貝美前列腺素作為trpa1通道激動(dòng)劑在制備藥品中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體地指貝美前列腺素作為TRPAl通道激動(dòng)劑在制備藥品 中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 貝美前列腺素（17-Phenyl-tri-norprostaglandin F2a-ethyl amide， bimatoprost)分子式：C25H37N04,分子量：415. 57,分子結(jié)構(gòu)：
[0003]
[0004] 貝美前列腺素是合成的前列酰胺F(2a )衍生物，通過增加小粱網(wǎng)通道和葡萄膜 鞏膜通道的房水流出而降低眼內(nèi)壓（IOP)，被認(rèn)為是目前降眼壓作用最強(qiáng)的局部抗青光眼 藥物。貝美前列腺素主要用于開角型青光眼（POAG)或高眼壓癥（OHT)的患者，全身不良反 應(yīng)較少。研究表明貝美前列腺素既不能激活FP受體也不能激活EP受體，其降眼壓機(jī)制可 能有異于其他前列腺素類降眼壓藥物。迄今為止，貝美前列腺素確切的作用通道尚未見報(bào) 道。
[0005] TRPAl的基因最初是1999年從肺纖維母細(xì)胞中克隆的，其最初被命名為ANKTMl， 包括N-氨基末端的多錨蛋白重復(fù)序列。人類TRPAl基因包括27個(gè)外顯子和在8ql3號染 色體橫跨55701個(gè)堿基。TRPAl基因編碼一個(gè)約1，100個(gè)氨基酸蛋白分子，約120-130kDa， TRPAl可能是由TRPAl蛋白的同源四聚體組成一個(gè)功能體，TRPAl拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與其他TRP蛋白 是相似的，由6個(gè)跨膜片段（S1-6)組成，離子通透區(qū)域定位S5-S6之間，第一個(gè)胞外袢環(huán) 在S1-S2之間包含2個(gè)天冬氨酸糖基化區(qū)域。N-末端包含由33個(gè)氨基酸組成的多達(dá)18個(gè) 錨蛋白重復(fù)序列，其可能是蛋白與蛋白相互作用，如通道與質(zhì)膜的交互作用。TRPAl的ARDs 區(qū)域刪除后顯示通道插入質(zhì)膜受到影響。在一個(gè)17個(gè)錨蛋白重復(fù)序列的區(qū)，當(dāng)鈣離子連接 到ARD區(qū)，改變了整個(gè)N-末端的結(jié)構(gòu)，增加了其硬度，減少了空間距離。在TRPAl的跨膜區(qū) 域，N855,是緊靠 TM5區(qū)域的重要?dú)堄?，與家族性分散性疼痛綜合征有關(guān)，在S4-S5之間形成 一個(gè)牢固鏈聯(lián)結(jié)到螺旋區(qū)和S1，因此在N-末端和通道口之間形成一個(gè)直接的傳力鏈。EF手 型區(qū)域的重要性還有待研究，因?yàn)檫@區(qū)域的點(diǎn)突變僅僅適量影響鈣離子依賴活性的機(jī)制， 然而缺少或刪除卻使通道與質(zhì)膜的交互作用削弱。其他可能的鈣離子螯合區(qū)域是由一群殘 留在TRPAlC-末端的酸組成，人類TRPAl有4個(gè)保守區(qū)域，Glul077, Aspl080, Aspl081and Aspl082,對鈣離子依賴的和電壓依賴的電壓和或激動(dòng)劑誘導(dǎo)反應(yīng)的失活有重要關(guān)系，選擇 性保留20個(gè)氨基酸的C-末端截?cái)?，減慢了鈣離子依賴的失活，沒有影響其他功能參數(shù)。顯 現(xiàn)出與大的鈣導(dǎo)鉀通道的鈣連接部的部分同源性的核酸群，可能代表一種長期尋找的鈣離 子敏感區(qū)域。它們決定了 TRPAl藥物靶點(diǎn)的多樣性。
[0006] TRPAl廣泛表達(dá)在背根神經(jīng)節(jié)（DRG)、三叉神經(jīng)節(jié)（TG)、鼻神經(jīng)節(jié)（NG)這些感覺神 經(jīng)上，以及內(nèi)耳的corti器（與聽覺有關(guān)）。隨著人們認(rèn)識的深入，發(fā)現(xiàn)TRPAl還廣泛表達(dá) 在許多組織和器官的非神經(jīng)細(xì)胞，包括皮膚、心臟、胃腸、肺、骨骼肌、胰腺以及陰道細(xì)胞，參 與完成各種功能，調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)穩(wěn)。
