”通過下述基團例示生物素、白蛋白、ProNH2、-CH-、-OH > -OCH3、-OCH2-CH3、-H、hydr i do、輕基、燒氧基、氧、碳、硫、氮、磷、NH2、ProNH2 =O (CH2) 2CH2NH2、(OCH2CH2) 6NH2、O (CH2) 3NHC0CH2 (OCH2CH2) 6NH2、熒光標記 2-氨基苯甲酰胺(AB)和/或2-氨基苯甲酸(AA)、含有烷基胺的2-氨基苯甲酰胺類似物(AEAB)、氨基氧基-基團、甲氨基氧基_基團、酰肼基團、氨基脂質(zhì)I，2-雙十六燒基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DHPE)、氨基氧基(AO)官能化DHPE、糖基磷脂酰肌醇(GPI)。不預期限制“R”的來源或性質(zhì)，這包括影響GcSTn的物理間隔的結構。在某些實施方案中，與下層底物組合的R基團影響GcSTn間隔?！癗eu5Gc_唾液酸化抗原”包括Neu5Gc_唾液酸化聚糖、Neu5Gc_唾液酸化-Lex和Neu5Gc-唾液酸化-Lea，并且指含有末端N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(“Neu5Gc”)的免疫原性延長的聚糖鏈?！癗eu5Gc_ 唾液酸化聚糖”通過 GcSTn、Neu5Gc a 2_6GalNAc ct -R(聚糖 6)、Neu5Gc9Ac a 2_3Gal β l_4GlcNAc β -R (聚糖 2)、Neu5Gc a 2_6Lac β -R (聚糖 20)、和 Neu5Gc a 2_3Gal β l_3GalNAc β -R (聚糖 34)、Neu5Gc a 2_6GalNAc α -OR (聚糖 6)、Neu5Gc9Ac a 2_3Gal β l_4GlcNAc β -OR (聚糖 2)、Neu5Gc a 2_6Lac β -OR (聚糖 20)、和Neu5Gc a 2-3Gal β l_3GalNAc β -OR(聚糖34)例示，其中R選自生物素、白蛋白、ProNH
2、-CH-> -OH> -OCH3> -OCH2-CH3^ _H、hydrido、輕基、燒氧基、氧、碳、硫、氣、憐、NH2> ProNH2=O (CH2) 2CH2NH2、(OCH2CH2) 6NH2、O (CH2) 3NHC0CH2 (OCH2CH2) 6NH2、熒光標記 2-氨基苯甲酰胺(AB)和/或2-氨基苯甲酸(AA)、含有烷基胺的2-氨基苯甲酰胺類似物(AEAB)、氨基氧基-基團、甲氨基氧基_基團、酸餅基團、氨基脂質(zhì)1，2-雙十六燒基-sn_甘油-3-憐酸乙醇胺(DHPE)、氨基氧基(AO)官能化DHPE、糖基磷脂酰肌醇(GPI)，并且其中Lac是Gali3 l-4GlcNAc。不預期限制“R”的來源或性質(zhì)，這包括影響GcSTn的物理間隔的結構。在某些實施方案中，與下層底物組合的R基團影響GcSTn間隔。“Neu5Gc-唾液酸化探針”指具有末端N-羥乙酰神經(jīng)氨酸和非還原末端接頭基團的延長聚糖鏈，其可以用于將探針綴合至底物。探針可以是在溶液中或固定在固體底物例如陣列上?；衔锏摹把苌铩敝敢淹ㄟ^一個或多個其元件的修飾改變的化合物。例如，“唾液酸化聚糖的衍生物”指已通過一個或多個其元件的修飾改變的唾液酸化聚糖，包括在癌癥中的修飾，如由90Ac-GcSTn例示的。下述術語是可互換使用的“GcSTn ”、“Neu5Gc-唾液酸基-Tn ”、“Neu5Gc a 2_6GalNAc α l-0-Ser/Thr”和“二糖N-羥乙酰神經(jīng)氨酸-α 2-6-Ν-乙酰半乳糖胺-α ”。GcSTn是Neu5Gc-唾液酸化抗原的一個例子。“抗Neu5Gc_唾液酸基-Tn抗體”指特異性結合本發(fā)明的新型Neu5Gc a 2_6GalNAc α l-0-Ser/Thr 的抗體。“N-羥乙酰神經(jīng)氨酸”和“Neu5Gc”是可互換的?！癗-乙酰神經(jīng)氨酸”和“Neu5Ac”是可互換使用的，并且指羥基化形式的N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc)?！巴僖核峄?Τη”和“STn”是可互換使用的，以指粘蛋白碳水化合物相關抗原(Neu5Ac a 2_6GalNAc α 1-0-Ser/Thr)(唾液酸 a 2_6GalNAc α 1-0-Ser/Thr)?！巴僖核峄?Lex” 指 Neu5Aca 2_3GaiP 1-4 (Fuc α 1-3) GlcNAc “唾液酸基-Lea ”指唾液酸基-Lex的區(qū)域異構體(Neu5Aca 2_3Galβ 1-3(Fucα 1-4)GlcNAc)。“9-0-乙?；?_GD3”指 Neu5，9Ac2 a 2_8Neu5Ac a 2_3Gal β l_4Glc β 1-1 神經(jīng)酰胺。當提及相對于第二種樣品(或相對于第二個受試者)，在第一種樣品中(或在第一個受試者中)的任何分子(例如，氨基酸序列和核酸序列、聚糖、Neu5Gc-唾液酸化抗原(例如唾液酸化聚糖)、Neu5Gc-唾液酸化抗原的表位、Neu5Gc-唾液酸化抗原的衍生物、抗體(例如其特異性結合Neu5Gc-唾液酸化抗原、Neu5Gc-唾液酸化抗原的表位和Neu5Gc-唾液酸化抗原的衍生物中的一種或多種)等)、細胞和/或現(xiàn)象(例如疾病癥狀、與分子的結合、兩種分子的結合特異性、兩種分子的結合親和力、對于癌癥的特異性、對于癌癥的靈敏度、結合的親和力、酶活性等)時，術語“減少”、“抑制”、“減小”、“壓制”、“降低”和語法等價物(包括“更低的”、“更小的”等)，意指在第一種樣品中(或在第一個受試者中)分子、細胞和/或現(xiàn)象的量低于在第二種樣品中(或在第二個受試者中)任何量，所述量使用任何領域公認的統(tǒng)計分析法是統(tǒng)計上顯著的。在一個實施方案中，在第一種樣品中(或在第一個受試者中)分子、細胞和/或現(xiàn)象的數(shù)量比在第二種樣品中(或在第二個受試者中)中相同分子、細胞和/或現(xiàn)象的量低至少10%、低至少25%、低至少50%、低至少75%、和/或低至少90%。在另一個實施方案中，在第一種樣品中(或在第一個受試者中)分子、細胞和/或現(xiàn)象的量比在第二種樣品中(或在第二個受試者中)中相同分子、細胞和/或現(xiàn)象的量低從5%到100%的任何數(shù)目百分比，例如但不限于從10%到100%、從20%到100%、從 30%到 100%、從 40%到 100%、從 50%至Ij 100%、從 60%到 100%、從 70%到 100%、從
