基于3d細(xì)胞打印技術(shù)的損傷組織修復(fù)體及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于3D細(xì)胞打印技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于3D細(xì)胞打印技術(shù)的損傷組織修復(fù)體及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在傳統(tǒng)的組織工程中，對(duì)受損器官的修復(fù)主要是將該受損組織細(xì)胞在體外培養(yǎng)擴(kuò)增后，附著在預(yù)先設(shè)計(jì)好的生物支架材料上，構(gòu)成“細(xì)胞+支架”的復(fù)合體，再植入機(jī)體中相應(yīng)的病損部位。隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖，支架材料逐漸降解，最后形成具有生理功能和結(jié)構(gòu)的組織或器官，從而達(dá)到組織器官修復(fù)或再生的目的。而其中，“細(xì)胞+支架”的復(fù)合體由于需要是具有自然組織特性(細(xì)胞微環(huán)境、三維組織、細(xì)胞間相互作用)的活性組織器官，所以對(duì)細(xì)胞本身和支架材料類型要求比較嚴(yán)。比較能夠用于人體的組織器官修復(fù)的支架，一般都是采用水凝膠固化制備，定植機(jī)體內(nèi)之后能被自然降解，且排異較少，成為最適于的支架基材。同時(shí)，為了最大化地與修復(fù)組織器官的形態(tài)吻合，多采用3D細(xì)胞打印技術(shù)，將細(xì)胞按照與損傷組織相吻合的特定形狀打印在支架上之后，然后即得到復(fù)合體。
[0003]但是，采用通常制備的“細(xì)胞+支架”的復(fù)合體，由于技術(shù)和材質(zhì)的限制該種“復(fù)合體”所形成的組織或器官內(nèi)無血管，定植以后氧氣和養(yǎng)料的供應(yīng)不足，容易引起組織或器官的壞死。而且，采用損傷處組織細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增后構(gòu)建的復(fù)合體，形成的結(jié)構(gòu)不具有靶向修復(fù)受損組織的功能，也不具備定向分化的能力，使得定植之后初期擴(kuò)增是無向性的擴(kuò)增；并且這些細(xì)胞自身不具備免疫調(diào)節(jié)能力，不能釋放相應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)因子，很容易被外源抗原性物質(zhì)殺死。使得復(fù)合體定植之后，修復(fù)的效果達(dá)不到應(yīng)有的預(yù)期。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明實(shí)施的目的在于克服的缺陷，提供一種形態(tài)能直接與損傷組織吻合、且靶向修復(fù)功能更佳的基于3D細(xì)胞打印技術(shù)的損傷組織修復(fù)體。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案如下:
[0006]—種基于3D細(xì)胞打印技術(shù)的損傷組織修復(fù)體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:
[0007]獲取干細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)；
[0008]將所述細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行固化，制備細(xì)胞支架；
[0009]通過3D細(xì)胞打印將所述干細(xì)胞打印至所述細(xì)胞支架上。
[0010]采用本發(fā)明的上述基于3D細(xì)胞打印技術(shù)的損傷組織修復(fù)體的制備方法，以細(xì)胞外基質(zhì)作為基材制備細(xì)胞支架，然后通過3D打印的方式將干細(xì)胞按照所需修復(fù)的損傷組織的形態(tài)打印至細(xì)胞支架上形成修復(fù)體；方法過程簡(jiǎn)單，采用將干細(xì)胞和支架按照所需的形態(tài)一次打印即可，制備得到的修復(fù)體自身的形態(tài)能直接與損傷組織吻合；且更適于細(xì)胞之間營(yíng)養(yǎng)及氧氣的傳遞以及更好地靶向修復(fù)功能。