[0007] TRPAl是一種熱議的機(jī)械敏感性離子通道（MS通道），可以直接被機(jī)械刺激激活 或者間接調(diào)節(jié)機(jī)械信號強(qiáng)度；現(xiàn)有很多實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持TRPAl的機(jī)械性感受傳導(dǎo)作用。分布 在皮膚感覺傳入纖維末端的TRPAl對有害化學(xué)和機(jī)械刺激可作出反應(yīng)。TRPAl基因突變可 導(dǎo)致鼻尖接觸應(yīng)答等機(jī)械敏感性行為缺陷。TRPAl大量表達(dá)于DRGs，快速局部的機(jī)械力 刺激DRG神經(jīng)元能誘發(fā)機(jī)械敏感性電流。TRPAl與胃腸道的炎性疼痛有關(guān)，結(jié)狀神經(jīng)節(jié)和 DRGs的神經(jīng)元支配胃腸道3個(gè)不同區(qū)域，所有都表達(dá)TRPAl，在正常和炎癥組織都有增加機(jī) 械敏感性和調(diào)節(jié)內(nèi)臟傷害感受的功能。還有研究發(fā)現(xiàn)TRPAl的激動(dòng)劑可以增敏膀胱的機(jī)械 敏感性。研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚的基因組有兩個(gè)TRPA基因，分別是TRPAla和TRPAlb，用嗎啉代 (能降低斑馬魚胚胎中TRPAla的表達(dá)）處理斑馬魚后發(fā)現(xiàn)，內(nèi)耳毛細(xì)胞傳導(dǎo)電流降低。用 RNAi (RNA interference)干擾斑馬魚TRPAl的表達(dá)也可以降低毛細(xì)胞的傳導(dǎo)電流。這些證 據(jù)表明TRPAl可能作為聽覺感受器發(fā)揮作用。
[0008] 環(huán)戊稀酮類前列腺素 （Cyclopentenone prostaglandins，PGs) : 15-d_PGJ2、PGA2 和PGAl，擁有高活性的α、β -不飽和羰基，能直接激活TRPAl ;肉桂醛（肉桂）、異硫氰酸酯 [芥子油（Mustard oil，MO 或者 Allyl isothiocyanate，AITC)、辣根]、和蒜素（allicin) 以及Δ9四氫大麻酸（Δ (9) -tetrahydracannabinol，A9THC，大麻）是TRPAl的激動(dòng)劑； 靜脈麻醉藥異丙酸（Propofol)能激活TRPAl ;對羥基苯甲酸甲酯（Methyl paraben)通常 作為抗菌劑添加到醫(yī)藥、化妝品和食品，也是TRPAl通道的非親電子激動(dòng)劑。唇形科家族的 紫蘇子活性化合物紫蘇醛和紫蘇酮都是TRPAl的激動(dòng)劑，紫蘇子葉是常用于治療胃功能障 礙的中藥。丁香酚是一種苯烯，用于香料、調(diào)味料，醫(yī)學(xué)上可作為防腐劑和局部麻醉劑。類 似的還有生姜（鮮姜）中的辛辣化合物姜辣素，丁香酚和姜辣素都能有效地激活TRPAl通 道。TRPAl的激動(dòng)劑中PGA2和異丙酚已被證實(shí)具有降眼壓作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供了一種貝美前列腺素作為TRPAl通道激動(dòng)劑在制備藥品中的應(yīng)用。
[0010] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種貝美前列腺素作為TRPAl通道激動(dòng)劑在制 備藥品中的應(yīng)用，貝美前列腺素通過作用于TRPAl發(fā)揮治療作用，用于治療聽力障礙、調(diào)節(jié) 胃腸道動(dòng)力以及用于催產(chǎn)
[0011] 本發(fā)明提供了一種貝美前列腺素作為TRPAl通道激動(dòng)劑在制備降眼壓藥品中的 應(yīng)用，貝美前列腺素以TRPAl作為靶點(diǎn)發(fā)揮降眼壓作用。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種由有效量的貝美前列腺素和藥學(xué)上可接受的輔藥組成藥品。
[0013] 進(jìn)一步地，所述藥學(xué)上可接受的輔藥為維生素 C、山梨醇、甘露醇、果糖、氨基酸、葡 聚糖、糊精或蔗糖。
[0014] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0015] 本發(fā)明提供貝美前列腺是一種新的TRPAl激動(dòng)劑，可用于治療聽力障礙、調(diào)節(jié)胃 腸道動(dòng)力以及催廣等藥物的制備，可以有效治療相關(guān)疾病。
[0016] 本發(fā)明提供了一種TRPAl是貝美前列腺素發(fā)揮降眼壓作用的關(guān)鍵藥物靶點(diǎn)，從而 治療眼部疾病。貝美前列腺素能夠通過激活TRPAl通道，增強(qiáng)機(jī)械敏感性三叉神經(jīng)末梢的 機(jī)械敏感性。使其對眼壓變動(dòng)信息更加敏感，從而促發(fā)更強(qiáng)的反饋調(diào)節(jié)降低眼壓。
【附圖說明】
[0017] 圖1為TRPAl在支配大鼠眼前房內(nèi)壁三叉神經(jīng)元的表達(dá)圖；
