專利名稱：一種篩選鋅指蛋白的篩選系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于鋅指蛋白的篩選技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種篩選鋅指蛋白的篩選系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因動物有著廣泛的應用前景，通過基因打靶技術(shù)可以實現(xiàn)外源基因的定點整合，其表達可以實現(xiàn)精確調(diào)控并不影響宿主細菌自身基因表達調(diào)控?；虼虬兄饕蕾囉谕粗亟M，自然條件下同源重組發(fā)生的幾率很低，約為百萬之一，這就大大的限制了這一技術(shù)的廣泛應用。如何提高基因打靶效率已經(jīng)成為目前研究的重點和熱點。鋅指蛋白是一類具有手指狀結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，在基因表達調(diào)控、細胞分化、胚胎發(fā)育、增強植物抗逆性等方面具有重要的作用。1996年Kim等發(fā)現(xiàn)，將已知的識別特異DNA序列的鋅指結(jié)構(gòu)與限制性內(nèi)切酶FokI中無特異性識別作用的切割結(jié)構(gòu)域通過一個“l(fā)inker”融合表達,可以組合成一個新的限制性內(nèi)切酶-鋅指核酸酶(zinc fingernuclease, ZFN)，識別和切割位點由其中的鋅指結(jié)構(gòu)決定。ZFN是由兩部分組成，包括一個DNA結(jié)合域和一個非特異性核酸內(nèi)切酶。其工作原理是DNA結(jié)合域與特定DNA結(jié)構(gòu)結(jié)合，與之相連的非特異性核酸內(nèi)切酶隨之發(fā)揮剪切作用，在結(jié)合位點產(chǎn)生斷裂，促進同源重組，提高定點突變和置換頻率。研究表明，通過特異性鋅指核酸酶可以提聞基因打祀效率。鋒指核酸酶的關(guān)鍵在于篩選聞特異性、聞未和力的鋒指蛋白。鋅指蛋白的獲取方法主要有篩選法和模塊組裝法。模塊組裝法的優(yōu)點在于簡易快速簡單將各鋅指模塊連接用于識別目標序列。缺點在于設(shè)計出的聯(lián)體鋅指親和力較低或者沒有親和力。隨著鋅指結(jié)合DNA機制深入研究，該方法將會成為一種高效的方法；篩選法可信度較高，但比模塊組裝法耗時。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種篩選鋅指蛋白的篩選系統(tǒng)，利用報告載體替代現(xiàn)有的細菌篩選系統(tǒng)必須將序列整合進細菌基因組里進行篩選的方法，篩選過程高效簡潔。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)—種篩選鋅指蛋白的篩選系統(tǒng)，包括兩個報告載體pReport_Nl-LacZ、pReport-N2-EGFP 和一個激活載體 pAD-RNAP_alpha_GAL4 ；所述的報告載體pReport-Nl-LacZ包括鋅指核酸酶識別序列插入位點、核糖體結(jié)合位點和啟動子，在啟動子的下游設(shè)有報告基因LacZ和抗生素篩選基因；所述的報告載體pReport-N2-EGFP包括鋅指核酸酶識別序列插入位點、核糖體結(jié)合位點和啟動子，在啟動子的下游設(shè)有報告基因EGFP和抗生素篩選基因； 所述的激活載體pAD-RNAP-alpha-GAL4包括RNA聚合酶α和激活元件GAL4。所述的報告載體pReport-Nl-LacZ的鋅指核酸酶識別序列插入位點、核糖體結(jié)合位點和啟動子的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示；
所述的報告載體pReport-N2_EGFP的鋅指核酸酶識別序列插入位點、核糖體結(jié)合位點和啟動子的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。所述的報告載體pReport-Nl-LacZ和pReport-N2_EGFP上均設(shè)有單拷貝控制元件。所述的報告載體pR印ort-Nl-LacZ中的抗生素篩選基因為aada基因，報告基因LacZ和aada基因通過串聯(lián)表達序列相連接；所述的報告載體pReport-N2_EGFP中的抗生素篩選基因為aada基因，報告基因EGFP和aada基因通過串聯(lián)表達序列相連接；串聯(lián)表達序列的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示。所述的激活載體pAD-RNAP-alpha_GAL4中的RNA聚合酶a和激活元件GAL4通過 表達五個氨基酸殘基的linker序列連接。所述的五個氨基酸殘基為Gly-Ser-Ala-Ala-Ala。所述的報告載體pReport-Nl-LacZ、報告載體pReport-N2_EGFP中還通過鋅指核酸酶識別序列插入位點插入鋅指核酸酶識別序列。所述的鋅指蛋白識別序列為SEQ. ID. NO. 4 SEQ. ID. NO. 9所示的一種。