[0011]在本發(fā)明上述制備方法的基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步還提出一種采用上述方法制備得到的基于3D細(xì)胞打印技術(shù)的損傷組織修復(fù)體。本發(fā)明制備得到的損傷組織修復(fù)體，定植于機(jī)體內(nèi)之后，細(xì)胞外基質(zhì)制備的支架能較好地與機(jī)體內(nèi)組織融合，有利于傳遞了細(xì)胞與環(huán)境之間、細(xì)胞之間的相互作用、細(xì)胞生長(zhǎng)因子之間的生物信號(hào)、化學(xué)信號(hào)和物理信號(hào)，便于細(xì)胞之間營(yíng)養(yǎng)及氧氣的傳遞等問題；而相應(yīng)間充質(zhì)干細(xì)胞自身的分化、免疫、以及受細(xì)胞外基質(zhì)中細(xì)胞表面細(xì)胞粘附分子和粘合素調(diào)節(jié)的特性，能具有更好地靶向修復(fù)功能。
【具體實(shí)施方式】
[0012]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0013]本發(fā)明實(shí)例提出一種基于3D細(xì)胞打印技術(shù)的損傷組織修復(fù)體的制備方法，包括如下步驟:
[0014]S10，獲取干細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)；
[0015]S20，將細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行固化，制備細(xì)胞支架；
[0016]S30，通過3D細(xì)胞打印技術(shù)將干細(xì)胞打印至細(xì)胞支架上。
[0017]本發(fā)明的上述步驟中，以3D細(xì)胞打印技術(shù)為基礎(chǔ)進(jìn)行“細(xì)胞+支架”復(fù)合體的制備；其中，細(xì)胞部分采用干細(xì)胞，尤佳的是采用來源于臍血的間充質(zhì)干細(xì)胞，而支架部分采用細(xì)胞外基質(zhì)材質(zhì)制備。經(jīng)過對(duì)普通復(fù)合體定植于機(jī)體之后支架降解和細(xì)胞生長(zhǎng)過程的跟蹤，細(xì)胞的生長(zhǎng)情況與支架的降解程度直接相關(guān)；定植之后，細(xì)胞本身是吸附在支架的孔隙內(nèi)的，不具有與其他正常組織細(xì)胞所處于的代謝環(huán)境，逐漸會(huì)偏向死亡。本發(fā)明經(jīng)過對(duì)支架進(jìn)行考量和研究之后，采用細(xì)胞外基質(zhì)作為基材制備細(xì)胞支架。原因在于，細(xì)胞外基質(zhì)主要由纖維結(jié)構(gòu)蛋白、多糖(主要含有透明質(zhì)酸)、蛋白多糖三部分組成；而纖維結(jié)構(gòu)蛋白中含有膠原蛋白、彈性蛋白、層粘連蛋白和纖連蛋白，其中膠原蛋白為最重要的成分。這些蛋白為大分子，能夠形成堅(jiān)韌的三股螺旋結(jié)構(gòu)纖維。蛋白多糖中主要含有糖胺多糖的硫酸軟骨素和硫酸肝素糖蛋白，也有透明質(zhì)酸，此外細(xì)胞外間質(zhì)還吸收了多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子和蛋白酶。
[0018]細(xì)胞外間質(zhì)的上述三種主要成分固化后，具有良好纖維空隙，可以適于作為細(xì)胞支架；并且制成支架之后，細(xì)胞外基質(zhì)本身源自于細(xì)胞，所以作為細(xì)胞支架為干細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)搭建的細(xì)胞微環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境接近，有利于傳遞了細(xì)胞與環(huán)境之間、細(xì)胞之間的相互作用、細(xì)胞生長(zhǎng)因子之間的生物信號(hào)、化學(xué)信號(hào)和物理信號(hào)，便于細(xì)胞之間營(yíng)養(yǎng)及氧氣的傳遞等問題。而且細(xì)胞外間質(zhì)自身就吸收了很多的細(xì)胞生長(zhǎng)因子和蛋白酶，當(dāng)生理?xiàng)l件變化時(shí)，激活蛋白酶而釋放這些細(xì)胞因子，而無需從頭合成這些因子，從而迅速激活細(xì)胞功能，這一功能加速定植于機(jī)體后細(xì)胞的定向增殖和分化。所以采用細(xì)胞外基質(zhì)制成的細(xì)胞支架，相比現(xiàn)有的水凝膠、膠原蛋白、聚合物基質(zhì)的支架，其可以更加適于在體內(nèi)維持細(xì)胞生存的微環(huán)境、持續(xù)為細(xì)胞提供支持和固定、調(diào)節(jié)細(xì)胞間的溝通、調(diào)節(jié)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)行為，效果和品質(zhì)更好一些。
