下調(diào)鋅指蛋白A20表達(dá)的siRNA及其用途
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及能夠下調(diào)鋅指蛋白A20的siRNA分子，以及所述siRNA分子用于下調(diào)鋅指蛋白A20、促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和用于制備治療急性髓性白血病的藥物中的用途。本發(fā)明還涉及鋅指蛋白A20的表達(dá)下調(diào)或沉默后得到的樹(shù)突狀細(xì)胞，所述樹(shù)突狀細(xì)胞優(yōu)選為AML腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的樹(shù)突狀細(xì)胞（AML-DC）；本發(fā)明還涉及所述樹(shù)突狀細(xì)胞用于激活CTL和/或T細(xì)胞，以及用于制備治療急性髓性白血病的藥物中的用途。本發(fā)明建立了一種增強(qiáng)DC疫苗抗AML免疫應(yīng)答的新方法，為AML的免疫治療開(kāi)辟了一個(gè)新方向。
【專(zhuān)利說(shuō)明】下調(diào)鋅指蛋白A20表達(dá)的siRNA及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及小干擾RNA分子及其用途，特別是能夠下調(diào)鋅指蛋白A20的小干擾RNA(siRNA)分子，以及所述SiRNA分子用于下調(diào)鋅指蛋白A20、促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和用于制備治療急性髓性白血病的免疫細(xì)胞或藥物的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]急性髓性白血病(Acute myeloid leukemia, AML)是一類(lèi)我國(guó)常見(jiàn)且預(yù)后很差的惡性血液病腫瘤，目前仍有大量病人對(duì)常規(guī)治療(化療，造血干細(xì)胞移植，生物靶向治療等)不敏感或治療后復(fù)發(fā)，其中白血病微小殘留病灶(Minimal residual disease,MRD)是治療復(fù)發(fā)的主要障礙[1_2]。近年來(lái)，腫瘤的細(xì)胞免疫治療已經(jīng)成為繼手術(shù)、放療、化療后的第四種腫瘤治療模式，并以安全有效，副作用小等優(yōu)點(diǎn)逐漸被廣大的醫(yī)務(wù)工作者和患者認(rèn)可[3]。目前認(rèn)為AML病人在化療或者造血干細(xì)胞移植治療后，輔以特異的個(gè)體化生物免疫治療,有利于抑制或者消除殘留白血病(MRD)，延緩復(fù)發(fā)，取得良好的預(yù)后[4]。在AML細(xì)胞生物免疫治療中，以樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cell, DC)遞呈腫瘤抗原誘導(dǎo)機(jī)體特異性抗腫瘤免疫的腫瘤生物治療已成為目前臨床試驗(yàn)研究的熱點(diǎn)。
[0003]樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DC)是人體內(nèi)功能最強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞，具有攝取、加工抗原，以MHC 1、II類(lèi)肽結(jié)合物的形式遞呈抗原并促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞增殖的能力，在天然免疫和獲得性免疫中都發(fā)揮著極其重要的作用。隨著對(duì)DC攝取、遞呈抗原機(jī)理的不斷認(rèn)識(shí)，DC培養(yǎng)方法的不斷成熟和完善，針對(duì)腫瘤的弱免疫原性、抗原調(diào)變現(xiàn)象、MHC分子下調(diào)或缺失、抗原加工遞呈障礙等免疫特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的DC疫苗已成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。這些發(fā)展為開(kāi)辟腫瘤的生物治療新途徑奠定了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。目前應(yīng)用比較多的是DC主要來(lái)源于正常細(xì)胞，即供者正常外周血和病人治療緩解期正常造血狀態(tài)下分離的DC細(xì)胞。但是正常細(xì)胞(包括供者)來(lái)源的DC也存在諸多不足:1:來(lái)源較少，不能滿(mǎn)足臨床需要；2:制備過(guò)程中需要抗原負(fù)載步驟；3:容易引發(fā)遲發(fā)型超敏反應(yīng)等問(wèn)題[5_6]。有研究者發(fā)現(xiàn)了AML病人本身的AML腫瘤細(xì)胞也能誘導(dǎo)出DC樣的細(xì)胞(即AML-DC)，并應(yīng)用于臨床，因此我們進(jìn)行生物免疫治療所采用的細(xì)胞也包括AML-DC。
[0004]AML-DC的發(fā)現(xiàn):1998年奧地利學(xué)者Oehler在研究粒細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)在較高
