專利名稱：血糖水平控制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將用胰島素療治的糖尿病患者的血糖水平控制在正常范圍或使其正常化的藥物。更具體地講，本發(fā)明涉及需要胰島素治療的糖尿病患者的血糖水平控制劑，所述控制劑包括作為活性組分的一種胰島素受體激動(dòng)劑和一種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白；涉及這兩種組分在制備所述血糖水平控制劑方面的應(yīng)用；和涉及采用所述兩種組分將需要胰島素治療的糖尿病患者的血糖水平控制在正常范圍內(nèi)的方法。
最近，由于生活標(biāo)準(zhǔn)的提高和/或飲食方式變?yōu)槲鞣叫惋嬍撤绞?，或運(yùn)動(dòng)缺乏的增加，患有2型糖尿病的患者數(shù)目已經(jīng)增加。由于2型糖尿病中持續(xù)的高血糖，可能誘導(dǎo)各種糖尿病并發(fā)癥，這與1型糖尿病中的情況一樣。
在目前的糖尿病患者的臨床治療方面，主要使用胰島素注射治療1型糖尿病患者。最近，根據(jù)一個(gè)報(bào)告，嚴(yán)格控制血糖水平有效地預(yù)防糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生，因此已經(jīng)積極使用頻繁注射胰島素，即胰島素強(qiáng)化療法(參見Nippon Rinsho，第55卷，1997增刊，第249-254頁)。然而，該胰島素療法也存在問題，并且頻繁注射胰島素給患者帶來很大負(fù)擔(dān)。而且，低血糖也是一個(gè)嚴(yán)重的問題，這由胰島素的作用過度引起(參見Nippon Rinsho，第55卷，1997增刊，第249-254頁)。此外，有報(bào)道用胰島素強(qiáng)化療法治療的患者表現(xiàn)出有較高風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生諸如心肌梗塞的大血管病(參見N.Eng.J.of Med.，第329卷，第977頁(1993))。
2型糖尿病基本上通過運(yùn)動(dòng)療法或飲食療法治療，如有必要，通過給予口服抗糖尿病藥(諸如SU藥、雙胍化合物等)治療。然而，盡管有這些療法，但有在晚期(progressed)糖尿病患者中可能充分控制血糖水平的許多病例，因此在那些患者中，需要給予胰島素(參見NipponRinsho，第55卷，1997增刊，第249-254頁)。此外，最近在2型糖尿病患者中，甚至在該疾病早期用胰島素的積極治療逐漸增加。因此，再次認(rèn)識(shí)到胰島素療法對(duì)于患者的效力。然而，在2型糖尿病的胰島素治療以及在1型糖尿病的治療中，仍存在一些問題，諸如順從性降低、發(fā)生低血糖和發(fā)生大血管病。
為了矯正胰島素療法的上述缺陷，已經(jīng)對(duì)胰島素和具有與胰島素相反的低血糖活性的另一種藥理學(xué)活性物質(zhì)的聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行了研究，所述另一種藥理學(xué)活性物質(zhì)諸如促生長素抑制素(US 4,703,034)、糊精激動(dòng)劑化合物AC137(US 5,175,145)等。
神經(jīng)營養(yǎng)因子是由活體靶細(xì)胞或神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞·許旺細(xì)胞提供的蛋白，表現(xiàn)出維持神經(jīng)元存活和分化的活性，根據(jù)作用的神經(jīng)或受體種類，分為多種類型。其中，稱為神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的蛋白相互之間具有高度的結(jié)構(gòu)同源性。其典型實(shí)例為NGF(神經(jīng)生長因子)、BDNF(腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子)、NT-3(神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3)、NT-4/5等，已知它們起作受體(trkA、trkB和/或trkC)的配體的作用，它們?yōu)镻-75和trk基因的產(chǎn)物(參見Takeshi NONOMURA,hrioshi HARANAKA；Jikken Igaku，第13卷，第376頁(1995))。
諸如NGF、BDNF等的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白已經(jīng)作為用于治療諸如ALS的神經(jīng)變性性疾病患者的治療劑進(jìn)行了研究。例如JoumalNeurophathology and Experimental Neurology，第56卷，第1290頁(1997)A.P.Mizisin等公開了BDNF對(duì)糖尿病性周圍神經(jīng)病的藥理學(xué)活性，但該文獻(xiàn)根據(jù)BDNF在體內(nèi)改善運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)降低的發(fā)現(xiàn)，僅提出BDNF對(duì)糖尿病性周圍神經(jīng)病可能有藥理活性。
在以下例舉的報(bào)道中，報(bào)道了神經(jīng)營養(yǎng)因子對(duì)血糖水平的效應(yīng)。