所述的報告載體pR印ort-Nl-LacZ和激活載體pAD-RNAP-alpha_GAL4共轉(zhuǎn)染于宿主細菌，構(gòu)成LacZ報告系統(tǒng)；所述的報告載體pR印ort-N2_EGFP和激活載體pAD-RNAP-alpha_GAL4共轉(zhuǎn)染于宿主細菌，構(gòu)成EGFP報告系統(tǒng)。分別在LacZ報告系統(tǒng)和EGFP報告系統(tǒng)中轉(zhuǎn)染待篩選的設(shè)有隨機鋅指蛋白和GALllP元件的隨機鋅指庫質(zhì)粒；然后添加抗生素進行篩選陽性克隆，并根據(jù)報告基因的表達篩選出鋅指蛋白質(zhì)粒；再將LacZ報告系統(tǒng)篩選到的鋅指蛋白質(zhì)粒通過EGFP報告系統(tǒng)篩選，將EGFP報告系統(tǒng)篩選到的鋅指蛋白質(zhì)粒通過LacZ報告系統(tǒng)篩選。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明提供的篩選鋅指蛋白的篩選系統(tǒng)，是一種適用于從隨機鋅指質(zhì)粒庫中與鋅指核酸酶識別序列相配合、識別的鋅指蛋白，通過構(gòu)建三種元件的配合，構(gòu)建兩套篩選系統(tǒng)，再通過這兩套系統(tǒng)的交互篩選提高鋅指蛋白篩選的活性。巧妙利用三種元件的配合，從而實現(xiàn)鋅指蛋白與鋅指核酸酶識別序列特異性識別與報告基因表達指不的相關(guān)報告系統(tǒng)中的啟動子包括插入位點和啟動后續(xù)報告基因的啟動子，在被激活的情況下啟動后續(xù)的Laz報告基因和EGFP報告基因，實現(xiàn)不同的報告；激活系統(tǒng)中的RNAP-alpha GAL4，其中GAL4為激活元件，RNAP為啟動報告系統(tǒng)中的啟動子；而待篩選的隨機鋅指庫質(zhì)粒中，鋅指蛋白主要是與鋅指核酸酶識別序列的結(jié)合，Galllp也是激活元件；當將設(shè)有的隨機鋅指庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到含有報告載體與激活載體都轉(zhuǎn)染到宿主細菌中，如果位于報告載體的待篩選鋅指蛋白結(jié)合位點能與隨機鋅指質(zhì)粒中的某個鋅指蛋白相互作用，則激活載體上GAL4與隨機鋅指庫質(zhì)粒上的與該鋅指蛋白序列結(jié)合的GALllP元件靠近并結(jié)合，GAL4與GALllP結(jié)合后促使RNA聚合酶a結(jié)合在報告載體的啟動子區(qū)從而激活報告基因LacZ或EGFP的表達；如果待篩選的識別位點與鋅指蛋白無相互作用則不能激活報告基因表達。而兩套系統(tǒng)的相互驗證是通過LacZ報告系統(tǒng)篩選得到的單克隆，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)入EGFP系統(tǒng)中鑒定EGFP活性；指通過EGFP報告系統(tǒng)篩選得到的單克隆，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)入LacZ系統(tǒng)中鑒定LacZ活性；通過兩種系統(tǒng)的報告提高了篩選鋅指蛋白的特異性。本發(fā)明提供的篩選鋅指蛋白的篩選系統(tǒng)，篩選容量大，效率高，毒性小的特點首先篩選系統(tǒng)利用報告載體的單拷貝性，替代過去細菌篩選系統(tǒng)必須將序列整合進細菌基因組里進行篩選的方法，篩選過程高效簡潔，細菌生長快，轉(zhuǎn)化效率高所以可以簡單且快速的檢測大量的相互作用；其次，應用細菌作為宿主避免了酵母等作為宿主，其宿主蛋白影響目的蛋白之間的相互作用；同時真核蛋白轉(zhuǎn)入酵母會對宿主產(chǎn)生毒性，轉(zhuǎn)入細菌就減少了細胞毒性的產(chǎn)生。本發(fā)明提供的篩選鋅指蛋白的篩選系統(tǒng)，以牛P酪蛋白基因上的鋅指核酸酶識別位點為靶標，設(shè)計酪蛋白基因上的鋅指核酸酶識別半位點，從隨機鋅指質(zhì)粒庫中篩選鋅指蛋白，同時通過鏈霉素篩選與LacZ和鏈霉素與EGFP兩個報告系統(tǒng)得到高特異性的鋅指蛋白，并且篩選得到的鋅指蛋白已經(jīng)在牛成纖維細胞上進行了驗證，其效果良好。


圖I 為 pRport-LacZ 質(zhì)粒圖譜；圖2 為 HindIII 與 AvrII 雙酶切 pMD19T_T_A 與 pRport-Nl 電泳圖譜；圖3 為 pRport-EGFP 質(zhì)粒圖譜；圖4 為 HindIII 和 AvrII 雙酶切 pReport_N2 和 PMD19T-T-E-A 電泳圖譜；圖5為pAD-R-G質(zhì)粒圖譜；圖6為pAD-R-G酶切鑒定電泳圖譜；圖7為NheI與ASCI雙酶切報告載體pR印ort-Nl-T-L-A電泳圖譜；圖8為PCR鑒定插入牛酪蛋白半結(jié)合位點的報告載體pR印ort-Nl-T-L-A-CN鑒定圖譜；圖9為Bsu36I酶切切報告載體pR印ort-N2-T-E_A電泳圖譜；圖10為PCR鑒定插入牛酪蛋白半結(jié)合位點的報告載體pR印ort-N2-T-E-A_CN鑒定圖譜；圖11-1 11-2為報告載體、激活載體與隨機鋅指質(zhì)粒結(jié)合篩選系統(tǒng)的原理圖；圖12為PCR鑒定篩選得到的鋅指蛋白。