80%到100%、和從90%到100%。在一個實施方案中，第一個受試者沒有通過使用本發(fā)明的組合物和/或方法處理的受試者例示，但不限于其。在一個進一步的實施方案中，第二個受試者通過沒有使用本發(fā)明的組合物和/或方法處理的受試者例示，但不限于其。在一個備選實施方案中，第二個受試者通過與第一個受試者相比較，已使用本發(fā)明的組合物和/或方法、以不同劑量和/或不同持續(xù)時間和/或經(jīng)由不同施用途徑處理的受試者例示，但不限于其。在一個實施方案中，第一個和第二個受試者可以是相同個體，例如其中尋求在一個個體中測定本發(fā)明的組合物和/或方法的不同方案(例如劑量、持續(xù)時間、施用途徑等)的效應。在另一個實施方案中，第一個和第二個受試者可以是不同個體，例如當比較本發(fā)明的組合物和/或方法對參加臨床試驗的一個個體和在醫(yī)院中的另一個個體的作用時。當提及相對于第二種樣品(或相對于第二個受試者)，在第一種樣品中(或在第一個受試者中)的任何分子(例如，氨基酸序列和核酸序列、聚糖、Neu5Gc-唾液酸化抗原(例如唾液酸化聚糖)、Neu5Gc-唾液酸化抗原的表位、Neu5Gc-唾液酸化抗原的衍生物、抗 體(例如其特異性結合Neu5Gc-唾液酸化抗原、Neu5Gc-唾液酸化抗原的表位和Neu5Gc-唾液酸化抗原的衍生物中的一種或多種)等)、細胞和/或現(xiàn)象(例如疾病癥狀、與分子的結合、兩種分子的結合特異性、兩種分子的結合親和力、對于癌癥的特異性、對于癌癥的靈敏度、結合的親和力、酶活性等)時，術語“增加”、“升高”、“上升”和語法等價物(包括“更高的”、“更大的”等)，意指在第一種樣品中(或在第一個受試者中)分子、細胞和/或現(xiàn)象的量高于在第二種樣品中(或在第二個受試者中)任何量，所述量使用任何領域公認的統(tǒng)計分析法是統(tǒng)計上顯著的。在一個實施方案中，在第一種樣品中(或在第一個受試者中)分子、細胞和/或現(xiàn)象的數(shù)量比在第二種樣品中(或在第二個受試者中)中相同分子、細胞和/或現(xiàn)象的數(shù)量高至少10 %、高至少25 %、高至少50 %、高至少75 %、和/或高至少90 %。這包括但不限于，在第一種樣品中(或在第一個受試者中)分子、細胞和/或現(xiàn)象的數(shù)量比在第二種樣品中(或在第二個受試者中)中相同分子、細胞和/或現(xiàn)象的數(shù)量超過至少10%,超過至少15%、超過至少20%、超過至少25%、超過至少30%、超過至少35%、超過至少40%、超過至少45%、超過至少50%、超過至少55%、超過至少60%、超過至少65%、超過至少70%、超過至少75%、超過至少80%、超過至少85%、超過至少90%、和/或超過至少95%。在一個實施方案中，第一個受試者通過已使用本發(fā)明的組合物和/或方法處理的受試者例示，但不限于其。在一個進一步的實施方案中，第二個受試者通過沒有使用本發(fā)明的組合物和/或方法處理的受試者例不，但不限于其。在一個備選實施方案中，第二個受試者通過與第一個受試者相比較，已使用本發(fā)明的組合物和/或方法、以不同劑量和/或不同持續(xù)時間和/或經(jīng)由不同施用途徑處理的受試者例示，但不限于其。在一個實施方案中，第一個和第二個受試者可以是相同個體，例如其中尋求在一個個體中測定本發(fā)明的組合物和/或方法的不同方案(例如劑量、持續(xù)時間、施用途徑等)的效應。在另一個實施方案中，第一個和第二個受試者可以是不同個體，例如當比較本發(fā)明的組合物和/或方法對參加臨床試驗的一個個體和在醫(yī)院中的另一個個體的作用時。本文提及任何數(shù)目范圍特別包括由那個范圍包含的每個數(shù)值(包括分數(shù)和整數(shù))。為了舉例說明且非限制性地，本文提及“至少50”的范圍包括50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60 等的整數(shù)，和分數(shù) 50. 1,50. 2,50. 3,50. 4,50. 5,50. 6,50. 7,50. 8,50. 9 等。在進一步舉例說明中，本文提及“小于50 ”的范圍包括整數(shù)49、48、47、46、45、44、43、42、41、40 等，和分數(shù) 49. 9,49. 8,49. 7,49. 6,49. 5,49. 4,49. 3,49. 2,49. 1,49. O 等。在另外一個舉例說明中，本文提及“5-10”的范圍包括5、6、7、8、9和10的每個整數(shù)，和每個分數(shù)例如5. I、
5.2,5. 3,5. 4,5. 5,5. 6,5. 7,5. 8,5. 9 等。如本文使用的，當提及樣品、細胞、組織、動物等時，術語“對照”指本領域普通技術人員可以用于比較結果與另一個樣品、細胞、組織、動物等的任何類型的樣品、細胞、組織、動物等，通過維持相同條件，除了某一個特定因子外，且從而推斷這個改變因子的原因顯著性。發(fā)明簡述本發(fā)明提供了下述發(fā)現(xiàn)當Neu5Gc替換在人癌癥中是超表達的任何唾液酸化抗原中的Neu5Ac時，這生成新型癌癥特異性抗原和癌癥特異性抗體應答。因此，本發(fā)明提供了下述發(fā)現(xiàn)癌癥與在人癌癥中是超表達的任何唾液酸化抗原中天然存在的Neu5Ac由 Neu5Gc的替換相關。因此，本發(fā)明提供了由下述例示的癌癥標記a)Neu5Gc_唾液酸化抗原，b)Neu5Gc-唾液酸化抗原的表位，c)Neu5Gc-唾液酸化抗原的衍生物，和d)特異性結合抗原、表位和衍生物中的一種或多種的抗體。本發(fā)明進一步提供了通過檢測這些癌癥標記中的一種或多種用于檢測癌癥的方法，例如通過檢測特異性結合抗原、表位和衍生物中的一種或多種和針對這些標記的抗體的抗體。人癌可以代謝摻入且呈現(xiàn)飲食非人唾液酸Neu5Gc，其與人唾液酸N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)相差一個氧原子。腫瘤相關的Neu5Gc可以與低水平的循環(huán)抗Neu5Gc抗體相互作用，從而在人樣Neu5Gc缺陷小鼠模型中促進經(jīng)由慢性炎癥的腫瘤進展。人抗Neu5Gc抗體的這種多克隆譜還包括潛在的癌癥生物標記。我們在癌癥和非癌癥患者的血清中表征其，使用呈現(xiàn)多種Neu5Gc聚糖和對照Neu5Ac聚糖的新型唾液酸聚糖微陣列。在一個實施方案中，發(fā)現(xiàn)針對Neu5Gca 2_6GalNAca 1-0-Ser/Thr (GcSTn)的抗體在具有癌比具有其他疾病的患者中更顯著。這種罕見表位源于摻入癌標記唾液酸基-Tn內(nèi)的飲食Neu5Gc，并且是用于生物標記生成的此類新型機制的第一個例子。