(1)Exp.Neurology，第131卷，第229頁(1995),Palley-mounterMA等對(duì)正常小鼠研究了由BDNF誘導(dǎo)的食欲的抑制。公開了通過給予BDNF降低血液胰島素水平，并也降低了食欲和體重，但未降低血糖水平。
(2)Cytokine，第7卷，第150頁(1995),Fantuzzi,G.等報(bào)道了CNTF(睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子)對(duì)正常小鼠的效應(yīng)。公開了通過給予CNTF降低食欲和體重，而且還降低血糖水平。該文獻(xiàn)的目的是闡述CNTF或其它細(xì)胞因子成員諸如IL-1、IL-6的炎癥誘導(dǎo)活性的機(jī)制，但該文獻(xiàn)從未公開那些機(jī)制和糖尿病之間的關(guān)系。
(3)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第94卷，第6456頁(1997),Gloaguen,I.等和WO 98/22128,Istitute di Ricerche di Biologia MolecolareP.Angletti S.P.A.(于1998年5月28日公開)報(bào)道了通過給予肥胖性糖尿病動(dòng)物模型db/db小鼠CNTF，由該療法引起的體重和食欲降低，和CNTF的血糖降低效應(yīng)。WO 98/22128公開了一種治療肥胖或肥胖性糖尿病的方法，包括給予CNTF受體激活劑。然而，這些文獻(xiàn)從未公開或提示CNTF對(duì)1型糖尿病的效應(yīng)，也沒有公開或提示CNTF和胰島素的聯(lián)合應(yīng)用。
(4)Biochem. Biophys.Res.Commun.，第238卷，第633頁(1997)，One M.等報(bào)道了通過給予肥胖性糖尿病動(dòng)物模型db/db小鼠BDNF或NT-3，可以抑制高血糖，但不是僅僅由食物攝取降低而引起的，血糖水平可以降至正常小鼠的水平。另外，也報(bào)道了在鏈脲菌素誘導(dǎo)的其胰腺細(xì)胞被鏈脲菌素破壞而不能分泌胰島素的糖尿病模型大鼠中，單獨(dú)給予BDNF不表現(xiàn)出對(duì)血糖水平的效應(yīng)。
在臨床領(lǐng)域，需要在1型糖尿病和2型糖尿病治療中重要的、可以更安全和更準(zhǔn)確地保證和輔助胰島素控制血糖水平的藥物，以及一種可以使得能夠改善順從性和減輕副作用(諸如低血糖性休克、大血管病等)的低血糖藥。
本發(fā)明的另一目的是提供控制需要胰島素治療的糖尿病患者血糖水平的藥物，該藥物包含作為活性組分的一種胰島素受體激動(dòng)劑和一種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白。
本發(fā)明的再一目的是提供應(yīng)用所述兩種組分制備所述用于控制血糖水平的所述藥物。
本發(fā)明的又一目的是提供一種方法，通過同時(shí)或分別給予一種胰島素受體激動(dòng)劑和一種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，將需要胰島素治療的患者的血糖水平控制在正常水平，同時(shí)抑制副作用的發(fā)生。
本發(fā)明人已經(jīng)研究了BDNF的效應(yīng)，通過單獨(dú)給予BDNF,BDNF在2型糖尿病的動(dòng)物模型中表現(xiàn)出區(qū)別的血糖水平降低活性，但不會(huì)使血糖水平降至正常范圍水平之下，還研究了在胰島素分泌降低的糖尿病動(dòng)物模型中聯(lián)合應(yīng)用BDNF和胰島素。結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)，(1)通過給予BDNF與當(dāng)單獨(dú)給予時(shí)其用量不能表現(xiàn)出足夠效應(yīng)的胰島素，BDNF增強(qiáng)胰島素的效應(yīng)，并且將胰島素分泌降低的糖尿病動(dòng)物模型的血糖水平降至優(yōu)選值，并且(2)BDNF的這類效應(yīng)不是相加效應(yīng)/協(xié)同效應(yīng)，并且當(dāng)將BDNF與高得多量的胰島素一起給予時(shí)，BDNF的上述效應(yīng)減小，BDNF不會(huì)使血糖水平降至低于正常值，最后，完成了本發(fā)明。
亦即本發(fā)明具有以下特征。
用于需要胰島素治療患者的血糖水平控制劑，包含作為活性組分的一種胰島素受體激動(dòng)劑和一種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白。
根據(jù)[1]的血糖水平控制劑，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)蛋白為腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)。
根據(jù)[1]的血糖水平控制劑，其中所述胰島素受體激動(dòng)劑為胰島素。
根據(jù)[1]的血糖水平控制劑，其中所述需用胰島素治療的患者為胰島素依賴型糖尿病患者。
用于需要胰島素治療的患者的血糖水平控制劑，包含作為活性組分的一種胰島素受體激動(dòng)劑和一種trkA、trkB和/或trkC受體激動(dòng)劑。
胰島素療法的輔助藥，包含作為活性組分的一種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白。
胰島素受體激動(dòng)劑和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白在制備用于需要胰島素治療的糖尿病患者的血糖水平控制劑方面的應(yīng)用。
