鋅指蛋白a20在治療脂肪肝和ⅱ型糖尿病中的功能和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了鋅指蛋白A20在治療脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的功能和應(yīng)用，屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明通過高脂飲食誘導(dǎo)的模型研究A20基因的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HFD組A20基因敲除小鼠的體重、空腹血糖水平均高于對(duì)照組WT小鼠，腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)A20基因敲除小鼠對(duì)葡萄糖的耐受能力明顯減弱；從小鼠肝臟大體外觀、肝臟重量、肝臟/體重比值以及脂質(zhì)成分病理染色結(jié)果等均說明HFD組的A20-KO小鼠脂肪肝病變明顯嚴(yán)重，脂質(zhì)蓄積顯著增加，這些結(jié)果表明A20基因敲除顯著惡化脂肪肝、Ⅱ型糖尿病。針對(duì)A20的上述作用，A20可用于制備預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物。
【專利說明】鋅指蛋白A20在治療脂肪肝和II型糖尿病中的功能和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種鋅指蛋白A20在治療脂肪肝、 Π 型糖尿病中的功能和應(yīng)用，以及A20作為靶基因在制備預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和II 型糖尿病疾病的藥物中應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪肝和糖尿病是一種嚴(yán)重危害人類健康的慢性代謝性疾病，是代謝性疾病，也 是一種慢性、低度的炎癥性疾病。其患病人數(shù)正隨著人民生活水平的提高、人口老化、生活 方式的改變以及診斷技術(shù)的進(jìn)步而迅速增加。2002年在全國營養(yǎng)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)：我國18歲 及18歲以上居民糖尿病患病率為2. 6%，而在1996年糖尿病抽樣調(diào)查時(shí)顯示為：我國20? 75歲人群糖尿病患病率為3. 21%，2010年，我國糖尿病患病率已經(jīng)超過10%。WHO 1997年報(bào) 告稱，當(dāng)時(shí)全世界約有1. 35億糖尿病病人，預(yù)測到2025年時(shí)此數(shù)據(jù)將上升到3億，甚至更 多。糖尿病病人長時(shí)間的血糖控制不理想可引起多系統(tǒng)持續(xù)損害，是嚴(yán)重威脅人類健康的 世界性公共衛(wèi)生問題。全社會(huì)在糖尿病的研究上投入了巨大的人力和財(cái)力，關(guān)于糖尿病及 其并發(fā)癥的病因、發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，預(yù)防和治療都有待于完善。
[0003] 世界衛(wèi)生組織按糖尿病病因和發(fā)病機(jī)制將其大致分為I型糖尿病、II型糖尿病、 特殊類型糖尿病和妊娠期糖尿病。II型糖尿病又稱非胰島素依賴型糖尿病，約占糖尿病總 人數(shù)的90%以上。隨著糖尿病患病率的迅速增長，肝膽疾病已經(jīng)變得非常普遍，對(duì)臨床醫(yī)生 是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)。肝臟是物質(zhì)代謝的中樞，它具有許多重要的生理功能，如葡萄糖的合成 和分解，脂質(zhì)合成和分解，膽汁合成和分泌等。肝臟是人體生化工廠，脂質(zhì)由肝臟合成和輸 出。隨著糖尿病病程的延長，發(fā)生肝臟病變的危險(xiǎn)性及其病變程度也隨之增加。高血糖可引 起肝臟組織學(xué)和功能上的變化，并可促進(jìn)膽管紊亂，持久性高血糖狀態(tài)能導(dǎo)致肝功能衰退。 另一方面，肝功能異?？蓪?dǎo)致葡萄糖代謝紊亂和加劇糖尿病。