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測受試者中的癌癥的組合物和方法，其包括檢測相對于對照樣品，在來自受試者的樣品中一種或多種Neu5Gc-唾液酸化抗原、Neu5Gc-唾液酸化抗原的表位和Neu5Gc-唾液酸化抗原的衍生物中的一種或多種的增加水平，其中Neu5Gc_唾液酸化抗原選自Neu5Gc a 2_6GalNAc a -R (聚糖6)、Neu5Gc9Ac a 2_3Gal β l_4GlcNAc β -R (聚糖 2)、Neu5Gc a 2_6Lac β -R (聚糖 20)、和Neu5Gc a 2_3Gal β l_3GalNAc β -R (聚糖34)，其中R是聚糖可以與之偶聯(lián)的任何天然或非天然分子，例如生物素、白蛋白、ProNH2 (表3)、-CH-, -OH、-OCH3> -OCH2-CH3^ -H、hydrido、輕基、燒氧基、氧、碳、硫、氮、磷、NH2、ProNH2 = O(CH2)2CH2NH2^ (OCH2CH2)6NH2、O (CH2) 3NHC0CH2 (OCH2CH2) 6NH2、熒光標記2-氨基苯甲酰胺(AB)和/或2-氨基苯甲酸(AA)、含有烷基胺的2-氨基苯甲酰胺類似物(AEAB)、氨基氧基-基團、甲氨基氧基-基團、酰肼基團、氨基脂質(zhì)1，2-雙十六烷基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DHPE)、氨基氧基(AO)官能化DHPE、糖基磷脂酰肌醇(GPI)等，并且其中Lac是Gal β l-4GlcNAc,從而檢測受試者中癌癥的存在。在某些實施方案中，唾液酸化聚糖是純化的。在一個實施方案中，該方法進一步包括治療受試者。本文數(shù)據(jù)顯示雖然具有不同特異性的抗Neu5Gc抗體在人血清中是普遍的，但與健康對照相比較，抗Neu5Gc-唾液酸基-Tn抗體在癌患者中是一致升高的(表3)。在某些實施方案中，R是ProNH2，并且唾液酸化聚糖選自Neu5Gca2-6GalNAca-R(聚糖 6)、Neu5Gc9Ac a 2_3Gal β l_4GlcNAc β -R(聚糖 2)、Neu5Gc a 2_6Lac β -R(聚糖 20)、和Neu5Gc a 2_3Gal β l_3GalNAc β -R(聚糖34)。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，唾液酸化聚糖包含 Neu5Gc a 2_6GalNAc a -R (聚糖 6)和 / 或 Neu5Gc a 2_6GalNAc a -OR (表 3)。在某些實施方案中，檢測樣品中的唾液酸化聚糖涉及檢測抗體的存在和/或水平，所述抗體特異性結合唾液酸化聚糖和/或特異性結合其表位。本發(fā)明并不限于抗體的特定類型、或用于測定抗體水平的方法，所述抗體特異性結合唾液酸化聚糖。事實上，用于檢測N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc)和抗Neu5Gc特異性抗體的一般方法是本領域已知的(例如Varki等人美國專利申請2007/0275409，2007年11月29日公開)且在本文中公開。

在特定實施方案中，特異性結合唾液酸化聚糖的抗體以較低水平結合選自N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc)和唾液酸基-Tn (STn)的一種或多種分子。在一個更優(yōu)選實施方案中，特異性結合唾液酸化聚糖的抗體不特異性結合選自N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc)和唾液酸基-Tn(STn)的一種或多種分子。雖然本發(fā)明的組合物和方法并不限于任何特定特異性和/或靈敏度，但在一個實施方案中，特異性結合唾液酸化聚糖的抗體具有大于O. 50的關于癌癥的接受者操作特性(ROC)曲線的曲線下面積(AUC)。在另一個實施方案中，特異性結合唾液酸化聚糖的抗體具有大于50%的癌癥特異性和/或具有大于50%的癌癥靈敏度。在其他實施方案中，癌癥特異性等于或低于50%。本發(fā)明的組合物和方法的一個優(yōu)點是癌癥的早期檢測。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的組合物和方法可以應用于缺乏可檢測的癌癥癥狀的受試者(在例如早期篩選中有用)、處于癌癥的危險中的受試者(在例如早期篩選中有用)、和具有一種或多種可檢測的癌癥癥狀的受試者(在例如癌癥診斷的證實中有用)。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明的組合物和方法可以用于監(jiān)控癌癥和/或癌癥治療的進展。本發(fā)明的組合物和方法可以與任何癌癥例如癌結合使用。不預期將癌癥限于任何特定來源，在某些實施方案中，癌癥選自前列腺癌、卵巢癌、肺癌、結腸癌、胰腺癌和子宮內(nèi)膜癌。在另一個實施方案中，癌癥選自轉(zhuǎn)移性癌癥(例如轉(zhuǎn)移性癌)和非轉(zhuǎn)移性癌癥(例如非轉(zhuǎn)移性癌)。在某些實施方案中，本發(fā)明的方法采用對照樣品的使用。不限制對照樣品的類型或來源，在一個實施方案中，對照樣品來自缺乏癌癥的組織。這通過來自相同或不同受試者的對照樣品例示，例如對于性別和/或年齡匹配的受試者，具有良性腫瘤的受試者等。本發(fā)明還提供了選自下述的經(jīng)分離的唾液酸化聚糖Neu5Gc a 2_6GalNAc a -R(聚糖 23)、Neu5Gc9Ac a 2_3Gal β l_4GlcNAc β -R (聚糖 21)、Neu5Gc a 2_6Lac β -R (聚糖30)、Neu5Gc a 2_3Gal β l_3GalNAc β -R (聚糖 37)、Neu5Gc a 2_6GalNAc a -OR (聚糖 23)、Neu5Gc9Ac a 2_3Gal β l_4GlcNAc β -OR (聚糖 21)、Neu5Gc a 2_6Lac β -OR (聚糖 30)、和Neu5Gc a 2_3Gal β l_3GalNAc β -OR (聚糖37)，其中R是聚糖可以與之偶聯(lián)的任何天然或非天然分子，例如生物素、白蛋白、ProNH2 (表3)、-CH-, -OH、-OCH3> -OCH2-CH3^ -H、hydrido、輕基、燒氧基、氧、碳、硫、氮、磷、NH2、ProNH2 = O(CH2)2CH2NH2^ (OCH2CH2)6NH2、O (CH2) 3NHCOCH2 (OCH2CH2) 6NH2、熒光標記2-氨基苯甲酰胺(AB)和/或2-氨基苯甲酸