純度的乳鐵蛋白存在的條件下，晚幼粒細(xì)胞的發(fā)育途徑可以發(fā)生逆轉(zhuǎn)，在GM-CSF、IL-4和
TNF- α存在的條件下，顛倒粒細(xì)胞成熟路徑可以產(chǎn)DC樣細(xì)胞，具有DC細(xì)胞的形態(tài)和表型，
甚至有抗原遞呈能力[7]。這為我們提供了利用髓性腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化產(chǎn)生DC的機(jī)會(huì)。近
些年來(lái)研究的比較成功的是CML-DC和AML-DC [8]。CML-DC成熟度較高，能有效刺激同種異
體T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，并在臨床中有了一定的應(yīng)用[9]。通過(guò)體內(nèi)擴(kuò)增AML-DC，發(fā)現(xiàn)其表型和功
能存在缺陷，并且分化不夠徹底，去除誘導(dǎo)劑后會(huì)發(fā)生逆轉(zhuǎn)，不成熟的DC會(huì)誘導(dǎo)免疫耐受。
但是AML-DC具有來(lái)源豐富，不需要抗原負(fù)載和安全性高等優(yōu)點(diǎn)，因此具有潛在的應(yīng)用前景[10]。
[0005]如何能夠彌補(bǔ)AML-DC缺陷，使之應(yīng)用于臨床，應(yīng)用的較多的有在培養(yǎng)過(guò)程中加入CD40配體，SCF, Ca2+等，但是由于AML-DC存在個(gè)體差異較大，沒(méi)有一種方法能夠做到簡(jiǎn)單適宜通用，如何更有效的促進(jìn)DC細(xì)胞的成熟，是亟待解決的技術(shù)問(wèn)題[11_13]。
[0006]A20 (tumor necrosis factor, alpha-1nduced protein3, TNFAIP3)是一種具有鋒指結(jié)構(gòu)的泛素修飾酶，它有兩個(gè)泛素編輯區(qū)(Two ubiquitin-editing domains):N末端去泛素化酶保護(hù)受體相互作用蛋白(RIP)免于降解；(:末端泛素化連接酶促進(jìn)RIP降解(A20結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1) Cl4]0這使得A20具有兩種不同的生物學(xué)效應(yīng)，即是否泛素化來(lái)調(diào)節(jié)許多關(guān)鍵分子的降解[15]。近年來(lái)的研究表明A20能夠通過(guò)抑制TNF和TLR (Toll-like receptor)這兩條激活途徑來(lái)影響NF- K B生物活性。其主要機(jī)制如下:
[0007](I)TNF途徑:A20的C末端有7個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，至少4個(gè)鋅指是抑制TNF介導(dǎo)的NF-κ B激活所需要的；同時(shí)Dixit等認(rèn)為A20的N端雖然具有去泛素化活性，但與抑制NF-κ B無(wú)明顯相關(guān)[16]。在TNF途徑中，TNF受體相關(guān)因子2和5 (TNF receptorassociated factor-2/5，TRAF2/5)可以使RIPl發(fā)生多泛素化，因此招集TGF-β激活酶-1(Transforming growth factor-beta-activated kinasel, TAKl)和 TAKl 結(jié)合蛋白-2(TAKl-binding protein2，TAB2)復(fù)合物，TAKl是NF-κ B激活所必需，因此RIPl的多泛素化是TNF途徑的關(guān)鍵。Dixit及其研究小組的研究指出:Α20是緊密和RIPl的去泛素化和再泛素化相關(guān)聯(lián)的。Α20可以通過(guò)C末端連接多個(gè)泛素分子，導(dǎo)致RIPl被蛋白酶體識(shí)別和降解，終止了 TNF所誘導(dǎo)的NF- κ B的激活。
[0008](2) TLR途徑:Boone [17]及其研究人員設(shè)計(jì)的體外試驗(yàn)中，A20缺陷性巨噬細(xì)胞顯示出了適應(yīng)于TLR2，TLR3和TLR9配體增高的NF- κ B的活性，提示Α20負(fù)調(diào)控多種TLR途徑。在TLR4信號(hào)通路中TRAF6 (TNF受體相關(guān)因子6，包含一個(gè)RING指域，是許多泛素E3連接酶所共有的部分)和二聚體E2 (也稱(chēng)泛素結(jié)合酶)催化生成氨基酸63(K63)_多泛素化鏈，此鏈介導(dǎo)TLR途徑中下一個(gè)成分的激活，這個(gè)成分可能是MARKKK，比如TAKl。Α20的N末端和C末端活性在此途徑中可能是相互獨(dú)立的產(chǎn)生作用。盡管在調(diào)控TLR信號(hào)中C末端泛素連接酶活性尚未得到評(píng)價(jià)，但是Boone及其研究小組的確指出了 N末端有去泛素化酶，可以去泛素化TRAF6，減弱或者終止TLR誘導(dǎo)的NF- κ B的活化。
[0009]另外，IKK Y是抑制性κ B激酶(Inhibitory κ B kinase, IKK)復(fù)合物三個(gè)組成亞基之一，它將來(lái)自上游的NIK信號(hào)傳遞給IKK α和IKK β，在使用TNF或應(yīng)答過(guò)表達(dá)TNFRl時(shí)，Α20可以通過(guò)鋅指結(jié)構(gòu)與IKKy結(jié)合，影響它的信號(hào)傳遞，進(jìn)而阻斷了 NF-κ B的激活。另外有相關(guān)研究證實(shí)，Α20在體內(nèi)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡方面也存在廣泛的調(diào)控作用[18]。