將需要胰島素治療的患者的血糖水平控制在正常范圍內(nèi)內(nèi)的方法，包括同時(shí)或分別給予所述糖尿病患者一種胰島素受體激動(dòng)劑和一種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白。
圖2為一曲線圖，顯示在STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中聯(lián)合應(yīng)用BDNF和低劑量胰島素的效應(yīng)?？v坐標(biāo)軸顯示血糖水平，橫坐標(biāo)軸顯示給予胰島素后的時(shí)間。●顯示用D-PBS+鹽水治療組(n=10)在每個(gè)點(diǎn)的平均血糖水平，□顯示用BDNF+鹽水治療組(n=10)在每個(gè)點(diǎn)的平均血糖水平，▲顯示用D-PBS+胰島素治療組(n=10)在每個(gè)點(diǎn)的平均血糖水平，而◇顯示用BDNF+胰島素治療組(n=9)在每個(gè)點(diǎn)的平均血糖水平。**顯示在Turkey試驗(yàn)中，與用D-PBS+胰島素治療組相比有顯著差異，p＜0.01。
圖3為一曲線圖，顯示在STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中聯(lián)合應(yīng)用BDNF和高劑量胰島素的效應(yīng)?？v坐標(biāo)軸顯示血糖水平，橫坐標(biāo)軸顯示給予胰島素后的時(shí)間。(a)◇顯示用D-PBS+0.5單位/kg胰島素治療組(n=6)在每個(gè)點(diǎn)的平均血糖水平，和■顯示用BDNF+1.5單位/kg胰島素治療組(n=6)在每個(gè)點(diǎn)的平均血糖水平，(b)□顯示用D-PBS+4.5單位/kg胰島素治療組(n=6)在每個(gè)點(diǎn)的平均血糖水平，而◆顯示BDNF+4.5單位/kg胰島素治療組(n=6)在每個(gè)點(diǎn)的平均血糖水平。在每個(gè)胰島素劑量下，在D-PBS治療組和BDNF治療組之間的血糖水平?jīng)]有顯著差異。
“需要胰島素治療的糖尿病患者”是指由于缺乏胰島素活性而需要胰島素治療的患者。更具體地講，“需要胰島素治療的糖尿病患者”是指處于胰島素依賴狀態(tài)的1型糖尿病或2型糖尿病患者，它們需要胰島素以治療高血糖。例如，是指因?yàn)橛捎谝认佴录?xì)胞被破壞而不能正常分泌胰島素，而顯示高血糖的患者。
“胰島素受體激動(dòng)劑”是可以結(jié)合于胰島素受體并可以激活所述受體、因此可以降低血糖水平的物質(zhì)的統(tǒng)稱。具體地說，它包括例如天然存在的人胰島素、改性的胰島素諸如速效改性胰島素LY275585、IGF-1等。一種胰島素變異體或改性IGF-1是一種其一級(jí)結(jié)構(gòu)中通過常規(guī)的遺傳工程技術(shù)經(jīng)取代、缺失或添加而修飾了天然存在的氨基酸序列的某些氨基酸殘基的蛋白，它也包括在本發(fā)明的“胰島素受體激動(dòng)劑”的范圍內(nèi)，只要這樣的制品表現(xiàn)出胰島素受體結(jié)合能力和胰島素受體激活活性。另外，較低分子量的肽或有機(jī)化合物可以包括在本發(fā)明的“胰島素受體激動(dòng)劑”范圍內(nèi)，只要這樣的制品表現(xiàn)出胰島素受體結(jié)合能力和胰島素受體激活活性。
“神經(jīng)營養(yǎng)蛋白”是指一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，所述神經(jīng)營養(yǎng)因子從靶細(xì)胞通過自分泌或旁分泌分泌用于神經(jīng)生長或促進(jìn)神經(jīng)元生長、分化或存活，并且使得其在活機(jī)體內(nèi)形成神經(jīng)回路(突觸)。例如，目前已知的腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子(在下文縮寫為BDNF)、神經(jīng)生長因子(在下文縮寫為NGF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3(在下文縮寫為NT-3)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白4(在下文縮寫為NT-4)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白5(在下文縮寫為NT-5)和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白6(在下文縮寫為NT-6)。
“用于需要胰島素治療的患者的血糖水平控制劑”是指用于將患有1型糖尿病或2型糖尿病的患者并且可以為胰島素治療對(duì)象的患者的血糖水平控制在正常范圍內(nèi)的藥物。按照目前的臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，正常的血糖水平為在75g劑量的葡萄糖耐受試驗(yàn)后2小時(shí)低于200mg/dl，和低于140mg/dl禁食血糖，尤其是在100-120mg/dl范圍內(nèi)。本發(fā)明的血糖水平控制劑為使得能夠安全并持續(xù)地將血糖水平控制在正常范圍內(nèi)的藥物，它可以將禁食血糖水平高于400mg/dl的患者的血糖水平降至200mg/dl或更低，但不低于70mg/dl。
