專(zhuān)利名稱(chēng)：表面增強(qiáng)共振拉曼光譜術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在(生物)分子檢測(cè)(諸如在分子診斷領(lǐng)域)中使用的進(jìn)行表
面增強(qiáng)共振拉曼光譜術(shù)(SERRS)的方法和裝置。
背景技術(shù)：
拉曼光譜術(shù)是用于碳的結(jié)構(gòu)特征表示的普遍的非破壞性工具，其中， 可以使用分子對(duì)光的拉曼散射來(lái)提供關(guān)于樣本的化學(xué)組成和分子結(jié)構(gòu)的信 息。表面增強(qiáng)拉曼光譜術(shù)(SERS)是一種類(lèi)型的拉曼光譜(RS)技術(shù)，其從已 經(jīng)被吸收到某個(gè)專(zhuān)門(mén)準(zhǔn)備的金屬表面上的拉曼活性分析物分子中提供大大 增強(qiáng)的拉曼信號(hào)。因?yàn)槿肷浼す獾墓庾雍?jiǎn)單地傳播經(jīng)過(guò)物體(bulk),并且 來(lái)自物體的信號(hào)蓋過(guò)了來(lái)自表面分析物的任何拉曼信信號(hào)，所以RS對(duì)于表 面研究是無(wú)效的。另一方面，SERS是具有表面選擇性的和高度靈敏的，并 且其對(duì)表面信號(hào)的選擇性來(lái)自僅在表面存在的表面增強(qiáng)(SE)機(jī)制。
在文獻(xiàn)中描述了兩種主要增強(qiáng)機(jī)制分別是電磁和化學(xué)增強(qiáng)。電磁增 強(qiáng)的效果趨于優(yōu)勢(shì)地位，并且取決于金屬表面出現(xiàn)的粗糙特征，粗糙特征 是數(shù)十納米量級(jí)，與入射激勵(lì)放射線的波長(zhǎng)相比，粗糙特征很小。
表面增強(qiáng)共振拉曼光譜術(shù)(SERRS)是可以用于對(duì)在粗糙金屬表面吸收 的分子進(jìn)行靈敏地和有選擇地檢測(cè)和識(shí)別的技術(shù)，其中，共振拉曼光譜術(shù) 提供了對(duì)SERS進(jìn)一步的增強(qiáng)。在該情況下，通過(guò)選擇激光激勵(lì)波長(zhǎng)與指定 染料(dye)的吸收帶相符來(lái)實(shí)現(xiàn)拉曼信號(hào)的增強(qiáng)。共振拉曼效果對(duì)于本領(lǐng) 域的技術(shù)人員是已知的。
使用SERRS，可能將(由上述指定染料的)分子共振的靈敏度與表面增 強(qiáng)拉曼散射(SERS)的靈敏度相結(jié)合，使得可以測(cè)量非常低的濃度。例如， 可以將該技術(shù)應(yīng)用在分子診斷中，以便對(duì)包括在傳染病中的病原體細(xì)菌或 者蛋白質(zhì)的脫氧核糖核酸(DNA)進(jìn)行識(shí)別。在該情況下，快速和高靈敏度識(shí) 別對(duì)于有效治療是至關(guān)重要的，并且廣泛使用光學(xué)方法尤其是熒光光譜術(shù)來(lái)識(shí)別某些生物分子。然而，SERRS具有獨(dú)特的特征，即散射光線由明顯 的、分子特定的振動(dòng)帶組成，這使得可能區(qū)分多種分析物，并且例如，從 Volker Dechert 等的 "Near-Field Surface-enhanced Raman Imaging of Dye-Labelled DNA with 100-nm Resolution", Anal. Chem.， 70 (13), 2646-2650, 1998中，采用固體襯底金屬表面實(shí)現(xiàn)的通過(guò)表面增強(qiáng)共振拉曼光譜術(shù)的 DNA識(shí)別是己知的。
然而，由于擴(kuò)散過(guò)程，目標(biāo)分析物在表面上的吸收可以是非常緩慢的。 因此，提出了使用通過(guò)表面電荷還原(reducticm)來(lái)聚集的膠體的進(jìn)一步增強(qiáng) 的技術(shù)，其得到在空隙中的高電場(chǎng)區(qū)域。為了該目的，開(kāi)發(fā)了拉曼活性納 米粒子，其將SERRS染料與還原的(例如，銀)膠體結(jié)合，并且采用聚集膠 體(aggregated colloid)的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)顯示了非常有前途的結(jié)果(例如，見(jiàn)K. Faulds等的"A comparison of surface enhanced resonance Raman scattering from unaggregated and aggregated nano-particles" Anal. Chem.， 2004, 76， 592-59)。