[0010]目前的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Α20在DC細(xì)胞的成熟、細(xì)胞因子產(chǎn)生及免疫刺激方面發(fā)揮重要作用，尤其在這種抗原遞呈細(xì)胞中起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[19]。Α20沉默表達(dá)使得DCs能更好的激活CTLs和Th細(xì)胞，并抑制Treg細(xì)胞。這也提供了一種在腫瘤免疫治療中以一種抗體特有的方式去對(duì)抗Treg所介導(dǎo)的抑制作用的方法[2°]。A20負(fù)向調(diào)控DCs細(xì)胞的成熟和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，A20沉默表達(dá)的DC能自發(fā)表現(xiàn)和提高共刺激分子和促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，在起始期提高T細(xì)胞的反應(yīng)性，并且通過(guò)產(chǎn)生IL-6及TNF- α來(lái)抑制Treg細(xì)胞所介導(dǎo)的自身免疫抑制作用，增強(qiáng)腫瘤浸潤(rùn)C(jī)TL細(xì)胞和Th細(xì)胞的活性，通過(guò)產(chǎn)生IL-6和腫瘤壞死因子-α (TNF-α )來(lái)抗拒Treg所介導(dǎo)的抑制作用。因此，通過(guò)研究鑒別A20作為一種抗原呈遞的負(fù)向調(diào)控因子在抗瘤免疫反應(yīng)的起始期和效應(yīng)期的控制作用，同時(shí)也提供了一種能以特異性的抗體方式對(duì)抗Treg所介導(dǎo)的抑制作用的方法，減少了 Treg直接靶細(xì)胞的需要。
[0011]綜上，通過(guò)下調(diào)鋅指蛋白A20的表達(dá)來(lái)促進(jìn)DC細(xì)胞的成熟，進(jìn)而增強(qiáng)AML患者的免疫應(yīng)答，可以為AML的免疫治療提供一種新的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明即利用RNAi技術(shù)對(duì)三種不同來(lái)源的DC細(xì)胞中的鋅指蛋白A20的表達(dá)進(jìn)行下調(diào)，以促進(jìn)DC細(xì)胞的成熟，特別是AML-DC細(xì)胞的成熟，進(jìn)而增強(qiáng)AML患者的免疫應(yīng)答，增強(qiáng)對(duì)AML腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。具體地，本發(fā)明涉及以下幾方面:
[0013]本發(fā)明的第一方面涉及下調(diào)A20表達(dá)的小干擾RNA分子，其包括正義鏈和反義鏈，其特征在于所述正義鏈或反義鏈包含選自以下(I)~(5)中任一項(xiàng)的至少一種序列:
[0014](I) SEQ ID NO:27 ~SEQ ID NO:35 中的任一序列；
[0015](2)與SEQ ID NO:27~SEQ ID NO:35中任一序列的同一性至少為70%的序列，優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少84%，更優(yōu)選至少89%，更優(yōu)選至少94%，例如為95%、96%、97%、98%、99%或100%，并具有下調(diào)A20表達(dá)的能力；
[0016](3)經(jīng)過(guò)改造的選自(I)或(2)中的序列，其是在所述序列的5’方向和/或3’方向上添加有至多30個(gè)核苷酸的序列，優(yōu)選至多20個(gè)，更優(yōu)選至多10個(gè)，更優(yōu)選至多5個(gè)，例如為4個(gè)、3個(gè)、2個(gè)或I個(gè)，并具有下調(diào)A20表達(dá)的能力；
[0017](4)經(jīng)過(guò)改造的選自(I)或(2)中的序列，其是在所述序列的基礎(chǔ)上經(jīng)一個(gè)或者幾個(gè)(例如1、2、3、4、5個(gè)、I 一 10個(gè))核苷酸的截短和/或替換，并具有下調(diào)A20表達(dá)的能力；
[0018](5)與上述(I)~(4)中任一序列對(duì)應(yīng)的DNA序列。
[0019]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述小干擾RNA分子的正義鏈選自SEQ IDNO:27~SEQID NO:35所示的序列，反義鏈為與其互補(bǔ)的序列。
