一種犬羊膜的制備及保存方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及組織工程學材料技術領域，特別設及一種犬羊膜的制備及保存方法。
【背景技術】
[0002] 羊膜是胎盤的最內層，光滑且具有一定的彈性，厚度約為0.02至0.5mm。羊膜可分 為五層:分別為單層柱狀上皮細胞層，致密的基底膜層，富含膠原的非細胞層，W及富含I、 III、IV、V和VII型膠原蛋白、層粘連蛋白的結締組織層。結締組織層分為=個部分:致密的 網(wǎng)狀纖維組成的無細胞層；網(wǎng)狀零星分布成纖維細胞且疏松的成纖維細胞層；W及海綿層。 其中包括絨毛膜W及復雜的纖維組成并被粘液包裹。一些動物實驗及臨床觀察顯示，人羊 膜的基底膜可W促進結膜干細胞分化為結膜上皮細胞，促進結膜上皮細胞向角膜上皮細胞 轉化，促進角膜緣干細胞增殖并提供其有利的生長環(huán)境，促進角膜上皮細胞移行，抑制結膜 下纖維組織增生，抑制新生血管形成，抗炎抗菌等功能。其基地膜可W阻止上皮細胞調亡、 促進上皮細胞的增殖和分化。新鮮的羊膜含有一些生長因子，有利于上皮細胞的分化、移行 和增強上皮細胞的粘附性的作用。羊膜可W阻止白細胞浸潤，抑制多種蛋白酶如膜蛋白、纖 維蛋白酶、組織蛋白酶等，通過抑制相應的酶減輕炎癥反應、縮短炎癥持續(xù)時間及新生血管 生成。
[0003] 羊膜脫細胞基質為理想的組織學工程學材料，目前尚無使用犬羊膜進行運一材料 制備的研究。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明要解決的是現(xiàn)有技術不能制備效果好的犬羊膜的技術問題。
[0005] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種犬羊膜的制備方法，將無菌獲得的犬羊膜 置于無菌生理鹽水溶液中；
[0006] 使用大量的無菌0.9%氯化鋼的生理鹽水溶液進行反復沖洗，將羊膜上多余的血 跡、粘液及絨毛膜組織碎片沖洗掉；
[0007] 使用滅菌的主要成分為化2HP04、KH2P04、化a和KCl的憐酸鹽緩沖溶液PBS反復 沖洗，將可見的血管、血凝塊清洗掉，清洗后的羊膜應呈顏色均一，柔軟的半透明膜狀。
[000引還包括W下步驟，將洗好的羊膜置于1%聚乙二醇辛基苯基酸TritonX-IOO溶液中 密閉，置于37°C恒溫搖床中震蕩24h;
[0009] 用主要成分為化甜P04、KH2P04、化a和KCl的憐酸鹽緩沖溶液PBS充分漂洗干凈， 加入0.25 %膜蛋白酶0.02 %乙二胺四乙酸邸TA，放入恒溫培養(yǎng)箱37°C消化4h;
[0010] 加入等量的各種氨基酸和葡萄糖DMEM培養(yǎng)基停止消化，使用主要成分為化2HP04、 K肥P04、NaCl和KCl的憐酸鹽緩沖溶液PBS充分漂洗干凈；
[0011] 在倒置顯微鏡下觀察細胞殘留情況，觀察無細胞殘留即可分為約2平方厘米小塊 保存。
[001^ 還包括W下步驟，將各種氨基酸和葡萄糖DMEM培養(yǎng)基同純甘油1:1進行混合，使用 20微米孔徑濾膜進行過濾得到無菌的保存液約4毫升一份分裝至無菌的5ml離屯、管中，將所 述約2平方厘米小塊的犬羊膜分別放入有保存液的離屯、管中，使保存液完全浸潤犬羊膜，密 封后放入-80°C冰箱保存。
[0013] 本發(fā)明還包括一種犬羊膜的保存方法，將各種氨基酸和葡萄糖DMEM培養(yǎng)基同純甘 油1:1進行混合，使用20微米孔徑濾膜進行過濾得到無菌的保存液約4毫升一份分裝至無菌 的5ml離屯、管中，將按照上述權利要求1或2制備的犬羊膜分別放入有保存液的離屯、管中，使 保存液完全浸潤犬羊膜，密封后放入-80°C冰箱保存。
[0014] 通過W上技術方案可知，本發(fā)明提供一種犬羊膜的制備及保存方法，本發(fā)明的優(yōu) 點在于制得的犬羊膜生物相容性好，是理想組織工程學材料。保存的犬羊膜有效可用時間 長，避免了使用時沒有有效可用材料的尷尬。
【具體實施方式】
[0015] 下面將結合實施例對本發(fā)明的技術方案進行更詳細的說明。
[0016] 需要說明的是，如果不沖突，本發(fā)明實施例W及實施例中的各個特征可W相互結 合，均在本發(fā)明的保護范圍之內。