[0004] A20,又稱腫瘤壞死因子 α 誘導(dǎo)蛋白 3 (tumor necrosis factor, alpha-induced protein 3, TNFAIP3)基因是腫瘤壞死因子（TNF-α )誘導(dǎo)下的即早反應(yīng)基因，其表達(dá)產(chǎn)物屬 于胞漿內(nèi)的一種鋅指類瞬時(shí)調(diào)控蛋白，可以終止NF- K B信號(hào)通路（1 )，NF- K B信號(hào)通路介 導(dǎo)幾乎所有的傳染病（2)。研究發(fā)現(xiàn)，Α20可抑制不同細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1、NF-kB等） 及基因活化引起的細(xì)胞凋亡、過度的炎癥反應(yīng)、免疫排斥等。在成纖維細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及內(nèi) 皮細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)A20蛋白可抑制TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（3)。最近研究發(fā)現(xiàn)去泛素化酶活 性的A20 knock in小鼠和正常小鼠無顯著區(qū)別，無炎癥反應(yīng)，有正常比例的B細(xì)胞、T細(xì)胞、 樹突細(xì)胞和骨髓細(xì)胞，表明去泛素化酶活性的A20對(duì)NF-κ B信號(hào)通路無直接相關(guān)性（4)。 在中國的淋巴瘤患者中，有共同的特征：缺乏A20表達(dá)，粘膜相關(guān)的淋巴組織淋巴瘤異位基 因1 (MALTl)表達(dá)紊亂，T細(xì)胞活性減弱（5) ;A20可通過阻斷轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1 依賴的信號(hào)通路，從而促進(jìn)心臟功能，抑制心臟肥大、炎癥、凋亡及纖維化（6)。
[0005] 參考文獻(xiàn)： 1. Pelzer C, Cabalzar K, Wolf A, Gonzalez M, Lenz G, et al. (2013) The protease activity of the paracaspase MALT1 is controlled by monoubiquitination. Nat Immunol 14: 337 - 345. doi: 10. 1038/ni. 2540. 2. Aggarwal BB. (2003) Signalling pathways of the TNF superfamily: a double-edged sword. Nat Rev Immunol 3: 745 - 756. doi: 10. 1038/nrill84. 3. Zhao XH, Zhu XD, Huang PT (2005). Artificial transcription factors as tools for gene expression manipulation. Sheng ffu Gong Cheng Xue Bao. 21 (3) : 341-7. 4. Arnab De, Teruki Dainichi, Chozha Vendan Rathinam, Sankar Ghosh. The deubiquitinase activity of A20 is dispensable for NF-κ B signaling. EMBO Rep. 2014 May 30. 5. Wang X, et al. (2014) Abnormal expression of A20 and its regulated genes in peripheral blood from patients with lymphomas. Cancer Cell Int. 26;14:36. doi: 10.1186/1475-2867-14-36. 6. Huang H, et al. (2010)Tumor suppressor A20 protects against cardiac hypertrophy and fibrosis by blocking transforming growth factor-beta-activated kinase 1-dependent signaling. Hypertension. 56(2):232_9〇


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種鋅指蛋白A20基 因的表達(dá)與脂肪肝、II型糖尿病之間的相互關(guān)系，提供一個(gè)用于治療脂肪肝、II型糖尿病的 靶基因 A20的新用途，進(jìn)而把A20基因應(yīng)用于脂肪肝、II型糖尿病的治療。