根據(jù)最近修正的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，糖尿病的血糖水平在75g劑量的葡萄糖耐受試驗(yàn)后2小時(shí)高于200mg/dl，和高于126mg/dl禁食血糖。
“trkA、trkB和/或trkC受體激動(dòng)劑”是結(jié)合于在稱為“神經(jīng)營養(yǎng)蛋白”受體的trk基因表達(dá)產(chǎn)物中的trkA、trkB或trkC并激活它們以顯示其活性的物質(zhì)的統(tǒng)稱。具體地說，已知的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白是例如結(jié)合于trkA的NGF、結(jié)合于trkB的BDNF或NT-4和結(jié)合于trkC的NT-3等。這一概念不僅包括修飾的化合物(通過氨基酸取代、缺失或添加而修飾)，而且包括較低分子量的肽和有機(jī)化合物，只要它們表現(xiàn)出對(duì)于trkA、trkB或trkC的結(jié)合能力和激活能力，例如酪氨酸殘基的磷酸化活性。
“胰島素治療的輔助藥”是指這樣一種藥物，所述藥物在胰島素治療下的1型糖尿病或2型糖尿病患者中，通過在給予胰島素之前或與給予胰島素的同時(shí)給予時(shí)，表現(xiàn)出(1)降低胰島素劑量和胰島素給藥頻率的活性，和(2)防止因胰島素作用過度引起的嚴(yán)重低血糖的活性。(1)的效應(yīng)與“增強(qiáng)胰島素作用的活性”的含義相同。這種效應(yīng)可以通過提高所述細(xì)胞的胰島素敏感性而達(dá)到，這種效應(yīng)當(dāng)與單獨(dú)給予時(shí)不能表現(xiàn)出足夠低血糖活性的低劑量胰島素一起給予時(shí)尤為明顯。當(dāng)與甚至在單獨(dú)給予時(shí)也可以表現(xiàn)足夠低血糖活性的高劑量胰島素一起給予時(shí)，表現(xiàn)出(2)的效應(yīng)。制備和測(cè)定方法將用于本發(fā)明的血糖水平控制劑或需用胰島素治療的患者的胰島素治療輔助藥的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白(NGF、BDNF、NT-3、NT-4等)，可以是任何一種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，例如天然存在的、重組的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，只要它表現(xiàn)出固有的生物化學(xué)。它可以經(jīng)純化后用于本發(fā)明。例如，Brade,Y.E.等從豬腦中分離出BDNF(參見EMBO Joumal,第5卷，第549-553頁(1982))，克隆后分析BDNF基因，由此證實(shí)BDNF的一級(jí)結(jié)構(gòu)由119個(gè)氨基酸組成(參見leibrock,J.等，Nature，第341頁，第149頁(1989))。另外，諸如Met-BDNF的在N末端具有一個(gè)甲硫氨酸殘基的修飾重組BDNF，或通過用常規(guī)的基因工程技術(shù)經(jīng)取代、缺失或除去、或添加上述天然存在的BDNF序列中的一部分氨基酸序列而產(chǎn)生的重組突變BDNF，可以用于本發(fā)明，只要它們是具有BDNF活性的藥用制劑。
“BDNF活性”是指維持脊神經(jīng)節(jié)、迷走神經(jīng)下節(jié)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)、黑質(zhì)多巴胺能(nigradopaminergic)神經(jīng)元、前腦基底膽堿能神經(jīng)元等的存活或促進(jìn)其分化的活性。這些活性可以在體外或體內(nèi)得到證實(shí)(JP-A-5-328974,USP 5,180,820)。
已經(jīng)報(bào)道了用于制備BDNF的各種方法，用任一方法制備的任何BDNF均可以用于本發(fā)明中。當(dāng)從動(dòng)物組織中分離的BDNF用于本發(fā)明時(shí)，可以將其純化至這樣一種程度，使得它可以用作藥物(參見EMBO Joumal，第5卷，第549頁(1982))?；蛘?，可以從可以產(chǎn)生BDNF的原代培養(yǎng)細(xì)胞或建立的細(xì)胞系獲得BDNF，并從其培養(yǎng)液(例如培養(yǎng)上清液、培養(yǎng)的細(xì)胞)中分離BDNF。此外，通過常規(guī)的基因工程技術(shù)，例如通過將編碼BDNF的基因插入合適的載體中，用所述重組載體轉(zhuǎn)化合適的宿主，并且從所得轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)上清液中分離，可以獲得重組BDNF(參見Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第88卷，第961頁；Biochem.Biophys.Res.Commun.，第186卷，第1553頁(1992))。所述基因工程技術(shù)適用于大規(guī)模生產(chǎn)相同質(zhì)量的BDNF。用于上述方法的宿主細(xì)胞不受限制，但可以是已經(jīng)用于基因工程技術(shù)的任何常規(guī)宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌、枯草桿菌、酵母、植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞。