具體實施例方式下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。I、報告載體 pReport-Nl-LacZ 的構(gòu)建I. I設(shè)計重疊引物LWPI，LWP2, LWP3, LWP4，通過重疊PCR獲得包含Asc I和NheI兩個酶切位點(通過這兩個酶切位點將鋅指核酸酶識別序列插入)及-35、-10(弱啟動子)、lac operator (乳糖啟動子操縱子)和RBS(核糖體結(jié)合位點)基本元件的序列；所述的引物具體為LWP-I gtacatgcat gctgtggaag ggcgcgcctg gctcgtaggc cgctagc ；LWP-2 cggaagcata aagtgtaaag cccggggtgc ctaatgctag cggcctacg ；LWP-3 ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtcg aattgtgagc ggataac ；
LWP-4 cggcctaggc ataagctttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcac。第一輪分別擴增LWP12和LWP34片段；其擴增條件分別為LWP14ul ；LWP24ul ；pfu Mix(2x)25ul ；ddH20 17ul ；LWP34ul ；LWP2/LWP44ul ；pfu Mix(2x)25ul ；ddH20 17ul ；擴增程序均為95°C3min ；95°C 30s、5(TC 30s、72DC 30s，IOcycle ；72°C IOmin ；第二輪擴增LWP1234片段；其擴增條件為LWP1212. 5ul ；LWP3412. 5ul ；pfu Mix(2x) 12. 5ul ；ddH20 12. 5ul ；擴增程序均為95°C3min ；95°C 30s、55°C 30s,72°C 30s, IOcycle ；72°C IOmin ；第三輪擴增LWP片段；其擴增條件為LWP12341ul ；LWP15ul ；LWP45ul ；pfu Mix 12. 5ul ；ddH20 12. 5ul ；擴增程序均為95°C3min ；95°C 30s、6(TC 30s,72°C 30s,30cycle ；72°C IOmin ；LffP片段PCR產(chǎn)物用2. 5%瓊脂糖電泳后，用膠回收試劑盒回收149bpDNA片段。將載體pR印ort和LWP片段分別用AvrII和SphI雙酶切后，用T4連接酶連接(16°C水浴過夜連接)后得到載體pReport-Nl。其中NI表示所構(gòu)建的啟動子，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示，通過其實現(xiàn)鋅指核酸酶識別序列的插入(Asc I和Nhe I兩個酶切位點)以及Iacz報告基因的啟動。將pReport-Nl載體轉(zhuǎn)化DH5 a感受態(tài)細胞。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布在含有IOOug/ml amp的LB固體培養(yǎng)基的平板中，37°C倒置培養(yǎng)12h后，挑去單菌落，通過菌落PCR鑒定后，選取正確單菌落測序。選取測序正確單菌落，培養(yǎng)IOOml菌液，用OMGA中提試劑盒提取質(zhì)粒。I. 2以載體pMD19T為基本骨架串聯(lián)aada基因和Iacz基因構(gòu)建pMD19T-T_L_A載體I. 2. I設(shè)計引物TES-I、TES-2通過重疊PCR擴增TES序列；TES-1、TES_2具體為TES-I5' GCCGTCGACTAACCGGGCAGGCCATGTCTGCCCGTATTTCG 3'TES-25' CGCGGATCCTTTCCTTACGCGAAATACGGGCAGACATGG 3'TES 序列的擴增體系為pfu Mix 25ul ;TES_15ul ;TES_25ul ；ddH2015ul ；擴增程序為95°C3min ；95°C 30s、57°C 30s、72°C 15s, IOcycle ；72°C 4min ;最終得到的TES序列如SEQ. ID. NO. 3所示；回收擴增的TES序列后，分別用BamH I和Sal I雙酶切載體PMD-19T和TES序列，用Solution I (Takara code D6022A)連接(16°C水浴過夜連接)后得到載體PMD19T-T ；將PMD19T-T載體轉(zhuǎn)化DH5 a感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布在含有100ug/mlamp的LB固體培養(yǎng)基的平板中，37 °C倒置培養(yǎng)12h后，挑去單菌落，通過菌落PCR鑒定后，選取正確單菌落測序。選取測序正確單菌落，培養(yǎng)IOOml菌液，用OMGA中提試劑盒提取質(zhì)粒。I. 2. 2 設(shè)計引物 Sm-F、Sm-R，以載體 pCDFDuet-1 為模板擴增 aada 片段，Sm_F、Sm-R具體為