[0007] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 本發(fā)明以野生型C57小鼠與鋅指蛋白A20基因敲除小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過高脂飲食誘 導(dǎo)的肥胖小鼠模型（diet induced obesity, DI0)模型研究A20基因的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野 生型WT小鼠對(duì)比，A20基因敲除小鼠表現(xiàn)出肥胖，其體重明顯高于同種飼料飼養(yǎng)的WT小鼠， 并且A20基因敲除小鼠的體重及空腹血糖水平均高于對(duì)照組WT小鼠，A20基因敲除小鼠的 肝功能明顯差于WT小鼠。進(jìn)一步通過腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)A20基因敲除小鼠對(duì) 葡萄糖的耐受能力明顯減弱。從小鼠肝臟大體外觀，肝臟重量及肝臟/體重比以及脂質(zhì)成 分病理染色結(jié)果等均說明HFD組（High fat diet，高脂飲食)的A20-K0小鼠脂肪肝病變明顯 嚴(yán)重，脂質(zhì)蓄積顯著增加。這表明A20基因敲除會(huì)加劇脂肪肝、II型糖尿病的發(fā)生，A20基 因能夠改善脂肪肝、II型糖尿病。
[0008] -種鋅指蛋白A20基因在脂肪肝、II型糖尿病疾病中的功能，具體體現(xiàn)在鋅指蛋 白A20具有維持糖代謝穩(wěn)態(tài)和改善脂肪肝、II型糖尿病的功能。
[0009] 針對(duì)鋅指蛋白A20的維持糖代謝穩(wěn)態(tài)和改善脂肪肝、II型糖尿病的功能，A20可在 制備用于預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝疾病的藥物方面應(yīng)用。
[0010] 一種預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝疾病的藥物，包含鋅指蛋白A20。
[0011] 針對(duì)鋅指蛋白A20的維持糖代謝穩(wěn)態(tài)和改善脂肪肝、II型糖尿病的功能，A20可在 制備用于預(yù)防、緩解和/或治療II型糖尿病的藥物方面應(yīng)用。
[0012] 一種預(yù)防、緩解和/或治療II型糖尿病的藥物，包含鋅指蛋白A20。
[0013] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果： (1)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白A20基因的新功能，即鋅指蛋白A20基因具有能夠保護(hù)脂肪 肝、II型糖尿病疾病的作用。
[0014] (2)基于鋅指蛋白A20在保護(hù)脂肪肝、II型糖尿病疾病中的作用，其可以用于制備 預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或II型糖尿病的藥物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1是WT和A20-K0小鼠的體重、空腹血糖結(jié)果圖；A為小鼠體重結(jié)果圖，B為空腹 血糖水平統(tǒng)計(jì)圖（林 Φ < 〇· 〇1 vs WT NC 組，# :p < 0· 05 vs WT HFD 組，## :p < 0· 01 vs WT HFD 組)。
[0016] 圖2是WT和A20-K0小鼠通過腹腔注射葡萄糖耐量結(jié)果圖；A為通過腹腔注射葡 萄糖后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠血糖水平統(tǒng)計(jì)圖，B為各組小鼠糖耐量曲線下面積（area under the curve，AUC)比較圖（* :p < 0· 05 vs WT NC 組，** :p < 0· 01 vs WT NC 組，## :p < 0· 01 vs WT HFD 組)。
[0017] 圖3是A20-K0和WT小鼠的肝臟大體外觀結(jié)果圖；A為肝臟大體結(jié)果圖，B為肝臟 重量、肝臟重量與小鼠本身體重比值統(tǒng)計(jì)柱狀圖（# Φ < 〇. 05 vs WT HFD組)。
[0018] 圖4是WT和A20-K0小鼠的肝臟組織脂質(zhì)成分HE和油紅0染色圖。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0020] 實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物及飼養(yǎng)： 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬，性別，周齡及來源：C57BL/6 (WT)小鼠和A20-K0小鼠，雄性，8周齡。 C57BL/6小鼠購自北京華阜康生物科技有限公司；A20基因敲除小鼠（A20-K0,購自日本 RIKEN 公司，貨號(hào)：RBRC05495)。