[0020]為了增加穩(wěn)定性、提高轉(zhuǎn)染效率，在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述小干擾RNA分子包含選自SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:18所示序列中的至少一種序列，優(yōu)選為選自SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:12所示序列中的至少一種序列，例如為SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2退火形成的 S1-1，SEQ IDNO:3 和 SEQ ID NO:4 退火形成的 Si_2，SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 退火形成的 S1-3，SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8 退火形成的 Si_4，SEQID NO:9 和 SEQID NO: 10退火形成的S1-5和SEQ ID NO:11和SEQ IDNO: 12退火形成的Si_6 ;更優(yōu)選為S1-1。
[0021]本發(fā)明的第二方面涉及重組載體，其可操作地連接有第一方面的小干擾RNA分子。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述重組載體為連接有本發(fā)明第一方面小干擾RNA分子的Ad5/F35腺病毒載體。
[0022]本發(fā)明的第三方面涉及組合物，其含有第一方面的小干擾RNA分子或者第二方面的重組載體，以及藥學(xué)上可接受的載體。
[0023]本發(fā)明的第四方面涉及重組細(xì)胞，其包含有第一方面的小干擾RNA分子以及第二方面的重組載體。
[0024]本發(fā)明的第五方面涉及第一方面的小干擾RNA分子或者第二方面的重組載體用于下調(diào)細(xì)胞中鋅指蛋白A20表達(dá)的用途。
[0025]其中所述的細(xì)胞為樹(shù)突狀細(xì)胞前體細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞或體內(nèi)其它具有抗原遞呈能力的免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞，B細(xì)胞或者其他非專(zhuān)職抗原遞呈細(xì)胞。
[0026]所述樹(shù)突狀細(xì)胞前體細(xì)胞是指能夠通過(guò)誘導(dǎo)分化為樹(shù)突狀細(xì)胞的細(xì)胞,例如為外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)或髓系單核細(xì)胞(mo)。
[0027]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述樹(shù)突狀細(xì)胞為正常人的樹(shù)突狀細(xì)胞，AML緩解期正常造血狀態(tài)下的樹(shù)突狀細(xì)胞或者AML腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的樹(shù)突狀細(xì)胞(AML-DC)。
[0028]本發(fā)明的第六方面涉及第一方面的小干擾RNA分子或者第二方面的重組載體用于促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的用途；在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述樹(shù)突狀細(xì)胞為正常人的樹(shù)突狀細(xì)胞，AML緩解期正常造血狀態(tài)下的樹(shù)突狀細(xì)胞或者AML腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的樹(shù)突狀細(xì)胞(AML-DC)。
[0029]本發(fā)明的第七方面涉及第一方面的小干擾RNA分子或者第二方面的重組載體用于制備治療炎癥、惡性腫瘤或白血病的藥物中的用途；例如，其中所述白血病為急性髓性白血病。
[0030]本發(fā)明的第八方面涉及將鋅指蛋白A20的表達(dá)下調(diào)或沉默后得到的樹(shù)突狀細(xì)胞；在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述樹(shù)突狀細(xì)胞為正常人的樹(shù)突狀細(xì)胞，AML緩解期正常造血狀態(tài)下的樹(shù)突狀細(xì)胞或者AML腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的樹(shù)突狀細(xì)胞(AML-DC)。
[0031]其中所述將鋅指蛋白A20的表達(dá)下調(diào)或沉默的方法為，通過(guò)RNA干擾或微小RNA(microRNA, miRNA)調(diào)控的方式下調(diào)或沉默DC中鋅指蛋白A20的表達(dá)；在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述RNA干擾的方式為將第一方面的小干擾RNA分子或第二方面的重組載體導(dǎo)入樹(shù)突狀細(xì)胞中。
[0032]本發(fā)明的第九方面涉及第八方面的樹(shù)突狀細(xì)胞用于激活CTL和/或T細(xì)胞的用途；在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述CTL和/或T細(xì)胞來(lái)自AML患者。