Sm-F ggggatccat gagggaagcg gtgat ；Sm-R gctgaattcc taggtcaggc atttgagaag c ；擴增程序為95°C3min ；95°C 45s、53°C 30s、72°C 90s,30cycle ；72°C 4min ；回收擴增的aada片段后，分別用EcoR I和BamH I雙切載體pMD19T_T和aada片段，以在TES片段下游 插入鏈霉素表達基因(aada),用Solution I連接(Takara codeD6022A) (16°C水浴過夜連接)后得到載體PMD19T-T-A ；將PMD19T-T-A載體轉(zhuǎn)化DH5 a感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布在含有100ug/mlamp的LB固體培養(yǎng)基的平板中，37 °C倒置培養(yǎng)1 后，挑去單菌落，通過菌落PCR鑒定后，選取正確單菌落測序。選取測序正確單菌落，搖菌，提試劑盒提取質(zhì)粒。I. 2. 3 設(shè)計引物對 LacZ-F、LacZ_R，以載體 pLenti6/V5_GW/lacZ 為模板擴增 LacZ基因，LacZ-F, LacZ-R具體為LacZ-F gggcagcga agcttatgat agatcccgtc g ；LacZ-R cgcggtcgac ttattatttt tgacaccaga cca ；擴增程序為95V3min ；95°C 45s、6(TC 30s,72°C 5min,30cycle ；72°C IOmin ；回收擴增的LacZ，分別用Sal I和Sph I雙切載體pMD19T_T_A和LacZ，以在TES序列上游插入LacZ基因的讀碼框，用Solution I (Takara codeD6022A)連接(16°C水浴過夜連接)后得到載體PMD19T-T-L-A ；將PMD19T-T-L-A載體轉(zhuǎn)化DH5 a感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布在含有IOOug/ml amp的LB固體培養(yǎng)基的平板中，37°C倒置培養(yǎng)12h后，挑去單菌落，通過菌落PCR鑒定后，選取正確單菌落測序。選取測序正確單菌落，搖菌，提試劑盒提取質(zhì)粒。I. 2. 3 通過 HindIII 和 AvrII 雙酶切 pR印ort-Nl 和 pMD19T-T_L_A 載體，回收相應片段，連接兩片段用Solution I (Takara code D6022A)連接(16°C水浴過夜連接)得到基本報告載體pReport-Nl-LacZ(pReport-Nl-T-L-A)。其質(zhì)粒圖譜如圖I所示，可以看到上述構(gòu)建的元件的排列如下N1啟動子(RBS、Asc I/Nhe I酶切位點及_35、-10、Iacoperator、) lacZ、TES、Aada。所構(gòu)建的pR印ort-Nl和pMDlOT-T-L-A雙酶切圖譜如圖2所示，其中M為Transl5K。泳道I為pMD19T-T_L_A載體質(zhì)粒；泳道2，3為HindIII與AvrII雙酶切PMD19T-T-L-A載體結(jié)果，大小為4071bp ;泳道4，5為HindIII與AvrII雙酶切pR印ort-Nl結(jié)果，大小為12309bp ;泳道6為pReport-Nl質(zhì)粒條帶.將pReport-LacZ載體轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布在含有IOOug/ml amp的LB固體培養(yǎng)基的平板中，37°C倒置培養(yǎng)12h后，挑去單菌落，通過菌落PCR鑒定后，選取正確單菌落測序。選取測序正確單菌落，搖菌，提試劑盒提取質(zhì)粒。2、載體 pR印ort-N2_EGFP 的構(gòu)建2. I設(shè)計重疊引物EWP-1、EWP-2、EWP-3、EWP-4，通過重疊PCR獲得連續(xù)兩個Bsu361酶切位點及-35、-10、lac operator和RBS基本元件的序列,所述的引物具體為EffP-I gccatcgatt gtggaagggc gcgcctggct cgtaggccgc atgc ；EWP-2 cggaagcata aagtgtaaag cccggggtgc ctaatcctaa ggggcctac ；EWP-3 ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtcg aattgtgagc ggataac ；EWP-4cggcctaggc ataagctttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcac ；