已經(jīng)報(bào)道了其它神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的基因重組產(chǎn)物，諸如NGF、NT-3、NT-4等。NGF可以以制備BDNF的相同方式由各種宿主細(xì)胞制備。(CHO Cell,Schmelzer,C.H.:J.Neurochemistry,59,1675(1992))、大腸桿菌細(xì)胞日本專利第263792號(hào))。NT-3可以以制備BDNF的相同方式由各種宿主細(xì)胞制備。其制備和測(cè)定方法公開于Neuron，第4卷，767(1990)或JP-A-5-161493(WO 91/3659)。NT-4可以以制備BDNF的相同方式由各種宿主細(xì)胞制備。重組NT-4的表達(dá)方法及其測(cè)定方法公開于Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第89卷，第3060頁(1992)、JP-A-4-509600(WO 93/25684)或JP-A-6-501617(WO 92/05254)。
在與神經(jīng)營養(yǎng)蛋白一起使用的胰島素受體激動(dòng)劑中，主要含胰島素的許多藥物是市售的。具體實(shí)例為SHIMIZU EIYAKU-TAKEDACHEMICAL INDUSTRIES,LTD.生產(chǎn)的動(dòng)物來源的胰島素“Iszilin”；Novo Noridsk-YAMANOUCHI PHARMACEUTICAL CO.,LTD.生產(chǎn)的重組人胰島素“Novolin R”；Eli Lilly Japan KK生產(chǎn)的相同的“Humulin R”；和其它結(jié)晶胰島素鋅懸液、魚精蛋白鋅胰島素懸液；胰島素鋅魚精蛋白懸液等。(Drugs in Japan,Japan Pharmaceuticalinformation Center編輯，1997年10月版，第203-206頁)。另外，IGF-I由FUJISAWA PHAEMACEUTICAL CO.LTD以“Somazon”出售。藥用制劑藥用制劑可以是注射用制劑、口服制劑、液體制劑、凍干制劑，優(yōu)選用于皮下給藥的注射用制劑。這些胃腸外藥用制劑可以含有一種用于該領(lǐng)域的常規(guī)穩(wěn)定劑或載體，最好是以等滲溶液形式使用所述制劑。所述藥用載體或稀釋劑可以是例如得自血清的蛋白諸如白蛋白、氨基酸諸如甘氨酸、糖諸如甘露醇等。當(dāng)本發(fā)明的藥用制劑為溶液制劑或凍干制劑形式時(shí)，最好向其中加入表面活性劑諸如土溫80，以防止活性物質(zhì)的聚集。最簡單的是，將神經(jīng)營養(yǎng)蛋白溶于市售的用于皮下注射的胰島素液體制劑中，得到本發(fā)明的用于皮下注射的液體制劑。當(dāng)需要延長藥理學(xué)效應(yīng)時(shí)，則可以用常規(guī)的微球型持續(xù)釋放的藥用載體的生物降解性(biodegenerative)聚合物(例如聚乙酸-聚乙醇酸的聚合物)制備藥用制劑。
在本發(fā)明的血糖水平控制劑中，所述活性組分-胰島素受體激動(dòng)劑和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白可以同時(shí)給予或分別給予，因此當(dāng)同時(shí)給予時(shí)，可以將這些組分配制為含兩種組分的一種制劑，或可以將這兩種組分分別配制，然后裝入一個(gè)試劑盒包裝中。例如，分別凍干這兩種組分，制備包括這兩種凍干組分和一種其溶劑的試劑盒，然后當(dāng)使用時(shí)將這些組分溶解；或制備包括這兩種組分之一的溶液制劑和另一種凍干組分的試劑盒，然后當(dāng)使用時(shí)，將這些組合混合并溶解；或制備包含每一組分的兩種溶液制劑的試劑盒，然后當(dāng)使用時(shí)將這兩種溶液制劑混合。
當(dāng)分別給予時(shí)，這兩種組分以上述試劑盒形式制備，單獨(dú)給予每種組分，或?qū)⑦@兩種組分之一的制劑與市售的另一種組分的制劑一起使用?；钚越M分的混合比所述活性組分-胰島素受體激動(dòng)劑和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的混合比可以自由限定，可以通過常規(guī)動(dòng)物試驗(yàn)或臨床試驗(yàn)確定合適的比率。在含有胰島素和BDNF的皮下注射制劑中BDNF的含量為每單位胰島素0.01-100mg。
在本發(fā)明的血糖水平控制劑中，胰島素受體激動(dòng)劑和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白合適含量分別為其日劑量。例如，將其配制為含有0.1-1,000單位(換算的人胰島素量，下文與此相同)量的一種胰島素受體激動(dòng)劑和0.6μg-7,200mg量的一種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的制劑，最好為含有4-100單位量的一種胰島素受體激動(dòng)劑和6μg-3,000mg量的一種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的制劑。這些活性組分可以如上所述一起包含于同一制劑中，或包含于不同制劑中。用法可以將本發(fā)明的血糖水平控制劑，以與給予常規(guī)胰島素制劑相似的方式主要給予需要胰島素治療的患者。所述胰島素受體激動(dòng)劑的日劑量的范圍換算為人胰島素的量，基本上為0.1-1,000單位/人，最好為4-100單位/人。與所述胰島素受體激動(dòng)劑同時(shí)或分別給藥的所述神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的日劑量范圍為約0.01μg-120mg/kg，最好為0.1μg-50mg/kg，它可以經(jīng)皮下、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)給予。