[0033]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述激活T細(xì)胞是指T細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌量增加，所述細(xì)胞因子例如為 IL-2、IL-4、IFN- y ,TNF- α、Perforin 和 / 或 Granzyme B。所述激活 CTL細(xì)胞是指DC所誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞殺傷AML腫瘤細(xì)胞的能力增強(qiáng)，提高CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效率；所述腫瘤細(xì)胞優(yōu)選為來(lái)自AML患者。
[0034]本發(fā)明的第十方面涉及第八方面的樹(shù)突狀細(xì)胞用于制備治療炎癥、惡性腫瘤和白血病的藥物中的用途。例如，其中所述白血病為急性髓性白血病。
[0035]本發(fā)明還涉及下調(diào)A20表達(dá)的SiRNA分子所針對(duì)的靶序列，所述靶序列選自以下序列中的至少一種:
[0036](1) SEQ ID NO:27~SEQ ID NO:35中的任一序列或與其互補(bǔ)的序列；
[0037](2)與SEQ ID N0:27~SEQ ID NO:35中的任一序列的同一性至少為70%的序列，優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少84%，更優(yōu)選至少89%，更優(yōu)選至少94% ；
[0038](3)與(I)或(2)中任一序列對(duì)應(yīng)的DNA序列。
[0039]發(fā)明的有益效果
[0040]本發(fā)明研究結(jié)果表明，鋅指蛋白A20在正常細(xì)胞來(lái)源的DC和AML-DC中都起到了負(fù)向調(diào)控DC的作用，利用SiRNA下調(diào)或者沉默其表達(dá)，可以對(duì)DC細(xì)胞起到“修飾”的作用，抑制DC自體的免疫抑制通路，促進(jìn)DC成熟，激活抗白血病特異性的殺傷性T細(xì)胞(CTL)，抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)和誘導(dǎo)更強(qiáng)更持久的特異性抗AML免疫應(yīng)答，殺傷體內(nèi)殘存的腫瘤細(xì)胞(MRD)，從而建立了一種增強(qiáng)抗惡性腫瘤和白血病特別是AML特異性免疫應(yīng)答的新方法，該方法能夠降低惡性腫瘤和白血病特別是AML復(fù)發(fā)率及提高患者的生存質(zhì)量，也為惡性腫瘤和白血病特別是AML的免疫治療開(kāi)辟了一個(gè)新方向。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0041]圖1鋒指蛋白A20結(jié)構(gòu)不意圖
[0042]圖2培養(yǎng)成熟的DCs在顯微鏡下形態(tài)(顯微鏡倍數(shù)40 X )
[0043]A: AML-M2培養(yǎng)成熟的DC; B: AML-M3培養(yǎng)成熟的DC;
[0044]C:AML-M5培養(yǎng)成熟的DC;D:正常細(xì)胞來(lái)源培養(yǎng)成熟的DC
[0045]圖3AML-DCS與正常人DCs細(xì)胞表型流式分析結(jié)果(n=4)
[0046]其中縱坐標(biāo)表示帶有每種表型的細(xì)胞占全部細(xì)胞的百分比。結(jié)果表明AML-DC和正常DC相比較，在各種細(xì)胞表型中均存在缺陷，其中*表示該數(shù)據(jù)結(jié)果經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有意義，P值〈0.05。
[0047]圖4siRNA脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染效率的流式檢測(cè)結(jié)果
[0048]圖5 六條 siRNA 干擾效果的 real-time PCR (RT-PCR)結(jié)果(η=3)
[0049]圖63種siRNA轉(zhuǎn)染DC s后A20mRNA的表達(dá)(PCR的電泳結(jié)果)
[0050]M:DNA marker ；1:Si_l 轉(zhuǎn)染的 DC ；2:Si_2 轉(zhuǎn)染的 DC ；3:Si_3 轉(zhuǎn)染的 DC ；4:無(wú)關(guān)siRNA轉(zhuǎn)染的DC ；5:空白對(duì)照組
[0051]圖73種siRNA轉(zhuǎn)染后DCs中A20蛋白的表達(dá)(Western blot)
[0052]M:marker ；1:Si_l 轉(zhuǎn)染的 DC ；2:Si_2 轉(zhuǎn)染的 DC ；3:Si_3 轉(zhuǎn)染的 DC ；4:無(wú)關(guān) siRNA轉(zhuǎn)染的DC ；5:空白對(duì)照組
[0053]圖8TNF- α刺激后不同時(shí)間點(diǎn)收獲的DC中A20mRNA的表達(dá)(RT-PCR)
[0054]圖9TNF- α刺激后不同時(shí)間點(diǎn)DC中A20mRNA的表達(dá)(PCR的電泳結(jié)果)
[0055]M:DNA marker ；1:TNF- α 刺激后 Oh ；2:TNF- α 刺激后 6h ；3:TNF- α 刺激后 24h ；
4:TNF-α 刺激后 48h
[0056]圖10TNF-a刺激后不同時(shí)間點(diǎn)DC中A20蛋白的表達(dá)(Western blot)
[0057]M:marker ； 1:TNF_ α 刺激后 Oh ;2 =TNF- α 刺激后 6h ;3 =TNF- α 刺激后 24h ；4:TNF- α刺激后48h