當(dāng)以納米粒子使用SERRS時(shí)遇到一個(gè)問(wèn)題，即粒子聚集過(guò)程的控制。 采用聚集膠體的SERRS實(shí)驗(yàn)顯示信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間變化。信號(hào)強(qiáng)度取決于聚 集體的大小，并且已經(jīng)確定在大約1分鐘之后可以獲得最大信號(hào)強(qiáng)度(見(jiàn)D. Graham等的"Detection and identification of labelled DNA by SERRS" Biopolymers (Biospectroscopy) 2000， 57， 85-91)。
因此，本發(fā)明的目標(biāo)是提供用于使用聚集納米粒子進(jìn)行表面增強(qiáng)共振 拉曼光譜術(shù)(SERRS)的方法，其中，可以對(duì)納米粒子的聚集狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)視以 便增加表面增強(qiáng)共振拉曼光譜術(shù)(SERRS)的特異性、靈敏性和再現(xiàn)性。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明，提供了對(duì)包含目標(biāo)分子的樣本進(jìn)行表面增強(qiáng)共振拉曼光 譜術(shù)的方法，所述方法包括在納米粒子的表面上提供所述樣本，所述納米 粒子包括具有與所述目標(biāo)分子相似的等離振子(plasmon)吸收帶的聚集膠 體，所述方法還包括以具有至少兩種激勵(lì)波長(zhǎng)的放射線照射所述樣本，并 且獲得所得到的光譜，其中，所述第一種激勵(lì)波長(zhǎng)與所述等離振子吸收帶 相符合，并且所述第二種激勵(lì)波長(zhǎng)與由所述納米粒子的聚集所造成的吸收帶相符合。
有益地，所述方法包括以下步驟對(duì)在不同時(shí)間作為所述第二種^[勵(lì) 波長(zhǎng)的結(jié)果所獲得的光譜進(jìn)行分析，以便對(duì)所述膠體的隨時(shí)間的聚集狀態(tài) 進(jìn)行監(jiān)視。這使得能夠?qū)ξ招盘?hào)的特征進(jìn)行表征，并且對(duì)測(cè)量的再現(xiàn)性 進(jìn)行檢查。另外，可以使用在不同時(shí)間作為第二種激勵(lì)波長(zhǎng)的結(jié)果所獲得
的光譜來(lái)獲得在金屬表面上吸收的并且可能影響SERRS標(biāo)記(label)的樣 本中其它可能分子(污染物)的信息。
作為第二種激勵(lì)波長(zhǎng)的結(jié)果所獲得的的光譜可以包含表面增強(qiáng)拉曼光 譜術(shù)(SERS)信號(hào)強(qiáng)度譜或者所述膠體在"上的在各個(gè)不同時(shí)間的聚集狀態(tài) 的吸收信號(hào)。
在一個(gè)示例性實(shí)施例中，可以以所述等離振子吸收帶內(nèi)的多個(gè)波長(zhǎng)對(duì) 樣本進(jìn)行照射。在該情況下，可以在等離振子吸收帶內(nèi)對(duì)激勵(lì)波長(zhǎng)進(jìn)行掃 描，得到可以給出關(guān)于各種躍遷的特定信息的SERRS激勵(lì)光譜。
因此，本發(fā)明提供了提高表面增強(qiáng)共振拉曼光譜術(shù)的特異性、靈敏性 和再現(xiàn)性的方法。通過(guò)使用多波長(zhǎng)方法，可以對(duì)(實(shí)現(xiàn)信號(hào)增強(qiáng)所采用的) 膠體的聚集狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)視，有助于改進(jìn)可控的和可再現(xiàn)的測(cè)量方法?？梢?使用該監(jiān)視來(lái)檢查再現(xiàn)性。通過(guò)對(duì)這些光譜進(jìn)行分析，可以得到吸收信號(hào) 的特征。另外，通過(guò)采用多波長(zhǎng)激勵(lì)可以獲得獨(dú)立背景，這給出了關(guān)于樣 本中(除了 SERRS標(biāo)記之外的)其它可能成分的信息。在另一種方法中，在 經(jīng)過(guò)吸收帶對(duì)激勵(lì)波長(zhǎng)進(jìn)行掃描并且對(duì)相應(yīng)的SERRS光譜進(jìn)行測(cè)量和合成 的同時(shí)可以獲得更多的特定信息。
特別±也，這與例如在分子診斷領(lǐng)域的(生物)分子的超靈敏檢測(cè)相關(guān)。