第一輪分別擴增EWP12和EWP34片段；其擴增條件分別為EffP14ul ；EWP24ul ；pfu Mix(2x)25ul ；ddH20 17ul ；EWP34ul ；EWP2/LWP44ul ；pfu Mix(2x)25ul ；ddH20 17ul ；擴增程序均為95°C3min ；95°C 30s、5(TC 30s,72°C 30s, IOcycle ；72°C IOmin ；第二輪擴增EWP1234片段；其擴增條件為EWP1212. 5ul ；EWP3412. 5ul ；pfu Mix(2x) 12. 5ul ；ddH20 12. 5ul ；擴增程序均為95°C3min ；95°C 30s,55°C 30s,72°C 30s, IOcycle ；72°C IOmin ；第三輪擴增EWP片段；其擴增條件為EWP12341ul ；LWP15ul ；LWP45ul ；pfu Mix 12. 5ul ；ddH20 12. 5ul ；擴增程序均為95°C3min ；95°C 30s,60°C 30s,72°C 30s,30cycle ；72°C IOmin ；EWP片段PCR產(chǎn)物用2. 5%瓊脂糖電泳后，用膠回收試劑盒回收146bpDNA片段。將載體pR印ort和EWP片段分別用AvrII和Sph I雙酶切后，用T4連接酶連接(16°C水浴過夜連接)后得到載體pR印ort-N2。其中N2表示所構(gòu)建的啟動子，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示，通過其實現(xiàn)鋅指核酸酶識別序列的插入(兩個Bsu36I酶切位位點)以及EGFP報告基因的啟動。將pR印ort_N2載體轉(zhuǎn)化DH5 a感受態(tài)細胞。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布在含有IOOug/ml amp的LB固體培養(yǎng)基的平板中，37°C倒置培養(yǎng)12h后，挑去單菌落，通過菌落PCR鑒定后，選取正確單菌落測序。選取測序正確單菌落，培養(yǎng)IOOml菌液，用OMGA中提試劑盒提取質(zhì)粒。2. 2以載體pMD19T為基本骨架串聯(lián)aada基因和EGFP基因構(gòu)建pMD 19T-T-E-A載體2. 2. I設(shè)計引物對EGFP-F、EGFP-R，以載體pEGFP-Cl為模板擴增EGFP基因，EGFP-F, EGFP-R 具體為EGFP-F gctgcatgcg aagcttagg tgagcaaggg ；EGFP-R :ggagtcgact tattacttgt acagctcgtc catgcc ；
擴增程序為95V3min ；95°C 45s,60°C 30s,72°C 90s,30cycle ；72°C IOmin ；回收擴增的EGFP，分別用Sal I和Sph I雙切載體pMD19T_T_A和EGFP，用Solution I連接(16°C水浴過夜連接)，從而TES序列上游插入EGFP，得到載體PMD19T-T-E-A ；將PMD19T-T-E-A載體轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布在含有IOOug/ml amp的LB固體培養(yǎng)基的平板中，37°C倒置培養(yǎng)12h后，挑去單菌落，通過菌落PCR鑒定后，選取正確單菌落測序。選取測序正確單菌落，搖菌，提試劑盒提取質(zhì)粒。2. 2. 2 通過 HindIII 和 Avr II 雙酶切 pR印ort_N2 和 PMD19T-T-E-A 載體，回收相應片段，連接兩片段用Solution I連接(16°C水浴過夜連接)得到基本報告載體pReport-N2-EGFP (pReport-N2-T-E-A)。其質(zhì)粒圖譜如圖2所示，可以看到上述構(gòu)建的元件的排列如下N2 啟動子(RBS、兩個 Bsu36I 酶切位點及-35、-10、lac operator、)EGFP、TES (串聯(lián)表達序列)、Aada0雙酶切pR印ort-N2和PMD19T-T-E-A載體圖譜如圖4所示其中M為fransl5k ；泳道I為pR印ort-N2被HindIII和AvrII雙切，其雙切后的大小為12461bp ;泳道2為PMD19T-T-E-A被HindIII和AvrII雙切，其雙切后的大小1731bp。將pR印ort-EGFP載體轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布在含有IOOug/ml amp的LB固體培養(yǎng)基的平板中，37°C倒置培養(yǎng)12h后，挑去單菌落，通過菌落PCR鑒定后，選取正確單菌落測序。選取測序正確單菌落，搖菌，提試劑盒提取質(zhì)粒。3、激活載體 pAD-RNAP-alpha GAL4 (pAD-R-G)的構(gòu)建3. I以載體pBD-LGF2為模板擴增Gal4片段，擴增引物為Gal4-F ggcgcggccg cagaatcaa ；Gal4-R ctcgaactag ttcaaaataa tcctgttaac aat ；