[0058]圖1 IAML-DCs成熟的細(xì)胞表型分析(n=4)(流式細(xì)胞分析結(jié)果)
[0059]其中縱坐標(biāo)表示帶有每種表型的細(xì)胞占全部細(xì)胞的百分比。結(jié)果表明A20經(jīng)過(guò)siRNA干擾后的AML-DC同A20正常表達(dá)的AML-DC相比較，細(xì)胞表型的表達(dá)上均有很大提高。其中*表示該數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。P〈0.05)。
[0060]圖12尼龍毛柱純化后T細(xì)胞表型流式檢測(cè)結(jié)果
[0061]圖13T細(xì)胞活化過(guò)程中細(xì)胞因子分泌的量的柱狀分析圖(n=4)(流式細(xì)胞分析結(jié)果)
[0062]A20被siRNA下調(diào)表達(dá)的AML_DCs，在刺激T細(xì)胞活化過(guò)程中細(xì)胞因子分泌的量比A20正常表達(dá)的AML-DCs要多，表明A20被siRNA下調(diào)表達(dá)的AML-DCs能更好的刺激T細(xì)胞活化。其中*表示數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P〈0.05?？v坐標(biāo)為細(xì)胞因子分泌的量，單位是經(jīng)過(guò)流式分析后的百分比數(shù)。
[0063]圖14AML-DCS介導(dǎo)的特異性CTL殺傷效率(n=4)(流式細(xì)胞分析結(jié)果)[0064]Control (空白對(duì)照)組:2±0.283，normal A20 (正常 A20)組:16.65± 1.517，siRNA組:22.65± 1.548，normal A20組與siRNA組比較P=0.0015，縱坐標(biāo)為殺傷百分比。
【具體實(shí)施方式】
[0065]本發(fā)明中，我們采用了三種來(lái)源的DC，分別為正常供者DC，病人緩解期DC和AML-DC0前兩者因?yàn)榫鶃?lái)自于正常造血狀態(tài)下的細(xì)胞，因此統(tǒng)稱(chēng)為正常細(xì)胞來(lái)源的DC。我們利用設(shè)計(jì)的小干擾RNA (Small interfering RNA，siRNA)下調(diào)A20表達(dá)后，DC的成熟度明顯提高；我們將這種DC與病人的T細(xì)胞共同培養(yǎng)后，通過(guò)胞內(nèi)染色的方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞活化過(guò)程中細(xì)胞因子分泌的量有所增加；于是我們將這種DC刺激培養(yǎng)出來(lái)的CTL細(xì)胞和病人的AML腫瘤細(xì)胞共同孵育，通過(guò)流式的方法檢測(cè)AML腫瘤細(xì)胞的死亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A20下調(diào)后的DC所誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞殺傷AML腫瘤細(xì)胞的能力增強(qiáng)，其數(shù)據(jù)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 [0066]在本發(fā)明中，誘導(dǎo)RNA干擾的小干擾RNA分子在細(xì)胞或機(jī)體內(nèi)被轉(zhuǎn)換為實(shí)施抑制基因表達(dá)的效應(yīng)siRNA分子。
[0067]siRNA分子包括正義鏈和反義鏈，適用于本發(fā)明的siRNA分子可以通過(guò)本領(lǐng)域常用的方法制備。可以在體外制備siRNA，然后將其直接導(dǎo)入細(xì)胞中(例如通過(guò)轉(zhuǎn)染)。更具體地，例如可以通過(guò)化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄或由siRNA表達(dá)質(zhì)粒或病毒載體在細(xì)胞中表達(dá)，來(lái)制備本發(fā)明的的siRNA分子。
[0068]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，根據(jù)抑制效果，挑選出抑制效果較好的，例如為S1-1、S1-2、S1-3、S1-4、S1-5 和 S1-6，其分別為 SEQ ID NO:1 和 SEQ IDNO:2 退火后形成的 siRNA序列，SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 退火后形成的 siRNA 序列，SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6退火后形成的siRNA序列，以此類(lèi)推；并進(jìn)一步挑選出抑制效果最好的siRNA分子,例如為 S1-1。