參考這里所描述的實(shí)施例，本發(fā)明的這些和其它方面將變得顯而易見(jiàn) 并且對(duì)其進(jìn)行說(shuō)明。


現(xiàn)在，參考附圖，將通過(guò)舉例的方式對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行描述，在
附圖中
圖la用圖形說(shuō)明了由非聚集銀粒子形成的單吸收帶；
圖lb用圖形說(shuō)明了聚集銀膠體的取決于聚集狀態(tài)的吸收光譜，并且在紅外區(qū)出現(xiàn)了額外的吸收帶；
圖2用圖形說(shuō)明了聚集膠體[曲線A]和具有染料的聚集膠體[曲線B]的 吸收光譜(未按比例)以及激勵(lì)波長(zhǎng)，所示曲線在根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施例 的方法中使用；
圖2b是對(duì)根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施例的方法的主要步驟進(jìn)行說(shuō)明 的示意方框圖2c用圖形說(shuō)明了在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施例的方法的不同測(cè) 量時(shí)間上、不同聚集狀態(tài)[曲線A:聚集狀態(tài)1;曲線B:聚集狀態(tài)2]的SERS 光譜；
圖2d是對(duì)根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施例的方法的主要步驟進(jìn)行說(shuō)明 的示意方框圖，以及不同聚集狀態(tài)的所得到的吸收光譜[曲線A:聚集狀態(tài) l的吸收光譜；曲線B:聚集狀態(tài)2的吸收光譜]的圖形說(shuō)明；
圖3a用圖形說(shuō)明了在根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施例的方法中使用的具有 多波長(zhǎng)激勵(lì)的SERRS激勵(lì)光譜；以及
圖3b用圖形說(shuō)明了在具有不同波長(zhǎng)的激勵(lì)上對(duì)SERRS信號(hào)的檢測(cè)。
具體實(shí)施例方式
作為背景并且如上所述，當(dāng)以恰當(dāng)?shù)墓庠凑丈浠衔飼r(shí)，以與入射光(瑞 利散射)相同的能量(頻率)發(fā)射大多數(shù)反射光子。然而，少數(shù)光子以改變的 能量級(jí)別顯現(xiàn)，這導(dǎo)致已知為"拉曼散射"的現(xiàn)象。該非彈性散射由樣本 化合物內(nèi)各個(gè)光子與化學(xué)組成部分之間的振動(dòng)交互作用造成，在非彈性散 射中，光子相對(duì)于入射光獲得(反斯托克位移)和失去(斯托克位移)能量。由 于沒(méi)有兩種化合物顯示出相同的拉曼響應(yīng)，所以拉曼光譜術(shù)從歷史上就是 用于^f究化學(xué)結(jié)構(gòu)的有價(jià)值的分析工具。
雖然總是認(rèn)為拉曼散射是弱信號(hào)效應(yīng)，它的檢測(cè)需要專(zhuān)用和高度靈敏 的儀器，但是可以通過(guò)兩個(gè)特定修改顯著增強(qiáng)其信號(hào)檢測(cè)。首先，感興趣 化合物與不規(guī)則粗糙金屬(通常是金或銀)的密切關(guān)聯(lián)導(dǎo)致由金屬表面等離 振子(SERS)作為媒介所引起的信號(hào)幅度放大5-6個(gè)數(shù)量級(jí)。除了該表面增強(qiáng) 之外，如果激勵(lì)波長(zhǎng)與等離振子帶和相關(guān)聯(lián)的化合物共振，那么進(jìn)一步的 信號(hào)放大是可能的。該"共振"增強(qiáng)對(duì)拉曼強(qiáng)度貢獻(xiàn)了額外的3-4個(gè)數(shù)量級(jí)。該協(xié)同的增強(qiáng)(SERRS)將拉曼光譜術(shù)帶入熒光及以上的靈敏度范圍。
然而，不像具有大量光譜重疊和有限色調(diào)的熒光那樣，SERRS光譜具 有狹窄的峰值帶寬，這提供了良好的光譜分辨率，并且SERRS光譜對(duì)于任 何化合物都是唯一的。因此，大量唯一的標(biāo)記可能導(dǎo)致高復(fù)用性能。
使用聚集膠體可以進(jìn)一步增強(qiáng)SERRS，其中，例如，將SERRS染料添 加到還原的(例如，銀)膠體，并且可以通過(guò)例如精胺、LiCl、 NaCl這樣的聚 集劑來(lái)實(shí)現(xiàn)聚集。參考圖la，非聚集納米粒子的電子吸收能譜顯示了單一 帶(在該情況下，在大約400nm處)。另一方面，如圖lb中所示，如果粒子 正在聚集，出現(xiàn)第二個(gè)紅移吸收帶(在該情況下，在大約700nm處)，而在 400nm周?chē)膸p小。