擴增程序為95°C3min ；95°C 30s、57°C 45s,72°C 45s,35cycle ；72°C IOmin ；回收擴增的Gal4，分別用Not I和Spe I雙切載體pTRG和Gal4，T4DNA連接酶16 °C過夜連接后，得到載體pTRG-R-G ；將pTRG-R-G載體轉(zhuǎn)化DH5 a感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布在含有100ug/mlamp的LB固體培養(yǎng)基的平板中，37 °C倒置培養(yǎng)12h后，挑去單菌落，通過菌落PCR鑒定，選取正確單菌落測序。選取測序正確單菌落，搖菌，提試劑盒提取質(zhì)粒。3. 2以pTRG-R-G載體為模板擴增RNAP-alpha GAL4，擴增引物為28R-F ctcgaattca aataagtgcc ttcccatca ；28R-R gcgagatctc gctcagtgga acgaaaa ；擴增程序為95V3min ；95°C 45s、6(TC 45s,72°C 90s,30cycle ；72°C IOmin ；回收擴增的RNAP-alpha GAL4,分別用 BglII 與 NcoI 雙切載體 pAD 及 RNAP-alphaGAL4，T4DNA連接酶16°C過夜連接后，得到載體pAD-R-G ;其質(zhì)粒圖譜如圖5所示，可以看到目標元件RNAP-alpha GAL4克隆到相應的位置。其酶切鑒定結(jié)果如圖6所示M1為Trans2k plus DNA Marker ；M2Trans 15k DNA Marker ;1、2 為 pAD-R-G激活載體的兩個不同單克隆酶切結(jié)果，兩個片段大小分別為5582bp和885bp。4、為了驗證上述兩個報告載體，具體的以牛0酪蛋白基因上的鋅指核酸酶識別位點為靶標，設(shè)計以下酪蛋白基因上的鋅指核酸酶識別半位點具體設(shè)計以下三個鋅指核酸酶識別位點CNSl，CNS2，CNS3 (分別如SEQ. ID. NO. 4 9所示)。每個識別位點包括了左右兩個半識別位點，下劃線部分為左右兩個半結(jié)合位點序列。CNSl1882TAGAAGCAACTATAAAGATTTGTAAC 19071882ATCTTCGTTGATATTTCTAAACATTG 1907CNS2 3706CATCCTTGCCTGCCTGGTGGCTCTG 37303706GTAGGAACGGACGGACCACCGAGAC 3730CNS3 3723TGGCTCTGGCCCTTGCAAGAGAGGTA37483723ACCGAGACCGGGAACGTTCTCTCCAT3748合成CNS1、CNS2、CNS3三個位點上6個半位點引物，通過退火獲得6個半位點插入序列CNS1Y, CNS1Z, CNS2Y, CNS2Z, CNS3Y, CNS3Z。其中，Y代表鋅指核酸酶右邊的半識別位點，Z代表鋅指核酸酶左邊的半識別位點。將設(shè)計得到的酪蛋白基因上的鋅指核酸酶識別半位點分別通過Asc I和Nhe I插入pReport-Nl-T-L-A報告載體中得到報告載體pReport-Nl-T-L-A-CN,其中CN代表CNS1Y、CNS1CNS2Y、CNS2Z、CNS3Y 或 CNS3Z ；Asc I和Nhe I雙切pReport-Nl-T-L-A報告載體如圖7所不其中M為transl5k,I為質(zhì)粒，2為雙酶切條帶，大小為16360bp。PCR鑒定報告載體pR印ort-Nl-T-L-A-CN如圖8所示其中M為trans5k，1-22為挑取單克隆 PCR 鑒定條帶，條帶大小為 750bp，其 1，2，4，5，6，7，8，9，12，13，14，15， 16，19，20
為陽性克隆。同時將設(shè)計得到的酪蛋白基因上的鋅指核酸酶識別半位點通過兩個Bsu36I酶切位點插入pR印ort-N2-T-E-A報告載體中得到pR印ort-N2-T-E-A_CN，其中CN代表CNS1Y、CNS1CNS2Y、CNS2Z、CNS3Y 或 CNS3Z ；Bsu36I酶切pR印ort-N2-T-E-A報告載體如圖9所示其中M為transl5k ；1為pReport-N2-EGFP Bsu361 酶切圖，其大小為 14142bp ；2 為質(zhì)粒 pR印ort-N2_EGFP。PCR 鑒定 pR印ort-N2-T-E-A-CN 如圖 10 所示其中 M 為 trans2Kplus ;1，2 為 PCR鑒定條帶，目的條帶的大小為750bp。半位點中心位于轉(zhuǎn)錄起點-62，為最佳的結(jié)合位點。5、為了更好的實現(xiàn)鋅指蛋白的篩選，將能夠相互作用的Galllp、Gal4分別設(shè)置在隨機鋅指庫質(zhì)粒和激活載體當中。Gal I Ip可以與Gal4兩者相互作用，能夠調(diào)控啟動子轉(zhuǎn)錄與否，已被廣泛應用于蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)或做研究中，如細菌雙雜交系統(tǒng)和酵母雙雜交系統(tǒng)。如圖11-1、11-2所示，當將設(shè)有的隨機鋅指庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到含有報告載體與激活載體都轉(zhuǎn)染到宿主細菌中，如果位于報告載體的待篩選鋅指蛋白結(jié)合位點能與隨機鋅指質(zhì)粒中的某個鋅指蛋白相互作用，則激活載體上GAL4與隨機鋅指庫質(zhì)粒上的與該鋅指蛋白序列結(jié)合的GALllP元件靠近并結(jié)合，GAL4與GALllP結(jié)合后促使RNA聚合酶a結(jié)合在報告載體的啟動子區(qū)從而激活報告基因LacZ或EGFP的表達(圖11_1所示)；如果待篩選的識別位點與鋅指蛋白無相互作用則不能激活報告基因表達(圖11-2所示)。