[0069]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”是指將核酸與另外的核酸序列置于在功能上具有關(guān)系的狀態(tài)。這可以是相互連接的基因和控制序列以這樣的方式連接，使得當(dāng)適當(dāng)?shù)姆肿颖唤Y(jié)合到控制序列時(shí)，該基因的表達(dá)變得可行。例如，如果啟動(dòng)子控制編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么該啟動(dòng)子將可操作性地與該序列結(jié)合。通常，術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”是指被連接的DNA序列是相鄰的，并且在分泌性前導(dǎo)序列的情況中，是相鄰的且在閱讀框內(nèi)。所述序列的連接是通過(guò)在適當(dāng)?shù)南拗泼肝稽c(diǎn)上進(jìn)行連接來(lái)實(shí)施的。如果所述位點(diǎn)不存在，可以使用根據(jù)常規(guī)方法合成的寡聚核苷酸銜接子或接頭。
[0070]在本發(fā)明中，小干擾RNA (siRNA)指包括約10_60個(gè)核苷酸(或核苷酸類(lèi)似物)，能夠指引或介導(dǎo)RNA干擾的RNA (或RNA類(lèi)似物)。siRNA包括雙鏈siRNA和單鏈siRNA，在本發(fā)明中一般是指雙鏈siRNA，包括正義鏈和反義鏈。
[0071]在本發(fā)明中，所述同一性是指在比較的兩條序列的對(duì)應(yīng)窗口中相同核苷酸所占的比例，所述窗口的大小是指15個(gè)以上核苷酸組成的窗口，優(yōu)選至少17，更優(yōu)選至少約18或19至21-23或24-29個(gè)核苷酸的窗口，所述同一性至少70%，是指在對(duì)應(yīng)窗口中至少70%的核苷酸相同，優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少84%，更優(yōu)選至少89%，更優(yōu)選至少94%，例如95%，96%，97%，98%，99%或100%。其中不同的核苷酸優(yōu)選位于序列的5'和/或3'端，例如位于距5'和/或3'端1-4個(gè)核苷酸序列內(nèi)。[0072]在本發(fā)明中，當(dāng)鋅指蛋白A20的核苷酸序列與本發(fā)明不同時(shí)，用于下調(diào)鋅指蛋白A20的誘導(dǎo)RNA干擾分子的序列也隨著序列的不同在對(duì)應(yīng)位置上做相應(yīng)的改變，以達(dá)到能夠下調(diào)或沉默鋅指蛋白A20表達(dá)的效果。
[0073]在本發(fā)明中，所述下調(diào)或沉默鋅指蛋白A20的表達(dá)，是指在DC細(xì)胞中，鋅指蛋白A20的蛋白、DNAJP /或RNA水平可觀察到的降低或消失，例如減少至少約50%，60%，70%，80%，90%,95%，99%或更多的表達(dá)。抑制的結(jié)果可通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞或機(jī)體的表型或生化技術(shù)而證實(shí)，所述生化技術(shù)例如為Northern雜交，基因芯片，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，WesternBlot，熒光激活細(xì)胞分選(FACS)或放射免疫試驗(yàn)(RIA)等。
[0074]在本發(fā)明中，所述促進(jìn)DC成熟是指DC成熟度較前提高，更有利于抗原的提呈，具體表現(xiàn)為通過(guò)流式檢測(cè)DC成熟的表面標(biāo)記較前有提高，如⑶80、⑶83、⑶86、HLA-DR、⑶54、HCCR7等。DC的成熟度越高，對(duì)于T細(xì)胞的刺激能力就越強(qiáng)，在T細(xì)胞活化過(guò)程中細(xì)胞因子分泌量會(huì)更多，同時(shí)T細(xì)胞活化的過(guò)程越好，所誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力也會(huì)更強(qiáng)。
[0075]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述促進(jìn)DC成熟是指DC誘導(dǎo)的T細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌量增加，同時(shí)DC所誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞殺傷AML腫瘤細(xì)胞的能力增強(qiáng)。
[0076]在本發(fā)明中，所述DC包括正常供者DC，病人緩解期DC和AML-DC，優(yōu)選為AML-DC。由于AML-DC表面遞呈有來(lái)自AML患者的抗原，因此其能夠更好地誘導(dǎo)T細(xì)胞和CTL細(xì)胞的激活，增強(qiáng)對(duì)AML腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。
[0077]下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0078]在以下實(shí)施例中，如未特別說(shuō)明，均同時(shí)采用三種DC細(xì)胞，即正常人DC細(xì)胞，AML緩解期DC細(xì)胞或AML-DC細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似時(shí)只列出其中一種細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果，例如僅列出正常人DC細(xì)胞的結(jié)果。
[0079]實(shí)施例1:DC細(xì)胞培養(yǎng)