如上所述，在本發(fā)明的血糖水平控制劑中，兩種所述活性組分可以同時(shí)給予或分別給予。因此，采用本發(fā)明的血糖水平控制劑治療需要胰島素治療的糖尿病患者時(shí)，將上述日劑量的所述胰島素受體激動(dòng)劑和所述神經(jīng)營養(yǎng)蛋白同時(shí)或分別給予所述患者。最好是，所述神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的日劑量一日給予一次，或分為2-3個(gè)劑量單位，然后，將所述日劑量的所述胰島素受體激動(dòng)劑一日給予一次，或分為2-3個(gè)劑量單位。毒性一般而言，在糖尿病早期，在每次進(jìn)食之前，通過皮下注射劑量為4-20單位應(yīng)用胰島素制劑，然后，根據(jù)該患者的病情，以4-80單位/人/天的劑量使用。盡管根據(jù)情況確定劑量，但證實(shí)至多約100單位/人/天的劑量在臨床上是安全的。當(dāng)將神經(jīng)營養(yǎng)蛋白、尤其是將BDNF分別以100mg/kg和60mg/kg的劑量皮下給予大鼠和短尾猴4周時(shí)，沒有動(dòng)物死亡。關(guān)于急性毒性，以高于200mg/kg劑量將BDNF給予大鼠的短尾猴，沒有動(dòng)物死亡。因此，BDNF表現(xiàn)出高度的安全性。對(duì)于其它神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，也沒有嚴(yán)重的副作用報(bào)道。
通過實(shí)施例說明本發(fā)明。
試驗(yàn)動(dòng)物雄性C57 BL/6NCrj小鼠(SPF)購自Charles River JapanInc.。預(yù)喂養(yǎng)1周后，將7或8周齡的動(dòng)物用于實(shí)驗(yàn)中。將小鼠保持在溫度控制為23±2℃、濕度為55±10％的房間中，照明周期為開燈(8:00至20:00)，關(guān)燈(20:00至8:00)。在預(yù)喂養(yǎng)期間，讓動(dòng)物自由進(jìn)食動(dòng)物飼料(CE-2,Clea Japan,Inc.)和滅菌自來水，但如有必要，當(dāng)用于實(shí)驗(yàn)時(shí)，給小鼠禁食。
(2)鏈脲菌素(STZ)、BDNF和胰島素給藥溶液的制備將STZ溶于10mM檸檬酸鈉溶液(pH5.5)中，得到20mg/ml溶液。使用時(shí)制備STZ溶液，并在溶解后5分鐘內(nèi)使用。通過用D-PBS(Gibco)稀釋至2mg/ml的濃度，制備BDNF溶液，并用于實(shí)驗(yàn)中。通過用鹽水稀釋持續(xù)釋放型胰島素(Novolin U注射液100)，制備胰島素溶液并用于實(shí)驗(yàn)中。
(3)通過給予STZ降低胰島素分泌的高血糖動(dòng)物的選自和分組對(duì)預(yù)喂養(yǎng)的小鼠以10μl/g的比率(以STZ 200mg/kg的劑量)腹膜給予上述(2)中制備的STZ溶液。第二天，再次給予小鼠STZ溶液。第二次給予STZ后3天，測(cè)量所有小鼠的血糖水平和體重，根據(jù)結(jié)果將動(dòng)物分組。在該實(shí)驗(yàn)中排除未表現(xiàn)出高血糖(300mg/dl或更低)的小鼠和明顯情況差的小鼠。
(4)測(cè)量血糖水平的方法及其統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用Antsence Ⅱ血糖分析儀(Sankyo,Bayer)測(cè)量取自尾靜脈的血的血糖水平。通過Turkey檢驗(yàn)分析如此測(cè)量的血糖水平。
(5)通過單獨(dú)給予胰島素降低血糖水平研究了在STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中所述胰島素劑量及其低血糖活性之間的關(guān)系。將通過給予STZ誘導(dǎo)的高血糖小鼠根據(jù)其血糖水平和體重分為4組(每組6只動(dòng)物)。向每組以0、0.5、1.5和5.0單位/kg的劑量皮下注射胰島素，測(cè)量給藥后每1小時(shí)的血糖水平，直至給藥后4小時(shí)。給予胰島素后，讓動(dòng)物禁食。

圖1顯示每組每個(gè)時(shí)間的血糖水平。觀察到給予胰島素的劑量依賴性低血糖效應(yīng)，與胰島素0單位/kg治療組(●)相比，觀察到在給藥后1小時(shí)，在胰島素0.5單位/kg治療組(■)的血糖水平顯著降低，但高于400mg/dl的平均血糖水平僅降至約300mg/ml，此后2小時(shí)，血糖水平幾乎回復(fù)至原始水平。然而，在較高劑量諸如1.5單位/kg胰島素治療組(▲)中和5.0單位/kg胰島素治療組(○)中，觀察到血糖水平的顯著降低。