(AA)、含有烷基胺的2-氨基苯甲酰胺類似物(AEAB)、氨基氧基-基團、甲氨基氧基-基團、酰肼基團、氨基脂質(zhì)I，2-雙十六燒基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DHPE)、氨基氧基(AO)官能化DHPE、糖基磷脂酰肌醇(GPI)等，并且其中Lac是Gal β l_4GlcNAc。在一個實施方案中，唾液酸化聚糖選自Neu5Gc a 2_6GalNAc a ProNH2 (聚糖23)、Neu5Gc a 2_6Lac β ProNH2 (聚糖 30)、Neu5Gc9Ac a 2_3Gal β l_4GlcNAc β ProNH2 (聚糖 21)、和Neu5Gc a 2_3Gal β l_3GalNAc β ProNH2 (聚糖37)。本發(fā)明的唾液酸化聚糖用作抗原用于生成特異性結合唾液酸化聚糖的抗體?？雇僖核峄厶强贵w依次可以用于生成特異性結合抗唾液酸化聚糖抗體的次級抗體。這些次級抗體用于檢測抗唾液酸化聚糖抗體，例如來自篩選癌癥的受試者的樣品中的那些。本發(fā)明還提供的是抗唾液酸化聚糖抗體，其特異性結合唾液酸化聚糖、唾液酸化聚糖的表位和唾液酸化聚糖的衍生物，其中所述唾液酸化聚糖選自Neu5Gc a 2_6GalNAc a -R (聚糖 23)、Neu5Gc9Ac a 2_3Gal β l_4GlcNAc β -R (聚糖21)、Neu5Gca2-6LacP_R(聚糖 30)、Neu5Gc a 2-3G α β l_3GalNAc β-R(聚糖 37)、·Neu5Gc a 2_6GalNAc α -OR (聚糖 23)、Neu5Gc9Ac a 2_3Gal β l_4GlcNAc β -OR (聚糖 21)、Neu5Gc a 2_6Lac β -OR (聚糖 30)、和 Neu5Gc a 2_3Gal β l_3GalNAc β -OR (聚糖 37)，其中R是聚糖可以與之偶聯(lián)的任何天然或非天然分子，例如生物素、白蛋白、ProNH2(表3)、-CH-、-OH> -OCH3、-OCH2-CH3、-H、hydrido、輕基、燒氧基、氧、碳、硫、氮、磷、NH2、ProNH2 =O (CH2) 2CH2NH2、(OCH2CH2) 6NH2、O (CH2) 3NHC0CH2 (OCH2CH2) 6NH2、熒光標記 2-氨基苯甲酰胺(AB)和/或2-氨基苯甲酸(AA)、含有烷基胺的2-氨基苯甲酰胺類似物(AEAB)、氨基氧基-基團、甲氨基氧基-基團、酰肼基團、氨基脂質(zhì)I，2-雙十六燒基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DHPE)、氨基氧基(AO)官能化DHPE、糖基磷脂酰肌醇(GPI)，并且其中Lac是Gali3 1-4GlcNAc。在一個特定實施方案中，唾液酸化聚糖選自Neu5Gc a 2_6GalNAc a ProNH2 (聚糖23)、Neu5Gc a 2_6Lac β ProNH2 (聚糖 30)、Neu5Gc9Ac a 2_3Gal β l_4GlcNAc β ProNH2 (聚糖 21)、和Neu5Gc a 2_3Gal β l_3GalNAc β ProNH2 (聚糖37)。如上文討論的，抗唾液酸化聚糖抗體可以用于生成特異性結合抗唾液酸化聚糖抗體的次級抗體。這些次級抗體用于檢測抗唾液酸化聚糖抗體，例如來自篩選癌癥的受試者的樣品中的那些。本發(fā)明進一步提供了含有選自下述的一種或多種分子的組合物和試劑盒(a) —種或多種唾液酸化聚糖、唾液酸化聚糖的表位、和唾液酸化聚糖的衍生物，其中所述唾液酸化聚糖選自 Neu5Gc a 2_6GalNAc a -R (聚糖 23)、Neu5Gc9Ac a 2_3Gal β l_4GlcNAc β -R (聚糖 21)、Neu5Gca 2-6Lac^-R(聚糖 30)、和 Neu5Gc a 2_3Gal β l_3GalNAc β -R (聚糖 37)、Neu5Gc a 2_6GalNAc α -OR (聚糖 23)、Neu5Gc9Ac a 2_3Gal β l_4GlcNAc β -OR (聚糖 21)、Neu5Gc a 2_6Lac β -OR (聚糖 30)、和 Neu5Gc a 2_3Gal β l_3GalNAc β -OR (聚糖 37)，其中R是聚糖可以與之偶聯(lián)的任何天然或非天然分子，例如生物素、白蛋白、ProNH2(表3)、-CH-> -OH> -OCH3> -OCH2-CH3^ _H、hydrido、輕基、燒氧基、氧、碳、硫、氣、憐、NH2> ProNH2=O (CH2) 2CH2NH2、(OCH2CH2) 6NH2、O (CH2) 3NHC0CH2 (OCH2CH2) 6NH2、熒光標記 2-氨基苯甲酰胺
(AB)和/或2-氨基苯甲酸(AA)、含有烷基胺的2-氨基苯甲酰胺類似物(AEAB)、氨基氧基-基團、甲氨基氧基-基團、酰肼基團、氨基脂質(zhì)I，2-雙十六燒基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DHPE)、氨基氧基(AO)官能化DHPE、糖基磷脂酰肌醇(GPI)等，并且其中Lac是Gal^ l-4GlcNAc, (b)抗唾液酸化聚糖特異性抗體，和(c)特異性結合抗唾液酸化聚糖抗體的抗體。發(fā)明詳述在一個實施方案中，基于針對免疫原性非人飲食異種-自身抗原的異種-自身抗體可以充當生物標記的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了用于癌癥檢測的組合物和方法。本發(fā)明的實施方案提供了癌癥的早期檢測，例如在通過其他方法例如乳房X線照相術檢測癌癥前。本發(fā)明的實施方案還提供了癌癥進展和治療的監(jiān)控。本發(fā)明的實施方案基于下述發(fā)現(xiàn)飲食Neu5Gc可以代謝替換STn中的Neu5Ac，生成由異種-自身抗體特異性識別的，獨特的新腫瘤相關異種-自身抗原GcSTn。這種新型癌癥生物標記涉及代謝摻入的免疫原性飲食分子。本發(fā)明的實施方案進一步基于下述觀察Neu5Gc還可以替換其他腫瘤相關聚糖結構中的Neu5Ac，從而生成其他新型生物標記，例如Ge-唾液酸基-Lex、Ge-唾液酸基-LeaJP Gc-9-O-乙?；鵢GD3。新型Neu5Gc_唾液酸化抗原的例子在表3中在實施例2中提供(參見下文)。 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了抗GcSTn IgG是獨特的人癌相關生物標記的發(fā)現(xiàn)。有趣的是，聚糖6類似癌相關生物標記唾液酸基-Tn (STn ；Neu5Aca2_6GalNAcα l-0-Ser/Thr)，除 Neu5Ac 替換為 Neu5Gc(GcSTn ;Neu5Gca 2_6GalNAc a 1-0-Ser/Thr)夕卜。本文數(shù)據(jù)證實通過癌癥患者的飲食Neu5Gc消耗將STn的末端Neu5Ac替換為Neu5Gc，生成新型異種-自身抗原GcSTn，連同其相應特異性抗GcSTn抗體(圖3D)，作為新型癌生物標記(基于約400個癌患者和對照)。這些步驟在早期腫瘤階段時類似地發(fā)生，暗示抗GcSTn抗體對于癌的早期檢測或測定未來危險有用。本發(fā)明提供了用于檢測作為用于癌癥檢測和監(jiān)控的有用生物標記的抗GcSTn IgG的組合物和方法，包括但不限于癌的早期檢測。例如，本發(fā)明的一個實施方案顯示乳腺癌的檢測，具有O. 6的估計AUC。本發(fā)明提供了體現(xiàn)下述發(fā)現(xiàn)的組合物和方法通過癌癥患者的Neu5Gc消耗將Neu5Ac代謝替換為Neu5Gc,生成聚糖異種-自身抗原。本發(fā)明還提供了體現(xiàn)相應異種-自身抗體是獨特腫瘤生物標記的發(fā)現(xiàn)的組合物和方法。