[0021] 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料配方：高脂飼料（High fat diet, HFD)(購自北京華阜康生物科技 有限公司，貨號(hào)D12942):熱量百分比：蛋白質(zhì)20%，碳水化合物20%，脂肪60% ;總的熱量質(zhì) 量比5. 24kcal/g。低脂飼料（Normal chow, NC)(購自北京華阜康生物科技有限公司，貨號(hào) D12450B):熱量百分比：蛋白質(zhì)20%，碳水化合物70%，脂肪10% ;總的熱量質(zhì)量比3. 85kcal/ g°
[0022] 動(dòng)物飼養(yǎng)及環(huán)境條件：所有的實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學(xué)心血管病研究所SPF 級(jí)動(dòng)物房（許可證號(hào)：SYXK (鄂）：2009-0053)。每12小時(shí)交替照明，溫度24±2°C，濕度 40%-70%，小鼠自由飲水進(jìn)食。
[0023] 實(shí)施例1小鼠脂肪肝、II型糖尿病模型（diet induced obesity, DI0)獲得 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：選用8周齡，雄性，WT小鼠和A20-K0小鼠，分別給與兩種特殊飼料 D12942 高脂飼料（Highfat diet，HFD)和 D12450B 低脂飼料（Normal chow，NC)飼養(yǎng)，即 WT NC組，K0 NC組，WT HFD組，K0 HFD組共4個(gè)組別。
[0024] (2)模型通過高脂飼料誘導(dǎo)操作流程： 采用WT和K0小鼠，建立DI0模型，進(jìn)行表型相關(guān)分析，明確A20基因?qū)χ靖?、II型糖 尿病發(fā)揮的作用。選用8周齡，雄性，WT小鼠和A20-K0小鼠，分別給與兩種特殊飼料D12942 高脂飼料（Highfat diet，HFD)和 D12450B 低脂飼料（Normal chow，NC)飼養(yǎng)，即 WT NC 組， KO NC組，WT HFD組，KO HFD組共4個(gè)組別。每周均詳細(xì)記錄小鼠攝食量，小鼠空腹體重和 空腹血糖每隔4周檢測1次。實(shí)驗(yàn)第14周，進(jìn)行腹腔注射葡萄糖實(shí)驗(yàn)（IPGTT)，以評(píng)價(jià)小鼠 機(jī)體對(duì)葡萄糖耐受能力。第16周終末取材，取出小鼠肝臟拍照，然后一部分置于甲醛溶液 中固定或〇· C. T冰凍切片包埋劑（Tissue Freezing Medium)包埋作為病理分析用。
[0025] 實(shí)施例2小鼠體重、血糖水平測定 (1)小鼠空腹體重，食量檢測 1)體重檢測 ①禁食：上午8:00將待實(shí)驗(yàn)小鼠禁食(不禁水)，下午2:00開始實(shí)驗(yàn)操作。
[0026] ②稱重：分別在第0周、4周、8周、12周、16周稱重，將一塑料小桶放在動(dòng)態(tài)電子天 平上，抓起小鼠，放入稱量小桶中，測量體重記錄數(shù)據(jù)。飼料量檢測：待稱體重操作完成后， 給小鼠加飼料，并在動(dòng)態(tài)電子天平上記錄小鼠的飼料量。
[0027] (2 )空腹血糖水平檢測實(shí)驗(yàn) 將所有待實(shí)驗(yàn)的小鼠從上午8:00至下午2:00間禁食(不禁水)，即禁食6小時(shí)后開始 實(shí)驗(yàn)操作。
[0028] ①血糖儀準(zhǔn)備：檢查血糖儀(美國強(qiáng)生公司，0NET0UCH)電池，按右側(cè)開關(guān)，將試紙 正確放入左側(cè)插槽，屏幕顯示與血糖試紙條相應(yīng)代碼的數(shù)字，隨后顯示滴血圖案，提示血糖 儀進(jìn)入待測狀態(tài)。
[0029] ②固定小鼠：右手抓鼠尾，左手持一塊毛巾，將毛巾對(duì)折，用拇指和食指捏住毛巾 對(duì)折處，將鼠頭部和身體包入手掌內(nèi)的毛巾，拇指和食指在將鼠尾根部固定。
[0030] ③剪尾：眼科剪迅速在距鼠尾末端0. l-o. 2cm處剪下鼠尾，待血滴自行流出。
[0031] ④血糖檢測：將血糖儀試紙邊緣輕觸血滴，血液浸入試紙，血糖儀倒計(jì)時(shí)5秒顯示 讀數(shù)。