(6)聯(lián)合應(yīng)用BDNF和胰島素的效應(yīng)(1)；對(duì)低劑量胰島素的效應(yīng)研究了聯(lián)合應(yīng)用BDNF和胰島素對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的效應(yīng)。將給予STZ誘導(dǎo)的高血糖小鼠根據(jù)其血糖水平和體重分為4組(每組9或10只動(dòng)物)。第一組D-PBS+鹽水治療組(n=10)，第二組20mg/kg BDNF+鹽水治療組(n=10)，第三組D-PBS+0.5單位/kg胰島素治療組(n=10)，第四組20mg/ml BDNF+0.5單位/kg胰島素治療組(n=9)。在給予胰島素(或鹽水)之前1小時(shí)給予BDNF(或D-PBS)，在給予胰島素(或鹽水)之后每1小時(shí)，定期測(cè)量血糖水平，直至給藥后4小時(shí)。在給予BDNF或D-PBS后讓動(dòng)物禁食。圖2顯示每組每個(gè)時(shí)間的血糖水平。
結(jié)果，在20mg/kg BDNF+鹽水治療組(□)中，沒有觀察到血糖水平的顯著降低。另一方面，在D-PBS+0.5單位/kg胰島素治療組(▲)中，在給予胰島素后1小時(shí)或2小時(shí)，血糖水平降低至約350mg/dl。在20mg/kg BDNF+0.5單位/kg胰島素治療組(○)中，在給予胰島素后1小時(shí)或2小時(shí)，血糖水平分別顯著降至約210、220mg/dl，而當(dāng)與D-pBS+0.5單位/kg胰島素治療組相比時(shí)，觀察到血糖水平的顯著降低的活性。亦即在單獨(dú)給予時(shí)不表現(xiàn)出足夠效應(yīng)的低劑量胰島素治療組中，觀察到通過預(yù)給予BDNF明顯增強(qiáng)胰島素活性。
(7)聯(lián)合應(yīng)用BDNF和胰島素的效應(yīng)(2)；對(duì)較高劑量的胰島素的效應(yīng)研究了聯(lián)合應(yīng)用BDNF和較高劑量的胰島素對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的效應(yīng)。將給予STZ誘導(dǎo)的高血糖小鼠根據(jù)其血糖水平和體重分為4組(每組6只動(dòng)物)。第一組D-PBS+1.5單位/kg胰島素治療組，第二組20mg/kg BDNF+1.5單位/kg胰島素治療組，第三組D-PBS+4.5單位/kg胰島素治療組，第四組20mg/kgBDNF+4.5單位/kg胰島素治療組。在給予胰島素(或鹽水)之前1小時(shí)給予BDNF(或D-PBS)，在給予胰島素之后每1小時(shí)，定期測(cè)量血糖水平，直至給藥后4小時(shí)。在給予BDNF或D-PBS后讓動(dòng)物禁食。圖3顯示每一時(shí)間點(diǎn)的血糖水平。在圖3中，(a)顯示使用1.5單位/kg胰島素時(shí)的數(shù)據(jù)，而(b)顯示使用4.5單位/kg胰島素時(shí)的數(shù)據(jù)。
如圖3(a)和(b)所示，在D-PBS+1.5單位/kg胰島素治療組(Δ)、20mg/kg BDNF+1.5單位/kg胰島素治療組(■)、D-PBS+4.5單位/kg胰島素治療組(○)和20mg/kg BDNF+4.5單位/kg胰島素治療組(◆)的每個(gè)組中，均觀察到血糖水平的明顯下降，但在D-PBS治療組和BDNF治療組之間沒有顯著差異。制劑1在本發(fā)明的血糖水平控制劑中，可以如下制備一種代表性制劑-含胰島素和BDNF的用于皮下給藥的水溶液制劑。
(1)向胰島素(100單位)和純化的重組BDNF(20g)中加入甘露醇(10mg)和非離子表面活性劑(聚山梨醇酯80,0.1mg)，將混合物溶于10mM磷酸緩沖鹽溶液(pH7.0,1ml)中。
(2)將BDNF(10mg)溶于YAMANOUCHI Pharmaceutical Co.,Ltd.生產(chǎn)的重組人胰島素(1000單位/10ml)的胰島素注射液制劑(Novolin U注射液100)中。制劑2在本發(fā)明的胰島素治療輔助藥中，通過將甘露醇(10mg)和非離子表面活性劑(聚山梨醇酯80,0.1mg)加入純化的重組BDNF(20g)中，并將所得混合物溶于10mM磷酸緩沖鹽溶液(pH7.0,1ml)中，可以制備一種代表性制劑-含BDNF的液體制劑。
工業(yè)應(yīng)用性通過給予本發(fā)明的血糖水平控制劑或輔助藥，(1)可以在需要胰島素治療的高血糖患者中增強(qiáng)胰島素活性，但(2)不增強(qiáng)胰島素的過度作用，使得可以預(yù)防低血糖，藉此可以達(dá)到安全而有效地將糖尿病患者的血糖水平控制在正常范圍內(nèi)。亦即與僅含胰島素的藥劑相比，本發(fā)明可以提供一種治療方法，用此方法，可以控制血糖水平，其控制水平即使胰島素劑量和給藥頻率降低后，也與原始量的胰島素控制水平相同。因此，本發(fā)明可以在需要胰島素治療的糖尿病患者中改善順從性、抑制低血糖的發(fā)生，并進(jìn)一步減輕諸如大血管病的副作用。
權(quán)利要求
1．用于需要胰島素治療的糖尿病患者的血糖水平控制劑，所述血糖水平控制劑包含作為活性組分的一種胰島素受體激動(dòng)劑和一種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的血糖水平控制劑，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)蛋白為選自腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白4、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白5和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白6中的一個(gè)成員。
3．根據(jù)權(quán)利要求1的血糖水平控制劑，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)蛋白為腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子。