在一個實施方案中，使用含有多種Neu5Gc聚糖與對照Neu5Ac匹配聚糖的新型高流通量唾液酸聚糖微陣列，我們顯示針對Neu5Gc-唾液酸基-Tn (GcSTn ；Neu5Gc a 2_6GalNAc a 1-0-Ser/Thr)的人血清抗體在癌患者中富集超過對照。用于檢測癌癥特異性抗原的方法是本領域已知的(例如在通過引用整體合并的Robbins等人，美國專利號5，902，725中描述的前列腺特異性抗原(PSA)的檢測)。然而，與前列腺特異性抗原(PSA)不同，在某些實施方案中，本發(fā)明基于通過Neu5Gc攝取的癌癥特異性，和/或Cosmc滅活依賴性Neu5Gc摻入本發(fā)明的Neu5Gc_唾液酸化抗原(例如Gc-STn)內(nèi)，和/或針對本發(fā)明的Neu5Gc-唾液酸化抗原的人抗體應答。換言之，通過測定針對本發(fā)明的Neu5Gc-唾液酸化抗原(例如Gc-STn)的異種自身抗體，我們可以利用人免疫應答的擴增效應，增加用于檢測本發(fā)明的隱蔽Neu5Gc-唾液酸化抗原(例如Gc-STn)的靈敏度。可以監(jiān)控通過改變這些抗體水平來減少癌癥危險的另外治療操縱且用于調(diào)整治療。因此，本發(fā)明組合物和方法可以用于發(fā)展癌癥的增加危險的預測、癌癥的早期診斷、和免疫的藥效監(jiān)控和/或由于抗Neu5Gc-Tn抗體用于處于發(fā)展癌癥的增加危險中的患者的飲食調(diào)節(jié)處理。O聯(lián)糖基化在癌癥中是不完全的，因為在X染色體上的體細胞Cosmc突變導致在癌癥特別是癌中唾液酸化Tn(STn)抗原的表達。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了體現(xiàn)下述發(fā)現(xiàn)的方法和組合物飲食Neu5Gc在癌癥中的摻入導致一部分STn轉(zhuǎn)化成Neu5Gc_唾液酸基Tn (GcSTn)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了體現(xiàn)下述發(fā)現(xiàn)的方法和組合物免疫系統(tǒng)將GcSTn視為外源的且生成針對其的抗體，其可以使用本發(fā)明的組合物和方法在受試者的組織包括血清中檢測。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了體現(xiàn)下述發(fā)現(xiàn)的方法和組合物與現(xiàn)有技術癌癥標記相比較，針對GcSTn的這些抗體顯示對于癌癥與正常血清比較改善的靈敏度和特異性。因此，在一個進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了體現(xiàn)下述發(fā)現(xiàn)的方法和組合物測量這些的水平中的增加可以用于多種癌癥特別是癌的早期檢測。在特定實施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測下述的方法和組合物針對非人二糖N-羥乙酰神經(jīng)氨酸-α 2-6-Ν-乙酰半乳糖胺-a -OR (Neu5Gc a 2-6-GalNAc a -OR ；Neu5Gc-唾液酸基-Tn，下文稱為“Gc-STn”)誘導的人抗體(包括循環(huán)抗體)，用于癌癥的診斷、癌癥危險和疫苗接種/耐受化(tolerization)效應。Neu5Gc在人中不制備,但以大量存在于飲食中(特別是紅色肉類和飲食中)，且經(jīng)由在癌癥中是上調(diào)的胞飲作用和唾液酸溶酶體轉(zhuǎn)運蛋白，優(yōu)先通過癌性和癌前細胞吸收。癌細胞也頻繁經(jīng)歷X聯(lián)基因COSMC的半合子喪失，導致腫瘤標記唾液酸基-Tn的產(chǎn)生。唾液酸基-Tn和飲食Neu5Gc摻入的組合生成本發(fā)明的新型異種自身抗原Neu5Gc-唾液酸化抗原(例如Gc-STn)。人免疫系統(tǒng)將本發(fā)明的Neu5Gc-唾液酸化抗原(例如Gc-STn)視為外源的，并且生成針對其的抗體應答。具有不適當升高水平的針對本發(fā)明Neu5Gc-唾液酸化抗原(例如Gc-STn)的抗體的個體因此具有增加的癌癥危險，因為免疫系統(tǒng)檢測在隱蔽癌性細胞中異種自身抗原的存在。在這些抗體的水平中的變化可以用于篩選癌癥的發(fā)展和/或進展。本發(fā)明還可以用于監(jiān)控疫苗接種/耐受化的效應用于癌癥預防，使用本發(fā)明的Neu5Gc-唾液酸化抗原(例如Gc-STn)作為抗原。除唾液酸基-Tn夕卜，本發(fā)明的實施方案包括其他癌癥相關唾液酸糖苷(sialosides)，包括但不限于唾液酸基-Lex (Neu5Ac a 2_3Gal β 1-4 (Fuc α 1-3) GlcNAc)及其區(qū)域異構體唾液酸基-Lea(Neu5Aca 2-3Gal^ 1-3 (Fuc α 1-4)GlcNAc ;和9-0-乙?；?Gd3 (Neu5，9Ac2 a 2_8Neu5Ac a 2_3Gal β l_4Glc β 1-1 神經(jīng)酰胺)。Neu5Gc 還可以替換其他腫瘤相關聚糖結構中的Neu5Ac，從而生成其他新型生物標記例如Ge-唾液酸基_Lex。雖然大多數(shù)生物標記發(fā)現(xiàn)策略基于癌癥與對照比較的總體比較搜索，但基于我們關于抗Neu5Gc抗體的令人驚訝發(fā)現(xiàn)，我們選擇假設驅(qū)動的生物標記方法。本文數(shù)據(jù)證實尤其是通過癌癥患者的飲食Neu5Gc消耗導致Neu5Ac替換為Neu5Gc，生成新型異種_自身抗原，伴隨相應特異性異種-自身抗體，其用作生物標記用于例如癌的早期篩選。本文數(shù)據(jù)提供了通過人體液免疫系統(tǒng)特異性檢測的示例性異種-自身抗原Neu5Gc a 2_6GalNAc a 1-0-Ser/Thr (GcSTn)。使用具有 20 對 Neu5Gc 和 Neu5Ac 聚糖(相差單個氧原子)的聚糖陣列的數(shù)據(jù)顯示與健康對照相比較，針對GcSTn的抗體具有區(qū)分具有癌(且特別是非轉(zhuǎn)移性癌)的患者的有希望的能力。此類異種-自身抗體具有用于對于人癌癥的診斷和預測方法的潛力。
用20種可能的含Neu5Gc結構及其相應Neu5Ac匹配聚糖作為對照印刷高流通量唾液酸聚糖微陣列。來自具有乳腺癌或其他癌的患者的血清和來自健康對照的血清覆蓋在聚糖陣列上，并且測定結合每種聚糖的抗體。將樣品分成訓練和驗證數(shù)據(jù)集用于統(tǒng)計分析。此處我們顯示雖然具有不同特異性的抗Neu5Gc抗體在人血清中是普遍的，但與健康對照相比較，抗Neu5Gc-唾液酸基-Tn抗體在癌患者中是一致升高的。本文數(shù)據(jù)證實令人驚訝的發(fā)現(xiàn)尤其是通過癌癥患者的飲食Neu5Gc消耗導致Neu5Ac替換為Neu5Gc，生成新型異種-自身抗原。具體地，當細胞表面聚糖標記唾液酸基-Tn (Neu5Ac a 2_6GalNAc α l-0-Ser/Thr)中的末端 Neu5Ac 替換為 Neu5Gc 時，這導致新型異種-自身抗原Neu5Gc a 2_6GalNAc a 1-0-Ser/Thr (GcSTn)的生成，連同其相應特異性異種-自身抗體，抗Neu5Gc-STn抗體(圖3D)。此處我們證實針對這種新型異種-自身抗原的抗體，抗Neu5Gc-STn抗體，可以用作新型生物標記用于癌的早期篩選。這在無偏差聚糖微陣列方法中在相對大樣品大小的人血清中發(fā)現(xiàn)，所述相對大樣品大小的人血清允許我們使用嚴格的統(tǒng)計分析(Hawkins，2004，Ransohoff，2004)。