[0032] II型糖尿病損傷嚴(yán)重程度的評(píng)估指標(biāo)主要包括體重、血糖等水平，體重、血糖變化 結(jié)果如圖1所示，WT小鼠在給與HFD飼料飼養(yǎng)后，從第8周開始體重明顯高于其NC飼料組， 給與A20-K0小鼠16周的HFD飼料和NC飼料飼養(yǎng)后，從第4周開始HFD組的A20-K0小鼠 體重明顯高于HFD組的WT小鼠體重，一直持續(xù)到第16周（見圖1A);經(jīng)空腹血糖檢測發(fā)現(xiàn) 在HFD組的小鼠從第4周、8周、12周、16周的空腹血糖水平明顯較相應(yīng)NC對(duì)照組升高，且 HFD組的A20-K0小鼠空腹血糖水平也明顯高于WT小鼠空腹血糖水平(見圖1B)。表明A20 基因敲除后顯著影響了小鼠在HFD飼養(yǎng)狀態(tài)下的糖代謝穩(wěn)態(tài)，A20基因能顯著提高小鼠的 糖代謝穩(wěn)態(tài)，表明A20在高脂誘導(dǎo)引起的II型糖尿病中起到重要作用。
[0033] 實(shí)施例 3 葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)（intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT) 實(shí)驗(yàn)第14周，進(jìn)行腹腔注射葡萄糖實(shí)驗(yàn)（IPGTT)，以評(píng)價(jià)小鼠機(jī)體對(duì)糖耐受能力。
[0034] ( 1)在測血糖之前，先測量小鼠的空腹體重，根據(jù)10 μ L/g計(jì)算葡萄糖的注射體 積。
[0035] (2)先檢測葡糖糖注射前即0分鐘時(shí)空腹血糖，在檢測完畢后迅速經(jīng)腹腔注射葡 萄糖液。
[0036] (3)腹腔注射操作方法：①固定小鼠；抓起小鼠，左手的小指和無名指抓小鼠的尾 巴，另三手指抓住小鼠的頸部，使小鼠的頭部向下，將小鼠腹部充分暴露。②進(jìn)針定位及注 射：從腹部一側(cè)進(jìn)針右手持注射器，將尖端與小鼠腹部成45°的夾角，進(jìn)針，回抽，注射時(shí) 針頭在腹部皮下穿行一小段距離，穿過腹中線后在腹部另一側(cè)進(jìn)入腹腔，注射完藥物后，緩 緩拔出針頭，并輕微旋轉(zhuǎn)針頭，防止漏液。
[0037] (4)分別于腹腔注射后15分、30分、60分、120分鐘時(shí)間點(diǎn)剪尾測小鼠血糖值，并 記錄血糖數(shù)值和檢測時(shí)間。
[0038] 進(jìn)一步通過腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)（intraperitoneal glucose tolerancetests，IPGTT)來評(píng)估各組小鼠對(duì)葡萄糖的處理能力，在實(shí)驗(yàn)第14周，通過注射 1. Og/kg體重的葡萄糖后，HFD組的WT小鼠和A20-K0小鼠血糖水平在15分鐘時(shí)間點(diǎn)劇增 達(dá)到峰值，隨著時(shí)間推移至注射后60分鐘，兩組小鼠血糖水平稍微下降，但仍處于高于空 腹血糖水平（〇分鐘時(shí)血糖)，在2小時(shí)時(shí)恢復(fù)至空腹血糖水平，且A20-K0小鼠血糖水平從 0分鐘至2小時(shí)一直處于高于WT小鼠的血糖水平（圖2A)。比較各組小鼠血糖曲線下面積 (area under the curve, AUC)，發(fā)現(xiàn) WT 小鼠 HFD 組的 AUC 顯著高于 NC 組，A20-K0 HFD 組的 AUC顯著大于WT HFD組的AUC (圖2B)，表明A20基因敲除顯著促進(jìn)糖代謝紊亂。
[0039] 實(shí)施例4肝臟大體外觀及肝臟組織脂質(zhì)成分測定 (1)終末肝臟組織取材 1)小鼠稱重后，迅速脫頸處死。仰臥固定小鼠，用蒸餾水將小鼠胸部，腹部毛發(fā)潤濕。
[0040] 2)用一鑷子鉗夾小鼠腹部正中皮膚，沿腹部正中向頭部剪開皮膚至劍突下，向尾 端剪開皮膚，逐層暴露皮下筋膜，肌肉等，打開腹腔，充分暴露各臟器。
[0041] 3)迅速找到并取下小鼠的肝臟，將取下的肝臟標(biāo)本置于滅菌紗布上，拭干肝臟表 面上殘留血液，將肝臟置于無菌培養(yǎng)皿中，迅速拍照，稱重。
[0042] 4)石蠟標(biāo)本：切取部分肝臟置于10%中性福爾馬林中固定。冰凍標(biāo)本：切取部分 肝臟，置于有0CT的錫紙模具中包埋，放在干冰上冰凍固定。
[0043] 2.肝臟組織處理及病理染色相關(guān)實(shí)驗(yàn) 1)肝臟脫水，透明，浸蠟 切取10%中性福爾馬林中固定好的部分肝葉組織于標(biāo)記的包埋框內(nèi)，在小流量流水沖 洗30分鐘以上。按照以下流程在機(jī)器上設(shè)置以下程序，①脫水：75%酒精（45分鐘）一75% 酒精（45分鐘）一85%酒精（45分鐘）一85%酒精（45分鐘）一95%酒精（45分鐘）一95%酒 精（45分鐘）一無水酒精（1小時(shí)）一無水酒精（1小時(shí)）；②透明：二甲苯（1小時(shí)）一二甲苯 (1小時(shí)）；③浸蠟（65°C):石蠟（1小時(shí)）一石蠟（1小時(shí))。待組織沖洗完畢后，將包含組織 的包埋框裝進(jìn)機(jī)器籃筐內(nèi)，啟動(dòng)上述程序。上述程序完成后，取出組織包埋框送病理室包埋 組織，同時(shí)清洗機(jī)器備用。