[0019]而同時(shí)，在細(xì)胞外基質(zhì)支架的基礎(chǔ)上，損傷組織修復(fù)的主體細(xì)胞，本發(fā)明實(shí)施例采用臍血間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行，臍血間充質(zhì)干細(xì)胞取自于臍帶中的華通氏膠，具有更強(qiáng)的擴(kuò)增能力及低免疫原性，其成集落生長(zhǎng)潛能及成骨時(shí)間早于骨髓等其他來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。在試驗(yàn)中進(jìn)一步還發(fā)現(xiàn)，臍血間充質(zhì)干細(xì)胞本身還受細(xì)胞外基質(zhì)所具有的細(xì)胞表面細(xì)胞粘附分子和粘合素的調(diào)節(jié)，粘合素可以傳導(dǎo)機(jī)械刺激從細(xì)胞外間質(zhì)到細(xì)胞骨架。通過在這種調(diào)解下，定植之后細(xì)胞受制于機(jī)體內(nèi)的特定表達(dá)和擴(kuò)增效果能大大提升。更主要地是，本發(fā)明中采用該臍血間充質(zhì)干細(xì)胞，是基于其早期臍帶干細(xì)胞的特質(zhì)，能夠轉(zhuǎn)化成具有上皮表型細(xì)胞；在損傷組織中，損傷組織的損傷部位會(huì)通過未愈合傷口釋放的炎性細(xì)胞因子，這些炎性的細(xì)胞因子能引導(dǎo)臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的歸巢，使其靶向進(jìn)入損傷部位，通過自分泌和旁分泌作用產(chǎn)生的細(xì)胞因子、參與局部免疫調(diào)節(jié)，介導(dǎo)造血干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞的聯(lián)合動(dòng)員促進(jìn)傷口部位的內(nèi)膜再生，這個(gè)細(xì)胞本身的能力所導(dǎo)致的這一修復(fù)的能力和效果，比通常將取自損傷部位的細(xì)胞體外增殖后再定植的細(xì)胞的能力要強(qiáng)許多。
[0020]因此，在上述手段的立意下步驟SlO進(jìn)行臍血間充質(zhì)干細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的獲取，其中臍血間充質(zhì)干細(xì)胞可以自行從新鮮的臍帶血中制備；而細(xì)胞外基質(zhì)可以將正常的組織細(xì)胞進(jìn)行大量培養(yǎng)之后，依次經(jīng)過NaCl的高滲透壓處理(一般就是用NaCl飽和溶液浸泡)，純水的低滲透壓處理，用胰蛋白酶破壞細(xì)胞成分、細(xì)胞連接、疏松膠原，最后再用TritonX-1OO (聚乙二醇辛基苯基醚-100)溶液處理之后，便能獲得。其中，根據(jù)細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白成分和細(xì)胞因子、pH的特點(diǎn)，TritonX-1OO溶液最好采用含有體積分?jǐn)?shù)I?5%TritonX-1OO 的 4.5 ?5.5mmol/L pH 8.0 的 Tris-HCl 緩沖液。
[0021]在上述“細(xì)胞+支架”復(fù)合體的制備目的下，步驟S20中將細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行固化，制備細(xì)胞支架；其中，上述步驟SlO中所自行制備和獲取的細(xì)胞外基質(zhì)本身液相形態(tài)，直接將其置于模型中，然后負(fù)壓抽干即可。當(dāng)然，進(jìn)一步為了提升支架的品質(zhì)，本發(fā)明在負(fù)壓抽干的過程中，可以添加一定的0.25%?0.5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的海藻酸鈉；采用該海藻酸鈉的目的在于，海藻酸鈉本身是一種多糖，是褐色海藻中的海藻酸鹽提取物，具有形成凝膠和成膜的能力；雖然凝膠的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如瓊脂等、但是這一方面能起到相應(yīng)的促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的纖維蛋白等凝結(jié)固化；同時(shí)海藻酸鈉在添加之后有致孔的作用，可以相應(yīng)提升負(fù)壓抽干中細(xì)胞外基質(zhì)固化中孔隙小且數(shù)量低的缺陷。
[0022]最后步驟S30將臍血間充質(zhì)干細(xì)胞采用3D打印技術(shù)打印至步驟S20制備的細(xì)胞支架上，形成損傷組織修復(fù)體。而其中損傷組織的修復(fù)體的形狀和細(xì)胞打印的形態(tài)，這一點(diǎn)上需要與所要修復(fù)的組織的損傷形態(tài)進(jìn)行對(duì)應(yīng)。具體，比如:如果采用上述制備的損傷組織修復(fù)體是特異性針對(duì)子宮內(nèi)膜損傷，那么支架的形態(tài)就應(yīng)當(dāng)按照子宮內(nèi)