在某些實施方案中，本發(fā)明的組合物(例如Neu5Gc-唾液酸化抗原、Neu5Gc-唾液酸化聚糖等)固定在固體表面上(例如珠或陣列上)(參見美國專利公開號2010/0075344)。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的聚糖與載體結合，所述載體將三維聚糖結構最佳地暴露在陣列或珠表面上。用于制備聚糖陣列的方法在2005年3月7日提交的PCT/US2005/007370、2004年11月19日提交的美國臨時專利申請?zhí)?0/629，666中描述，其各自通過這種引用整體合并入本文并且構成本說明書的部分。連接系統(tǒng)已在2006年7月26日提交的美國臨時專利申請?zhí)?0/833，249中描述，其通過這種引用整體合并入本文并且構成本說明書的部分。實驗下述實施例作用于舉例說明本發(fā)明的特定實施方案和方面，并且不應解釋為限制其范圍。實施例I材料與方法血清樣品。研究總共386個癌癥病例和對照人血清，具有來自InstitutionalReview Board of the University of California, San Diego 的批準。事先獲得書面知情同意書。從在Moore' s UCSD Cancer Center Clinic就診的患者中收集血清,所述患者不具有已知或懷疑的妊娠或感染。將未鑒定的(De-identified)血清置于12個分開的條形編碼的等分試樣內(nèi)，并且貯存于_80°C。預期捕獲與樣品處理有關的EDRN通用數(shù)據(jù)元素(OTE)且在Bior印ository數(shù)據(jù)庫中記錄。我們測試來自175個乳腺癌患者和其他類型的癌，以及對于性別和可能的年齡匹配的對照(80)的血清，所述其他類型的癌包括前列腺
(39)、卵巢(29)、肺(14)、結腸(22)、胰腺(16)、子宮內(nèi)膜(11)。從在Cancer Center診所就診的患者中獲得對照血清，所述患者不具有診斷的癌癥，包括具有良性腫瘤的那些，因此升高條，因為它使得更加難以區(qū)分癌癥與對照(在對照組中存在13個良性腫瘤受試者，包括3個甲狀旁腺、3個皮膚、2個卵巢、2個甲狀腺、I個腎上腺、I個乳腺和I個口咽)?？缭剿邪┌Y病例，存在具有轉(zhuǎn)移性疾病的總共66個患者(34個乳腺癌、5個前列腺、3個卵巢、8個肺、7個結腸、9個胰腺、O個子宮內(nèi)膜)。用于分析的血清樣品在2個分開的研究室之間分開，具有10個樣品重疊用于質(zhì)量控制。根據(jù)最佳化方案,對來自Biorepository受試者的未鑒定的血清樣品實施微陣列雜交。將原始數(shù)據(jù)提供給生物統(tǒng)計學中心用于分析。因此，對于樣品的病例/對照狀態(tài)不知情地進行微陣列測定和初步統(tǒng)計分析?？贵w。純化的人免疫球蛋白(IgG)、Cy5_或Cy3_鏈霉親和素、Cy3_山羊抗人IgG (H+L)、Cy5-或 Cy3_Aff iniPure 驢抗雞 IgY(IgG) (H+L)、HRP-綴合的山羊抗人 Fe 片段和HRP-綴合的山羊抗小鼠Fe片段來自Jackson ImmunoResearch Laboratories,并且親和力純化的雞抗Neu5Gc如所述的(4)制備。糖綴合物。所有聚丙烯酰胺(PAA)-糖綴合物來自GlycoTech。人血清白蛋白(HSA)-綴合的唾液酸糖苷如所述的(6，7)合成。如先前描述的(8-10)，使用有效的單罐(one-pot)三酶化學酶促合成系統(tǒng)合成唾液酸聚糖對(其中唯一差異是Neu5Ac與Neu5Gc比較)。使用的所有糖綴合物的唾液酸(Sia)含量就其類型(NeuAC/Neu5GC+/-0-乙?；?化)、數(shù)量和純度進行分析。使用2M乙酸隨后為在80°C的3小時水解,通過酸水解從糖綴合物中釋放Sias。隨后將游離Sias用1，2_ 二氨基_4，5_亞甲二氧基苯(DMB)衍生，且通過反相HPLC (DMB-HPLC)用熒光檢測分析。Sias的定量通過與已知數(shù)量的DMB衍生的Neu5Ac比較完成(11)。唾液酸聚糖微陣列制造。環(huán)氧化物衍生的Corning載玻片購自Thermo FisherScientific (Pittsburgh, PA),并且用來自 Parallel Synthesis Technologies (SantaClara, CA)的具有50x50 μ m尖端的SMT-S50，Classic硅針印刷陣列，使用UCSF DeRisiLinear Servo Motor Microarrayer,生成 70 μ m直徑點。將40種糖綴合物(表2)分布在384孔來源平板上，使用4個重復孔/樣品和5 μ I/孔(版本7)。每種糖綴合物以250、125、62. 5和12. 5 μ M的四個濃度在最佳化的印刷緩沖液(300mM磷酸鹽緩沖液，pH8.4)中制備。為了監(jiān)控印刷質(zhì)量，我們對于每個印刷針使用以150 μ g/ml (在PBS中)的人IgG (Jackson ImmunoResearch)的重復孔。使用16根針,其中每根針印刷4個重復點/孔(通過使用384孔來源平板4次)，20個點/行，具有220mm的間隔。在每個載玻片上印刷一個全陣列(在約I小時/ 200個載玻片內(nèi))。在陣列室中的濕度水平在印刷過程中維持在約70%。將印刷的載玻片留在陣列甲板(arrayer deck)上過夜，允許濕度下降至環(huán)境水平。接下來，記錄載玻片的印刷次序(使用來自VWR的Fine Tip Black實驗室標記)，并且將載玻片包裝，真空密封且貯存于干燥室中在RT直至使用時。在各 200個載玻片的四個分批中經(jīng)過12天印刷載玻片，來自兩塊384孔來源平板(一塊平板用于每兩個印刷分批)，其在一個月內(nèi)顯色。如本文詳述的測試且分析與陣列載玻片的血清結合。20個唾液酸聚糖對(Neu5Ac與Neu5Gc比較；表2)如所述的(27_29)合成，且在最佳化的印刷緩沖液(300mM磷酸鹽緩沖液，pH 8.4)中以250、125、62. 5和12. 5μΜ以各4 次重復印刷在環(huán)氧化物載玻片(Thermo Fisher Scientific, Corning, Pittsburgh, PA)上，并且如本文詳述的測試且分析與陣列的血清結合。血清結合測定。將載玻片在染色皿中與50°C預溫的封閉溶液(在O. IM Tris pH9中O. 05M乙醇胺)溫育I小時，以封閉在載玻片表面上的剩余反應基團，隨后用50°C預溫的 dH20 洗漆 2 次。