6、鋅指蛋白的篩選及條件優(yōu)化I)將pAD-R-G載體轉(zhuǎn)入DH5a中制備感受態(tài)細胞(參照分子克隆第二版超級感受態(tài)的制備方法)，然后其中一部分轉(zhuǎn)入PR印ort-Nl-T-L-A-CN報告載體得到包含兩種質(zhì)粒的菌株DH5a-L，另一部分轉(zhuǎn)入pR印ort-N2-T-E-A-CN報告載體得到包含兩種質(zhì)粒的菌株DH5a~E02)分別用包含兩種質(zhì)粒的菌株DH5a_L與菌株DH5a_E制備電轉(zhuǎn)化細胞接菌1%的新鮮菌種于SOB液體培養(yǎng)液，37°C培養(yǎng)8-10h至OD為0. 8-1. 0之間，接Iml菌液于IOOml滅菌SOC培養(yǎng)液中于25 V _37°C培養(yǎng)，待OD為0. 6時，收集IOOml菌體，4°C，3000g離心5min，去上清，10%甘油洗菌體，4°C，5000g離心5min，重復兩次，用400ull0%甘油懸浮菌體，以上步驟都在冰上操作。3)電轉(zhuǎn)化條件將鋅指蛋白庫質(zhì)粒濃度IOug到20ug每Iul為一梯度加入制備好的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞中，1500-2500v電擊5ms，冰上放置6min_8min，加入SOC培養(yǎng)液，37 °C，120rpm搖菌lh，將搖菌所得的菌體涂于多種抗生素的固體培養(yǎng)基上篩選。調(diào)整各種抗生素的濃度，調(diào)整好培養(yǎng)液、培養(yǎng)基中葡萄糖的用量。電擊杯規(guī)格Gap(mm)2. 0,Minimum Volume40 u I,Maximum Volume 400 u I0電轉(zhuǎn)化隨機鋅指庫，將鋅指庫質(zhì)粒加入制備的電轉(zhuǎn)化細胞中，冰上操作。電擊1800v-2500v，5ms。
電擊后冰上放置6min，然后加入SOC液體培養(yǎng)液，37°C，120rpm培養(yǎng)Ih后涂含多種抗生素的固體培養(yǎng)基上，37°C倒置培養(yǎng)。挑取單克隆鑒定。并且LacZ報告系統(tǒng)中要加入X_gal用來顯示LacZ的活性。4)鋅指蛋白的篩選及條件優(yōu)化結(jié)果制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞最佳的搖菌溫度為26. 7°C，確定電轉(zhuǎn)化時最佳的電擊條件為2000v, 5ms,細胞的損傷最小。確定最終的抗生素濃度kan為30ug/m ；Cm為34ug/ml ；Amp為50ug/ml ；Sm的濃度
<80ug/ml，0. 2% gluclose, IPTG 為 50uM。5)在報告載體報告表達后，PCR鑒定篩選得到的鋅指蛋白，結(jié)果如圖12所示其中M為 50bpmarker (從下而上為 50bp, IOObp, 150bp, 200bp, 250bp, 300bp, 400bp, 500bp) 1-7 為篩選得到菌株質(zhì)粒PCR結(jié)果，片段大小為273bp。6)鋅指蛋白EGFP/LacZ活性的測定篩選得到的鋅指蛋白抗鏈霉素濃度高達80ug/ml，得到的鋅指蛋白測定EGFP/LacZ活性。提取所得單克隆的質(zhì)粒，經(jīng)過兩次重接與兩次重轉(zhuǎn)得到純度較高的隨機鋅指蛋白質(zhì)粒，將LacZ系統(tǒng)篩選到的鋅指蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)EGFP系統(tǒng)，測定其EGFP強度；將EGFP系統(tǒng)篩選到的鋅指蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)LacZ系統(tǒng)測定其LacZ活性。兩種系統(tǒng)的交互使用加強了篩選得到的鋅指蛋白的可信度。PCR并測序鑒定所篩選到的鋅指蛋白。其中Lac活性測定的方法從玻璃皿中挑取篩選得到的單克隆，接于含多種抗生素(kan 為 30ug/m ；Cm 為 34ug/ml ；Amp 為 50ug/ml ；Sm 的濃度為 40ug/ml)的 soc 培養(yǎng)液中，37°C,200rpm過夜搖菌。將過夜搖得的菌液IOOul接于新鮮的soc培養(yǎng)液中37°C，200rpm搖至OD至0.8左右。收集菌體(12000rpm離心Imin),用Z Buffer洗劑菌體2次以除去殘留的培養(yǎng)液，稀釋菌體使得其od600介于0. 8左右，將所得的菌液200ul加入96孔板中用od儀準確測定每個菌液0D600值，以pR印rorT-Nl-LacZ質(zhì)粒菌株為對照組，以Z Buffer溶液為誤差對照組。取IOOul菌液加入Ilul的裂解液A，室溫下裂解15min。將Z Buffer含巰基乙醇135ul，30ml 4mg/ml的ONPG混勻加入9孔板中然后將所得的裂解液取15ul加入，混勻。應用動態(tài)法測定0D420值，測定50分鐘內(nèi)0D420值的變化，每隔50秒測定一次，以Z Buffer含巰基乙醇及ONPG混合物做對照組。以時間軸對得到的0D420值作圖，所得的趨勢線斜率為ONPG的裂解速率(V)，利用公式LacZ活性=V*1000/0D600得到最終的LacZ活性。測得Iacz活性如表I所示，相對于對照組，實驗組即篩選得到的鋅指蛋白明顯提高了 Iacz的活性。表I篩選的鋅指蛋白的Iacz的活性