因此，總之，通過(guò)進(jìn)入電子吸收帶內(nèi)的激勵(lì)可以獲得SERS信號(hào)。如果 在表面上吸收了染料，那么可以對(duì)染料的額外吸收帶和(聚集或未聚集)納米 粒子的吸收帶以及SERRS信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。在聚集粒子的情況下，可以獲得 與單粒子值相比6倍因子的信號(hào)強(qiáng)度的增大。
在這里提出了通過(guò)對(duì)樣本100的多波長(zhǎng)激勵(lì)將SERS和SERRS合并到 聚集納米粒子中(并且參考圖中的圖2a和2b)。
1、 與染料和納米粒子的吸收帶相符合的第一種激勵(lì)波長(zhǎng) ^ 。這導(dǎo)致 對(duì)具有較大增強(qiáng)的SERRS信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)(步驟12)。將使用該信號(hào)得到 (步驟IO)感興趣(生物)分子的指紋(fmgerprint)。
2、 與由納米粒子的聚集造成的紅移吸收帶相符合的第二種激勵(lì)波長(zhǎng) 入2 。這導(dǎo)致對(duì)SERS信號(hào)的檢測(cè)(步驟14)。
因此，圖2b是SERRS和SERS信號(hào)的多波長(zhǎng)激勵(lì)和檢測(cè)以及可以得 到的相應(yīng)信息的示意圖。所提供的樣本包括具有染料標(biāo)記的聚集膠體以及 感興趣的生物分子(SERRS標(biāo)記)。
如果(隨時(shí)間)對(duì)SERS信號(hào)進(jìn)行監(jiān)視，那么可以對(duì)聚集狀態(tài)進(jìn)行估計(jì)(步 驟16)。因?yàn)榧t移吸收帶的強(qiáng)度取決于聚集的程度，所以信號(hào)的強(qiáng)度取決于 聚集的程度。沒(méi)有聚集，就不能監(jiān)視吸收，并且因此不能監(jiān)視SERS信號(hào)。 如圖2c中所說(shuō)明的，在至少一個(gè)波長(zhǎng)上對(duì)信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行監(jiān)視。所得的^光 譜可以同時(shí)用作獨(dú)立的背景光譜，以便對(duì)在金屬表面吸收的樣本中其它可 能分子進(jìn)行觀測(cè)?？商鎿Q地，如在圖2d中所說(shuō)明的，可以及時(shí)對(duì)由聚集納米粒子引起的 (在透射測(cè)量中的)吸收信號(hào)進(jìn)行跟蹤，以便對(duì)聚集狀態(tài)進(jìn)行估計(jì)。然而，使 用SERS分析，光譜還可以給出關(guān)于在表面上所吸收的粒子類(lèi)型的線索。再 次，所得的^光譜可以同時(shí)用作獨(dú)立背景光譜，以便獲得關(guān)于在金屬表面 吸收的樣本中其它可能分子的信息。
這樣， 一般，多波長(zhǎng)激勵(lì)方法的另一個(gè)方面是，可以使用通過(guò)激勵(lì)、 所獲得的SERS信號(hào)來(lái)生成獨(dú)立背景信號(hào)，可以使用該獨(dú)立背景信號(hào)觀測(cè)在 金屬表面吸收的樣本中其它可能分子。這增加了方法的精確性。
在吸收帶中對(duì)激勵(lì)波長(zhǎng)進(jìn)行掃描是多波長(zhǎng)激勵(lì)方法的另一個(gè)方面。這 導(dǎo)致可以給出關(guān)于各種躍遷的特定信息的SERRS激勵(lì)光譜。SERRS光譜將 隨著對(duì)波長(zhǎng)的掃描而改變。因?yàn)楣舱裨鰪?qiáng)的特征歸結(jié)為在不同激勵(lì)波長(zhǎng)上 的不同的分子振動(dòng)，所以這與單一波長(zhǎng)的激勵(lì)相比提高了對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行 檢測(cè)的光譜特異性。這可應(yīng)用于具有固體襯底金屬表面的實(shí)驗(yàn)中以及應(yīng)用 于納米粒子膠體聚集中，并且在圖3a和3b中對(duì)其進(jìn)行了說(shuō)明。代替對(duì)光 譜進(jìn)行測(cè)量，可以在特別選擇的波長(zhǎng)上對(duì)信息進(jìn)行測(cè)量。
可以將本申請(qǐng)應(yīng)用在諸如通過(guò)SERRS的DNA細(xì)菌檢測(cè)的分子診斷中。
本申請(qǐng)還可以應(yīng)用于復(fù)雜媒體的分析物檢測(cè)、或者復(fù)雜媒體的分析物濃度 監(jiān)視諸如體液內(nèi)的藥物監(jiān)視、或者化學(xué)分析過(guò)程。