將載玻片置于 Antibody Amplifier ProHisto (Columbia, SC)中，并且用5ml/載玻片封閉溶液2(PBS/0VA，在PBS pH 7. 4中1% w/v卵白蛋白)在室溫(RT)封閉I小時，伴隨輕輕振蕩。接下來，將封閉溶液抽吸，且將I : 100稀釋的血清樣品加入每個載玻片(在PBS/OVA中，2. 5ml/載玻片)，且允許伴隨輕輕振蕩在RT溫育2小時。將載玻片用PBST (PBS, I % Tween)隨后用PBS洗滌2次，共10分鐘/洗滌伴隨振蕩。通過與在PBS 中 I : 500 稀釋的 Cy3-山羊抗人 IgG(H+L) (Jackson ImmunoResearch) (I. 5mg/ml)在RT溫育I小時檢測結合的抗體。將載玻片用PBST (PBS，1% Tween)隨后用PBS隨后為dH20洗滌2次，共10分鐘/洗滌伴隨振蕩，隨后以200xg離心3分鐘。將干燥載玻片真空密封且貯存于黑暗中，直至第二天掃描時。陣列載玻片加工。使用來自4個印刷日的載玻片(第I天198個載玻片；第2天118個載玻片；第3天150 ;和第4天2)。根據(jù)人血清樣品的分布，載玻片測定在兩個研究室平行執(zhí)行。進行統(tǒng)計分析以比較在研究室之間的再現(xiàn)性，并且顯示它們在檢測升高的Neu5Gc聚糖抗體表達水平中是非?？杀容^的。載玻片通過兩個研究室在總共10個不同日同時顯色(在印刷后一個月內(nèi))，同時對于待測定的樣品的病例/對照狀態(tài)不知情。如下所述，以兩個增益(以避免邊緣高/低信號的喪失)在顯色后一天掃描載玻片(最多48個載玻片/天)。對于在每個實驗日中的質(zhì)量控制(QC)，測定三個對照載玻片連同血清樣品。這包括在載玻片上作為單獨檢測物的Cy3-抗人IgG抗體(I 500，I. 5 μ g/ml)，用 Cy3-抗人IgG抗體檢測的與多重Neu5Gc聚糖表位具有已知高反應性的人血清(I 100 ；如所述的 S34(7))，和用 Cy3-Aff iniPure 驢抗雞 IgY 抗體(I I, 000,0. 75 μ g/ml)檢測的具有多克隆親和力純化的雞抗Neu5Gc抗體(I 10，000) (4)，如主要正文中詳述的。如果我們使用聚糖6作為代表(因此存在16個值/載玻片具有濃度12. 5,62. 5,125,250 μ M的4個重復滴定曲線)，來自Cy3-抗人IgG在增益=350時的對數(shù)抗體表達值是一致很低的且具有很少變異性(11個載玻片；Q1范圍5. 70-5. 70 ;中值范圍5. 70-5. 71 ；Q3范圍
5.70-5. 75)，而來自多克隆雞抗Neu5Gc抗體的值(10個載玻片；Q1范圍5.71-7. 15 ;中值范圍6. 80-7. 53;Q3范圍7. 0-7. 68)是一致很高的，并且來自S34的值(11個載玻片；Q1范圍5. 70-7. 28 ;中值范圍6. 09-7. 69 ;Q3范圍6. 33-7.81)是更可變的。這32個對照載玻片在11個掃描日期、5個印刷日且用5個不同載玻片印刷編號進行。圖像加工。載玻片以10 μ m分辨率用Gen印ix 4000B微陣列掃描儀(MolecularDevices Corporation, Union City, CA)掃描，使用兩個增益(350和450)。圖像分析用Genepix Pro 6. O 分析軟件(Molecular Devices Corporation)進行。質(zhì)量檢查和圖像分析程序使用5個病例和5個對照的初步訓練數(shù)據(jù)集進行測定。點定義為具有100 μ m固定半徑的循環(huán)特征；這給出比在Genepix掃描軟件中的可變半徑特征更一致的結果。執(zhí)行局部本底扣除，并且通過相對小的常數(shù)(基于用于原始數(shù)據(jù)的曲線圖，視覺上選擇為300)上移差異，以消除負值；如果它們是< 100單位，那么將移動的差異設為100 ;并且將所有值對數(shù)轉(zhuǎn)化，以確保正常性。使用兩個增益的結果是一致的；來自增益350的數(shù)據(jù)用于最終分析中。受試者特征。如表I中所述，總共386個癌癥病例和對照涉及這個研究中。跨越所有癌癥病例，存在具有轉(zhuǎn)移性疾病的總共66個病例。為了開發(fā)基本分析計劃且訓練初步分類器，使用具有知情的病例/對照狀態(tài)的5個乳腺癌病例和5個對照。用于初步分類器的驗證數(shù)據(jù)包括175個乳腺癌受試者和50個對照，具有對于分析統(tǒng)計學家和測定血清的科學家不知情的病例/對照狀態(tài)。關于這些受試者的病例/對照狀態(tài)隨后僅對于第一作者(senior author)是知情的，并且隨機選擇一半先前樣品(87個癌癥受試者和25個對照)作為訓練集，以選擇聚糖用于進一步考慮。另一半(86個癌癥受試者和25個對照)用作第二個驗證集，統(tǒng)計學家在這個階段時對于其仍是不知情的。最后獨立驗證集包括來自其他癌癥類型的131病例和30個另外對照。陣列統(tǒng)計方法。我們最初使用與具有高抗Neu5Gc抗體(如先前描述的S34 (Padler-Karavani等人,2008))的人血清雜交的24個載玻片，以開發(fā)質(zhì)量控制和分析方法。隨后，5個乳腺癌病例和5個對照的小訓練集用于開發(fā)我們的Neu5Gc抗體應答的定量評估且訓練我們的初步分類器。數(shù)據(jù)對于每個受試者載玻片分開標繪，具有不同符號用于不同針塊或濃度；我們使用如上所述在本底扣除、移動和閾值和對數(shù)轉(zhuǎn)化后的抗體表達值。針對20種Neu5Ac聚糖的抗體的表達值跨越受試者保持一致很低的，并且因此在每個載玻片內(nèi)的平均Neu5Ac抗體表達視為標準化因素。在載玻片上的每個受試者的抗Neu5Gc抗體應答用兩個參數(shù)(截距α和斜率β)概括，其將抗Neu5Gc抗體應答描述為Neu5Gc聚糖濃度的函數(shù)。這些參數(shù)由對于關于每個受試者的數(shù)據(jù)的混合效應模型擬合進行估計。在該模型中，我們最初包括關于所有潛在主要變異來源(印刷日、掃描日、載玻片印刷編號和針塊編號)的隨機效應， 然而，我們僅保留跨越受試者一致顯著的效應，使用以10%顯著性水平的似然比檢驗。對于每個受試者用于驅(qū)動參數(shù)α (在以最低濃度的Neu5Gc和Neu5Ac聚糖之間的平均差)和β (隨著濃度增加，在Neu5Gc和Neu5Ac聚糖之間在斜率中的差異)的最終模型在下文詳述。這個模型包括關于Neu5Gc的指示物(I個用于Neu5Gc和O個用于Neu5Ac)，用于濃度的項(值0、1、2和3分別對應于四個濃度12. 5,62. 5、125和250 μ Μ)和Neu5Gc指示物與濃度的相互作用項；包括隨機塊效應以解釋在針塊之間的變異(在每個載玻片上通常存在16個塊；1個載玻片對應于一個受試者)yiJk = a0+Q^Ii (Ge) + β。* 濃度,β *Ii (Ge) * 濃度,隨機(塊)+ 誤差 iJkyiJk是經(jīng)轉(zhuǎn)化的抗體表達值；i = 1，…，20 (指出20種Neu5Ac聚糖)和21 (指出4種目的Neu5Gc聚糖中的每一種)。j = 1，2，3和4，其分別指出測試的四個濃度值；k = 1，2，3和4，其指出四次重復(每個濃度中的每種聚糖)。對于訓練和兩個驗證數(shù)據(jù)集，對于每種聚糖，對于每個受試者獲得參數(shù)α和β作為抗Neu5Gc抗體應答的測量，并且隨后在邏輯回歸模型中用作預測物以區(qū)分癌癥病例與對照。回歸的預測力使用ROC曲線的曲線下面積(AUC)進行估計，并且10倍交叉驗證(cv)用于評估ROC曲線的變異性。在每次cv運行中，隨機選擇數(shù)據(jù)集中的90%病例和90%對照，并且隨后獲得來自擬合的邏輯回歸的估計系數(shù)，以計算關于受試者成為剩余10%受試者中的病例的概率。對于每次運行計算AUC，并且隨后跨越所有500次運行計算平均AUC。