[0018] 圖2為貝美前列腺素激活TRPAl引起三叉神經(jīng)元鈣離子內(nèi)流圖；
[0019] 圖3為貝美前列腺素引起hTRPAlHEK 293細(xì)胞的鈣離子內(nèi)流圖；
[0020] 圖4為濃度梯度的貝美前列腺素引起三叉神經(jīng)元的鈣離子內(nèi)流圖；
[0021] 圖5為貝美前列腺素激發(fā)支配大鼠眼前房內(nèi)壁三叉神經(jīng)元的TRPAl電流圖；
[0022] 圖6為TRPAl參與組成支配大鼠眼前房內(nèi)壁三叉神經(jīng)元的機(jī)械敏感性離子通道 圖；
[0023] 圖7為貝美前列腺素激活TRPAl增敏支配大鼠眼前房內(nèi)壁三叉神經(jīng)元的機(jī)械敏感 性圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 為了更好地解釋本發(fā)明，以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的主要內(nèi)容，但 本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于以下實(shí)施例。
[0025] 實(shí)施例1
[0026] UDil神經(jīng)元逆行標(biāo)記
[0027] 受體或通道同時(shí)存在于神經(jīng)元胞體和末梢，因此通常用胞體代替過于微小的末梢 進(jìn)行研究，在胞體上得出的結(jié)論同樣適用于末梢。我們用Dil眼前房注射法標(biāo)記支配大 鼠眼前房內(nèi)壁結(jié)構(gòu)的三叉神經(jīng)元胞體以代替神經(jīng)末梢進(jìn)行研究。將3-5 μ 1熒光示蹤劑 Dil(2.5mg/ml)通過玻璃微電極經(jīng)角膜注射入大鼠眼前房內(nèi)。注射完成后，大鼠禁水一天， 正常進(jìn)食。
[0028] 2、三叉神經(jīng)節(jié)免疫熒光染色
[0029] Dil注射前房后第3天，10%的水合氯醛（4ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠后，用4%多 聚甲醛經(jīng)左心室灌注固定。斷頭去腦，取出三叉神經(jīng)節(jié)，置4%多聚甲醛4°C后固定4-6h，再 置30%蔗糖4°C脫水至沉底，用冰凍切片機(jī)冠狀面連續(xù)切片，厚度30 μ m。漂洗透化后，加入 1:100抗TRPAl抗體/1 %羊血清，4°C孵育過夜。漂洗后，加入1:50FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體/1%羊血清，置于室溫條件下孵育3h。30%甘油封片，封片晾干后在共聚焦顯微鏡下 觀察成像。
[0030] 3、TRPAl在支配大鼠眼前房內(nèi)壁三叉神經(jīng)元的表達(dá)
[0031] 應(yīng)用免疫熒光共定位技術(shù)，TRPAl蛋白（綠色熒光）在三叉神經(jīng)元胞膜上廣泛強(qiáng) 表達(dá)，在Dil標(biāo)記（紅色）的所有三叉神經(jīng)細(xì)胞胞膜上強(qiáng)表達(dá)。（見圖1)
[0032] 4、細(xì)胞取材
[0033] Dil注射前房后第3天，10%的水合氯醛（4ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，斷頭去腦， 取出三叉神經(jīng)節(jié)，快速分離出三叉神經(jīng)元。消化液由2ml的Hanks平衡鹽溶液、75 μ 1的木 瓜蛋白酶、75 μ 1的膠原酶及75 μ 1的-半胱氨酸混合，Tris-OH調(diào)節(jié)PH至中性或稍偏堿性 配制而成。分離得到的細(xì)胞種植于培養(yǎng)皿中的蓋玻片上。靜置30分鐘待細(xì)胞貼壁，隨后在 培養(yǎng)皿中加入DMEM-F12、10%胎牛血清、lOOUnits/mL的雙抗（青霉素/鏈霉素）。隨后將 其放置于37°C的含20%的02及5%的C02培養(yǎng)箱中孵育3-12h，之后用于膜片鉗實(shí)驗(yàn)和鈣 影像實(shí)驗(yàn)。
[0034] 5、鈣影像
[0035] 將接種在蓋玻片上的三叉神經(jīng)元或HEK293細(xì)胞加入含1 μ mol/L的Fura-2AM的 細(xì)胞外液，置于37°C的培養(yǎng)箱中蔽光孵育40min。將負(fù)載后的細(xì)胞放入倒置顯微鏡可移動(dòng) 的細(xì)胞槽中，通過激發(fā)光源（波長為340nm和380nm，間隔時(shí)間Is),使Fura-2被激發(fā)，經(jīng) CCD成像系統(tǒng)和Tillvision軟件采集和分析，即得到Ratio = F340/F380的