4．根據(jù)權(quán)利要求1的血糖水平控制劑，其中所述胰島素受體激動(dòng)劑為胰島素。
5．根據(jù)權(quán)利要求1的血糖水平控制劑，其中所述需要胰島素治療的糖尿病患者為胰島素依賴型糖尿病患者。
6．根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的血糖水平控制劑，所述血糖水平控制劑含有0.1-1000單位(換算為人胰島素的量)量的一種胰島素受體激動(dòng)劑和0.6μg-7200mg量的一種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白。
7．根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的血糖水平控制劑，所述血糖水平控制劑含有4-100單位(換算為人胰島素的量)量的一種胰島素受體激動(dòng)劑和6μg-3,000mg量的一種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白。
8．用于需要胰島素治療的糖尿病患者的血糖水平控制劑，所述血糖水平控制劑包含作為活性組分的一種胰島素受體激動(dòng)劑和一種trkA、trkB和/或trkC受體激動(dòng)劑。
9．胰島素療法的輔助藥，所述輔助藥包含作為活性組分的一種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白。
10．胰島素受體激動(dòng)劑和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白在制備用于需要胰島素治療的糖尿病患者的血糖水平控制劑方面的應(yīng)用。
11．根據(jù)權(quán)利要求10的用途，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)蛋白為選自腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白4、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白5和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白6中的一個(gè)成員。
12．根據(jù)權(quán)利要求10的用途，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)蛋白為腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子。
13．根據(jù)權(quán)利要求10的用途，其中所述胰島素受體激動(dòng)劑為胰島素。
14．用于將需要胰島素治療的糖尿病患者的血糖水平控制在正常范圍內(nèi)內(nèi)的方法，所述方法包括同時(shí)或分別給予所述糖尿病患者均為有效量的一種胰島素受體激動(dòng)劑和一種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白。
15．根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述胰島素受體激動(dòng)劑和所述神經(jīng)營養(yǎng)蛋白分別經(jīng)皮下、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)給予。
16．根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)蛋白為選自腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白4、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白5和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白6中的一個(gè)成員。
17．根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)蛋白為腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子。
18．根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述胰島素受體激動(dòng)劑為胰島素。
全文摘要
公開了用于需要胰島素治療的糖尿病患者的血糖水平控制劑,其包含作為活性組分的一種胰島素受體激動(dòng)劑和一種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白;使用上述兩種成分制備血糖控制劑;和使用這兩種組分將糖尿病血糖水平控制在正常范圍內(nèi)的方法。通過使用上述藥用制劑控制需要胰島素治療的糖尿病患者的血糖水平,可以增強(qiáng)胰島素的效應(yīng),并且同時(shí)可以減輕諸如低血糖性休克的副作用,由此也使得能夠改善順從性。
文檔編號(hào)A61K38/18GK1314819SQ99810064
公開日2001年9月26日 申請(qǐng)日期1999年8月10日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月11日
發(fā)明者中川勉, 泰地睦夫, 中山智加男, 野口浩 申請(qǐng)人:住友制藥株式會(huì)社