2.5和97. 5百分位數(shù)用于構建在AUC上的95%置信區(qū)間。標繪概括ROC曲線；對ROC曲線水平地求平均值，以計算在給定靈敏度水平的特異性。分析在R版本2. 5中執(zhí)行；R0CR包
(12)用于概括交叉驗證ROC曲線。實施例2在一個示例性實施方案中，我們使用獨特的唾液酸聚糖微陣列，以描述針對作為新型類型的人血清癌生物標記的飲食有關抗原的抗體。這建立了飲食衍生的抗原可以代謝摻入腫瘤內(nèi)的新概念，生成通過免疫系統(tǒng)檢測的新型抗原。表I.通過癌癥類型的研究受試者綜述
權利要求
1.一種用于檢測受試者中的癌癥的方法，其包括在得自所述受試者的生物學樣品中測定選自下述的一種或多種化合物的水平 a)Neu5Gc-唾液酸化抗原， b)所述Neu5Gc_唾液酸化抗原的表位， c)所述Neu5Gc-唾液酸化抗原的衍生物，和 d)特異性結合所述抗原、所述表位和所述衍生物中的一種或多種的抗體， 其中當相對于對照正常樣品，檢測到更高水平的一種或多種所述化合物時，所述受試者鑒定為具有癌癥，并且當所述化合物的水平無一高于對照正常樣品時，所述受試者鑒定為無癌癥的。
2.權利要求I的方法,其中所述Neu5Gc-唾液酸化抗原選自 i)Neu5Gc-唾液酸化聚糖， ii)Neu5Gc-唾液酸化-Lex,和 iii)Neu5Gc-唾液酸化 _Lea。
3.權利要求2的方法，其中所述Neu5Gc-唾液酸化聚糖選自Neu5Gc a 2_6GalNAc a -R (聚糖 6)、Neu5Gc9Ac a 2_3Gal β l_4GlcNAc β -R (聚糖 2)、Neu5Gca 2-6Lac^-R(聚糖 20)、和 Neu5Gc a 2_3Gal β l_3GalNAc β-R(聚糖 34)、Neu5Gc a 2_6GalNAc α -OR(聚糖 6)、Neu5Gc9Ac a 2_3Gal β l_4GlcNAc β -OR(聚糖 2)、Neu5Gc a 2_6Lac β -OR (聚糖 20)、和 Neu5Gc a 2_3Gal β l_3GalNAc β -OR (聚糖 34)，其中 R選自生物素、白蛋白、ProNH2、-CH-, -OH、-OCH3> -OCH2-CH3^ -H、hydrido、羥基、烷氧基、氧、碳、硫、氮、磷、NH2、ProNH2 = O (CH2) 2CH2NH2、(OCH2CH2) 6NH2、O (CH2) 3NHC0CH2 (OCH2CH2) 6NH2、熒光標記2-氨基苯甲酰胺(AB)和/或2-氨基苯甲酸(AA)、含有烷基胺的2-氨基苯甲酰胺類似物(AEAB)、氨基氧基-基團、甲氨基氧基-基團、酰肼基團、氨基脂質(zhì)1，2-雙十六烷基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DHPE)、氨基氧基(AO)官能化DHPE、糖基磷脂酰肌醇(GPI)，并且其中 Lac 是 Gal β l_4GlcNAc。
4.權利要求3的方法，其中所述Neu5Gc-唾液酸化聚糖包含Neu5Gc a 2_6GalNAc a -R (聚糖 6)。
5.權利要求2的方法，其中所述Neu5Gc-唾液酸化-Lex包含Neu5Gca 2_3Galβ 1-4(Fucα 1-3)GlcNAc)。
6.權利要求2的方法，其中所述Neu5Gc-唾液酸化-Lea包含(Neu5Gc a 2_3Gal β 卜3 (Fuc α 1-4) GlcNAc 和 9-0-酰基 _GD3(Neu5，9Ac2 a 2-8Neu5Ac α 2_3Gal β l_4Glc β 1-1 神經(jīng)酰胺)中的一種或多種。
7.權利要求I的方法，其中所述抗體特異性結合包含Neu5Gca 2_6GalNAc a -R(聚糖6)的Neu5Gc-唾液酸化聚糖。
8.權利要求I的方法，其中所述測定包括檢測特異性結合所述Neu5Gc-唾液酸化抗原、所述抗原的所述表位和所述抗原的所述衍生物中的一種或多種的抗體。
9.權利要求I的方法，其中當檢測到一種或多種所述化合物的水平中的增加時，所述受試者指示用于開始抗癌治療。
10.權利要求I的方法，其中檢測到一種或多種所述化合物的水平中的增加，所述受試者指示用于確證診斷癌癥測試。
11.權利要求I的方法，其進一步包括在具有一種或多種所述化合物的水平中的增加的受試者中開始抗癌治療。
12.權利要求I的方法，其進一步包括在具有一種或多種所述化合物的水平的增加的受試者中執(zhí)行確證診斷癌癥測試。
13.權利要求8的方法，其中所述抗體特異性結合包含Neu5Gca 2_6GalNAc a -R(聚糖6)的Neu5Gc-唾液酸化聚糖。
14.權利要求8的方法，其中所述抗體具有大于O.50的關于癌癥的接受者操作特性(ROC)曲線的曲線下面積(AUC)。
15.權利要求8的方法，其中所述抗體具有大于50%的癌癥特異性。
16.權利要求8的方法，其中所述抗體具有大于50%的癌癥靈敏度。
17.一種經(jīng)分離的Neu5Gc-唾液酸化抗原，其選自 i)Neu5Gc-唾液酸化聚糖， ii)Neu5Gc-唾液酸化-Lex,和 iii)Neu5Gc-唾液酸化_Lea。
18.一種抗體，其特異性結合權利要求17的一種或多種Neu5Gc-唾液酸化抗原。
19.一種抗體，其特異性結合權利要求18的一種或多種抗體。
20.—種包含組合物的試劑盒，所述組合物含有權利要求17的Neu5Gc-唾液酸化抗原、權利要求18的抗體和權利要求19的抗體中的一種或多種。
全文摘要
本發(fā)明提供了唾液酸化聚糖和特異性結合其的抗體。本發(fā)明的組合物和關于使用其的方法對于癌癥的早期檢測和診斷是有用的。
文檔編號G01N33/574GK102893154SQ201180010659
公開日2013年1月23日 申請日期2011年1月14日 優(yōu)先權日2010年1月15日
發(fā)明者A·瓦基, R·B·斯克瓦布, V·派德勒-卡拉瓦尼, N·赫塔多-茲奧拉 申請人:加利福尼亞大學董事會, 西亞利克斯股份有限公司