權(quán)利要求
1.ー種篩選鋅指蛋白的篩選系統(tǒng),其特征在于，包括兩個報告載體pReport-Nl-LacZ、pReport-N2-EGFP 和一個激活載體 pAD-RNAP_alpha_GAL4 ； 所述的報告載體pReport-Nl-LacZ包括鋅指核酸酶識別序列插入位點、核糖體結(jié)合位點和啟動子，在啟動子的下游設(shè)有報告基因LacZ和抗生素篩選基因； 所述的報告載體pReport-N2-EGFP包括鋅指核酸酶識別序列插入位點、核糖體結(jié)合位點和啟動子，在啟動子的下游設(shè)有報告基因EGFP和抗生素篩選基因； 所述的激活載體pAD-RNAP-alpha-GAL4包括RNA聚合酶α和激活元件GAL4。
2.如權(quán)利要求I所述的篩選鋅指蛋白的篩選系統(tǒng)，其特征在于，所述的報告載體pReport-Nl-LacZ的鋅指核酸酶識別序列插入位點、核糖體結(jié)合位點和啟動子的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示； 所述的報告載體pR印ort-N2-EGFP的鋅指核酸酶識別序列插入位點、核糖體結(jié)合位點和啟動子的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
3.如權(quán)利要求I所述的篩選鋅指蛋白的篩選系統(tǒng)，其特征在于，所述的報告載體pReport-Nl-LacZ和pReport-N2_EGFP上均設(shè)有單拷貝控制元件。
4.如權(quán)利要求I所述的篩選鋅指蛋白的篩選系統(tǒng)，其特征在干，所述的報告載體pReport-Nl-LacZ中的抗生素篩選基因為aada基因，報告基因LacZ和aada基因通過串聯(lián)表達序列相連接； 所述的報告載體PR印ort-N2-EGFP中的抗生素篩選基因為aada基因，報告基因EGFP和aada基因通過串聯(lián)表達序列相連接； 串聯(lián)表達序列的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示。
5.如權(quán)利要求I所述的篩選鋅指蛋白的篩選系統(tǒng)，其特征在干，所述的激活載體pAD-RNAP-alpha-GAL4中的RNA聚合酶α和激活元件GAL4通過表達五個氨基酸殘基的linker序列連接。
6.如權(quán)利要求5所述的篩選鋅指蛋白的篩選系統(tǒng)，其特征在干，所述的五個氨基酸殘基為 Gly-Ser-Ala-Ala-Ala。
7.如權(quán)利要求I所述的篩選鋅指蛋白的篩選系統(tǒng)，其特征在干，所述的報告載體pReport-Nl-LacZ、報告載體pReport-N2_EGFP中還通過鋅指核酸酶識別序列插入位點插入鋅指核酸酶識別序列。
8.如權(quán)利要求7所述的篩選鋅指蛋白的篩選系統(tǒng)，其特征在于，所述的鋅指蛋白識別序列為SEQ. ID. NO. 4 SEQ. ID. NO. 9所示的ー種。
9.如權(quán)利要求7所述的篩選鋅指蛋白的篩選系統(tǒng)，其特征在于，所述的報告載體pReport-Nl-LacZ和激活載體pAD-RNAP-alpha_GAL4共轉(zhuǎn)染于宿主細菌，構(gòu)成LacZ報告系統(tǒng)； 所述的報告載體PR印ort-N2-EGFP和激活載體pAD-RNAP-alpha_GAL4共轉(zhuǎn)染于宿主細菌，構(gòu)成EGFP報告系統(tǒng)。
10.如權(quán)利要求7所述的篩選鋅指蛋白的篩選系統(tǒng)，其特征在干，分別在LacZ報告系統(tǒng)和EGFP報告系統(tǒng)中轉(zhuǎn)染待篩選的設(shè)有隨機鋅指蛋白和GALllP元件的隨機鋅指庫質(zhì)粒；然后添加抗生素進行篩選陽性克隆，井根據(jù)報告基因的表達篩選出鋅指蛋白質(zhì)粒；再將LacZ報告系統(tǒng)篩選到的鋅指蛋白質(zhì)粒通過EGFP報告系統(tǒng)篩選，將EGFP報告系統(tǒng)篩選到的鋅指蛋白質(zhì)粒通過LacZ報告系統(tǒng) 篩選。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種篩選鋅指蛋白的篩選系統(tǒng)，包括兩個報告載體pReport-N1-LacZ、pReport-N2-EGFP和一個激活載體pAD-RNAP-alpha-GAL4。通過構(gòu)建三種元件的配合，構(gòu)建兩套篩選系統(tǒng)，利用三種元件的配合，從而實現(xiàn)鋅指蛋白與鋅指核酸酶識別序列特異性識別與報告基因表達指示的相關(guān)，再通過這兩套系統(tǒng)的交互篩選提高鋅指蛋白篩選的活性。兩套系統(tǒng)交互驗證，提高了篩選鋅指蛋白的特異性。
文檔編號C12Q1/02GK102660642SQ20121012288
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月24日
發(fā)明者張涌, 楊力俠, 王小海, 郭澤坤 申請人:楊凌科元克隆股份有限公司, 西北農(nóng)林科技大學