[0017] 實施例一，一種犬羊膜的制備方法，將無菌獲得的犬羊膜置于無菌生理鹽水溶液 中；
[0018] 使用大量的無菌0.9%氯化鋼的生理鹽水溶液進行反復沖洗，將羊膜上多余的血 跡、粘液及絨毛膜組織碎片沖洗掉；
[0019] 使用滅菌的主要成分為化2HP04、K肥P04、NaQ和KCl的憐酸鹽緩沖溶液PBS反復沖 洗，將可見的血管、血凝塊清洗掉，清洗后的羊膜應呈顏色均一，柔軟的半透明膜狀。
[0020] 還包括W下步驟，將洗好的.羊膜置于1%聚乙二醇辛基苯基酸化itonX-100溶液 中密閉，置于37°C恒溫搖床中震蕩24h;
[0021] 用主要成分為Na2HP04、K肥P04、化Cl和KCl的憐酸鹽緩沖PBS溶液憐酸鹽緩沖溶液 PBS充分漂洗干凈，加入0.25 %膜蛋白酶0.02 %乙二胺四乙酸邸TA，放入恒溫培養(yǎng)箱37°C消 化4h;
[0022] 加入等量的各種氨基酸和葡萄糖DMEM培養(yǎng)基停止消化，使用主要成分為化2HP04、 K肥P04、NaCl和KCl的憐酸鹽緩沖溶液PBS充分漂洗干凈；
[0023] 在倒置顯微鏡下觀察細胞殘留情況，觀察無細胞殘留即可分為約2平方厘米小塊 保存。
[0024] 還包括W下步驟，將各種氨基酸和葡萄糖DMEM培養(yǎng)基同純甘油1:1進行混合，使用 20微米孔徑濾膜進行過濾得到無菌的保存液約4毫升一份分裝至無菌的5ml離屯、管中，將所 述約2平方厘米小塊的犬羊膜分別放入有保存液的離屯、管中，使保存液完全浸潤犬羊膜，密 封后放入-80°C冰箱保存。
[0025] 犬羊膜的制備及保存的材料及儀器
[00%] 材料：無菌犬羊膜、微米濾膜、試劑、Du化ecco's Modified Eagle Medium basic (DMEM basiC)培養(yǎng)液、無菌培養(yǎng)皿、0.25 % 膜酶-EDTA、IYi tonX-100、化〇3地ate Buf f ered Saline (PBS)、純甘油、0.25 %戊二醒溶液其中，縮寫的含義為：Phosphate Buffered Saline(PBS):憐酸鹽緩沖溶液、TritonX-100:聚乙二醇辛基苯基酸、EDTA:乙二胺四乙酸、 DMEM:各種氨基酸和葡萄糖培養(yǎng)基。
[0027]各種氨基酸和葡萄糖培養(yǎng)基DMEM成分：
[00巧]儀器:倒置顯微鏡、超凈工作臺、恒溫搖床、C02培養(yǎng)箱、-80°C冰箱。
[0030]羊膜是包裹胎兒的一層半透明的膜狀物，獲得時可W將透明度好的組織盡量保 留，但其于胎盤連接處則不必過多的保留，獲得的羊膜應盡可能的透明部分，運樣在清洗的 過程中也會比較容易并獲得血管組織較少的羊膜。取材時選取血管少的組織可W大大降低 純性分離時的難度，并同時減少對羊膜本身的破壞。分離時也應小屯、，盡量分離干凈，得到 單層的羊膜組織，運對之后制備過程中運種試劑的充分接觸也有很大的幫助。否則有可能 出現(xiàn)脫細胞不完整及過度處理造成的羊膜損傷。
[0031] 本發(fā)明選取了對基底膜傷害較少，但去細胞效果略差的非離子型去污劑化itonx-100并結合使用膜蛋白酶消化來達到比較完全的脫細胞作用。同時對機械性能及細胞微結 構破壞最少。
[0032] 掃描電鏡的結果也支持了運一方案的可行性，掃描電鏡下可見表面有一層基底 膜，在其下會出現(xiàn)交織成網(wǎng)狀的膠原纖維，說明制作過程良好的保存了羊膜原有的物理性 狀。對于只含有一層上皮細胞及基質中少量成纖維母細胞的犬羊膜來說，使用化itonX-100 處理后，再結合膜蛋白酶處理會達到比較理想的去細胞效果，而對其自身的基底膜、各種生 物因子及生物相容性影響降至到最小，掃描電鏡的結果也很好的說明了運一點。
[0033] 實施例二，一種犬羊膜的保存方法，本發(fā)明還包括一種犬羊膜的保存方法，將各種 氨基酸和葡萄糖DMEM培養(yǎng)基同純甘油1:1進行混合，使用20微米孔徑濾膜進行過濾得到無 菌的保存液約4毫升一份分裝至無菌的5ml離屯、管中，將按照上述權利要求1或2制備的犬羊 膜分別放入有保存液的離屯、管中，使保存液完全浸潤犬羊膜，密封后放入-80°C冰箱保存。
[0034] 保存后犬羊膜的質量檢驗
[0035] 分別將剛制得的