應(yīng)該注意，上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了說(shuō)明而不是限制，并且本領(lǐng)域 的技術(shù)人員將能夠設(shè)計(jì)許多可替換的實(shí)施例，而不脫離如通過(guò)所附權(quán)利要 求所定義的本發(fā)明的范圍。在權(quán)利要求中，不應(yīng)該將圓括號(hào)中的任何參考 標(biāo)號(hào)理解為限制權(quán)利要求。單詞"包含"和"包括"等不是要在總體上排 除在任何權(quán)利要求或者說(shuō)明書(shū)中所列的那些組成部分或步驟之外出現(xiàn)的組 成部分或步驟。組成部分的單獨(dú)一個(gè)參考不是要排除這些組成部分的多個(gè) 參考，反之亦然?？梢酝ㄟ^(guò)包含幾個(gè)離散元件的硬件手段以及通過(guò)合適的 可編程計(jì)算機(jī)的手段實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。在列舉若干模塊的設(shè)備權(quán)利要求中，可 以通過(guò)硬件的一個(gè)以及相同項(xiàng)具體化這些模塊中的某些。在互相不同的從 屬權(quán)利要求中敘述某些手段的事實(shí)不表明不可以使用這些手段的組合產(chǎn)生 良好效果。
權(quán)利要求
1、一種對(duì)包含目標(biāo)分子的樣本(100)進(jìn)行表面增強(qiáng)共振拉曼光譜術(shù)的方法，所述方法包括在納米粒子的表面上提供所述樣本(100)，所述納米粒子包括具有與所述目標(biāo)分子相似的等離振子吸收帶的聚集膠體，所述方法還包括以具有至少兩種激勵(lì)波長(zhǎng)的放射線照射所述樣本，并且獲得所得到的光譜，其中，所述第一種激勵(lì)波長(zhǎng)(λ1)與所述等離振子吸收帶相符合，并且所述第二種激勵(lì)波長(zhǎng)(λ2)與由所述納米粒子的聚集所造成的吸收帶相符合。
2、 如權(quán)利要求l所述的方法，還包括步驟對(duì)在不同時(shí)間作為所述第 二種波長(zhǎng)( 12)的結(jié)果所獲得的光譜進(jìn)行分析(16,24)，以便對(duì)所述膠體的隨時(shí) 間的聚集狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)視。
3、 如權(quán)利要求l所述的方法，其中，使用在不同時(shí)間作為所述第二種激勵(lì)波長(zhǎng)( 12)的結(jié)果所獲得的光譜來(lái)生成獨(dú)立的背景信號(hào)。
4、 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，從作為所述第一種激勵(lì)波長(zhǎng)(^) 的結(jié)果所獲得的光譜中得到(10)所述分子的指紋。
5、 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，作為所述第二種激勵(lì)波長(zhǎng)(、)的 結(jié)果所獲得的光譜包括表面增強(qiáng)拉曼光譜術(shù)(SERS)信號(hào)強(qiáng)度光譜或所述膠 體的在各個(gè)不同時(shí)間上的聚集狀態(tài)的吸收信號(hào)。
6、 如權(quán)利要求l所述的方法，其中，以所述等離振子吸收帶內(nèi)的多個(gè) 波長(zhǎng)(、，入2， H...)照射所述樣本(IOO)。
全文摘要
對(duì)在聚集膠體納米粒子上提供的樣本(100)進(jìn)行表面增強(qiáng)共振拉曼光譜(SERRS)的方法，所述聚集膠體納米粒子具有與目標(biāo)分子相似的等離振子吸收帶。以與該等離振子的吸收帶相符合的第一種波長(zhǎng)(λ₁)照射該樣本，以便獲得(12)用于得到(10)目標(biāo)分子的指紋的SERRS光譜，并且以與由所述納米粒子的聚集所造成的吸收帶相符合的第二種波長(zhǎng)(λ₂)照射該樣本，以便獲得(14)用于對(duì)所述聚集進(jìn)行監(jiān)視(16)的SERS光譜。
文檔編號(hào)G01J3/44GK101421606SQ200780013296
公開(kāi)日2009年4月29日 申請(qǐng)日期2007年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月13日
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