[0044] 2)肝臟組織切片 使用切片機(jī)切片(切片厚度5 μ m)。
[0045] 3 )肝臟組織蘇木精-伊紅（HE )染色 將肝臟組織石蠟切片放入65°C烘箱（30分鐘）一二甲苯中（5分鐘X3次）一100%酒 精（1分鐘）一90%酒精（1分鐘）一70%酒精（1分鐘）一蒸餾水洗一蘇木素 （5分鐘）一自來 水洗去切片上的浮色一1%鹽酸酒精（1至3秒)一自來水洗數(shù)下一Scott促藍(lán)液(碳酸氫鈉 〇. 35g，硫酸鎂2g，蒸餾水100ml) (1分鐘）一自來水洗數(shù)下一伊紅（1分鐘）一蒸餾水洗去 切片上的浮色一70%酒精一下一90%酒精一下一100%酒精（30秒X3次）一二甲苯（2分 鐘X3次）一在二甲苯未干時(shí)封片，拍照。
[0046] 4)肝臟組織油紅0染色 ①將冰凍肝臟組織切片在通風(fēng)櫥中風(fēng)干30分鐘，4%多聚甲醛固定10分鐘。置于雙蒸 水中稍洗10分鐘，以除去組織表明的多聚甲醛。
[0047] ②以60%異丙醇處理1分鐘。
[0048] ③用油紅0 (公司sigma，貨號(hào)00625,濃度0. 5克/100mL 100%異丙醇)染色30分 鐘。
[0049] ④之后以60%異丙醇漂洗1分鐘X 3次，直至背景干凈。
[0050] ⑤用Mayer' s蘇木素染液（5滴）淡染細(xì)胞核。
[0051] ⑥水漂洗，稀碳酸鋰水溶液中促藍(lán)，充分水洗，水洗至細(xì)胞核藍(lán)化。
[0052] ⑦用甘油明膠封片，拍照。
[0053] 肝臟大體外觀測定結(jié)果見圖3所示，通過大體取材拍照，觀察到在HFD組的A20-K0 小鼠的肝臟體積稍較HFD組的WT小鼠的肝臟大，且A20-K0小鼠肝臟色澤泛黃，油脂較多 (如圖3A)。在HFD組的A20-K0小鼠無論肝臟重量還是肝臟重量與小鼠本身體重比值均較 HFD組的WT小鼠高(如圖3B)。進(jìn)一步通過組織切片，進(jìn)行HE和油紅0染色，顯微鏡下觀察 各組小鼠肝臟組織在高脂飲食飼養(yǎng)條件下發(fā)生了顯著的病理改變。通過肝臟HE染色，可 以觀察到在HFD飼養(yǎng)條件下，WT小鼠和A20-K0小鼠肝臟組織均有脂肪沉積，可以看到NC 組小鼠的肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性、空泡化且融合連成片狀，肝臟細(xì)胞形態(tài)已幾乎完全破壞，而 A20-K0組小鼠的肝細(xì)胞形態(tài)變化更為嚴(yán)重(如圖4上)。通過肝臟油紅0染色來檢測肝組織 中脂質(zhì)，可以發(fā)現(xiàn)在HFD組的WT小鼠的肝門靜脈周圍呈大片紅色，提示有大量的脂質(zhì)沉積， 而在HFD組的A20-K0小鼠的肝門靜脈周圍的脂質(zhì)沉積更顯著(如圖4下)。這些結(jié)果說明 A20基因敲除后，小鼠的脂肪肝病癥明顯惡化。
[0054] 上述結(jié)果顯示A20-K0小鼠在HFD的誘導(dǎo)下發(fā)生的II型糖尿病和脂肪肝病變顯著 加重。這些結(jié)果表明A20基因?qū)Ω纳艻I型糖尿病和脂肪肝具有顯著的作用。本發(fā)明結(jié)果說 明A20基因在脂肪肝、II型糖尿病疾病模型中有著重要的保護(hù)作用。
[0055] 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 鋅指蛋白A20在制備預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝疾病藥物中的應(yīng)用。
2. -種預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝疾病的藥物，其特征在于：包含鋅指蛋白A20。
3. 鋅指蛋白A20在制備預(yù)防、緩解和/或治療糖尿病藥物中的應(yīng)用。
4. 一種預(yù)防、緩解和/或治療糖尿病的藥物，其特征在于：包含鋅指蛋白A20。
【文檔編號(hào)】A61P1/16GK104043108SQ201410321961
【公開日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2014年7月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月8日
【發(fā)明者】李紅良, 張曉東, 汪濤, 杜成 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)