[0080]正常細(xì)胞來(lái)源的DC培養(yǎng):正常供者或者緩解期正常造血狀態(tài)下的AML病人，經(jīng)過(guò)費(fèi)森尤斯血細(xì)胞分離機(jī)分離白細(xì)胞層(根據(jù)病人的血小板、白細(xì)胞、紅細(xì)胞壓積等指標(biāo)來(lái)設(shè)定循環(huán)血量及采集時(shí)間)，然后利用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液2000r/min離心20分鐘，收獲單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，370C 5%C02孵箱中孵育2小時(shí)，輕搖培養(yǎng)瓶，收集懸浮細(xì)胞，通過(guò)尼龍毛柱分選T淋巴細(xì)胞以備用；剩余貼壁細(xì)胞加入含有人GM-CSF1000U/ml，人IL-4800U/ml的DC培養(yǎng)基，在37°C 5%C02孵箱中孵育4天，誘導(dǎo)生成未成熟DC。并通過(guò)顯微鏡和流式細(xì)胞儀(采用DC單抗)監(jiān)測(cè)和鑒定。第6天加入人TNF- a 1000U/ml刺激DC成熟后收獲DC細(xì)胞，DC的流式檢測(cè)及免疫組織化學(xué)染色確定其特征性免疫表型。
[0081]AML-DC培養(yǎng):分離單核細(xì)胞的過(guò)程與前相同，PBMC在37°C 5%C02孵箱中孵育6小時(shí)，然后收集懸浮細(xì)胞計(jì)數(shù)后備用；其余與正常DC細(xì)胞培養(yǎng)方法相同。
[0082]A20下調(diào)表達(dá)的DC制備:將培養(yǎng)至第6天的DC細(xì)胞，在加入TNF- α后24h后按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法的說(shuō)明(見(jiàn)實(shí)施例3脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法)，將siRNA轉(zhuǎn)染入DC細(xì)胞，6h后換成DC培養(yǎng)基。第7天收獲DC，此為制備好的A20下調(diào)表達(dá)的DC細(xì)胞。[0083]圖2顯示的是所培養(yǎng)的不同類(lèi)型的AML患者的DC細(xì)胞和正常人的DC細(xì)胞，能夠從細(xì)胞形態(tài)中判斷出DC細(xì)胞，證明DC培養(yǎng)是成功的。圖3表示的AML-DC和正常人DC在成熟度上的區(qū)別，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明AML-DC成熟度較低。DC細(xì)胞只有成熟度越高，才能更好的刺激T細(xì)胞活化，實(shí)現(xiàn)其免疫上的相關(guān)功能。而AML-DC的成熟度較低，因此存在免疫缺陷，需要進(jìn)行siRNA干擾等方法進(jìn)行修飾后，才能應(yīng)用于臨床實(shí)踐中并發(fā)揮作用。
[0084]實(shí)施例2siRNA制備:
[0085]根據(jù)GenBank A20mRNA 序列(NM006290.2),用 Ambion 公司的 siRNA 在線設(shè)計(jì)工具siRNA Target Finder，找到以AA起始，GC含量低于50%，長(zhǎng)度在21bp的候選序列(其中Y端的2個(gè)堿基為懸頭序列，其余19個(gè)堿基為靶序列)；根據(jù)Reynolds等關(guān)于siRNA自身序列特征的研究，按照其總結(jié)的siRNA設(shè)計(jì)規(guī)則評(píng)分，選擇評(píng)分在6分以上的siRNA ;將得到的序列在人基因庫(kù)中進(jìn)行Blast同源性比對(duì)，以排除RNAi脫靶效應(yīng)；用RNA Structured O軟件預(yù)測(cè)A20RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)，根據(jù)預(yù)測(cè)的結(jié)果選取了 9條靶序列，分別位于A20的羧基末端和氨基末端兩個(gè)功能區(qū)域。設(shè)計(jì)合成的siRNA序列為以下SEQ ID NO:1~18所示的序列，其中3丨端的2個(gè)堿基為懸頭序列，其可以增加穩(wěn)定性、提高轉(zhuǎn)染效率，其余序列為靶序列或靶序列的反向互補(bǔ)序列。
[0086]siRNAl (S1-1，位于 Zif-5 區(qū)):
[0087]F:5 ; -GCACCAUGUUUGAAGGAUATT-3 ; (SEQ ID NO:1，去掉 3 '末端兩個(gè)堿基后的序列為 SEQ ID NO:27)
[0088]R:5 ; -UAUCCUUCA AACAUGGUGCTT-3 ; (SEQ ID NO:2)退火后為:
[0089]
GCACCAUGUUUGAAGGAUATT

N N N N N Π.MN
TTCGUGGUACAAACUUCCUAU
[0090]siRNA2 (S1-2，位于 Zif-2 區(qū)):
[0091]F:5 ; -CACUGAAUGUGCAGCACAATT-3 ; (SEQ ID NO:3，去掉 3 '末端兩個(gè)堿基后的序列為 SEQ ID NO:28)
[0092]R:5 ; -UUGUGCUGCACAUUCAGUGTG-3 ; (SEQ ID NO:4)退火后為:
[0093]
CACUGAAUGUGCAGCACAATT
…丨 M M MIllI
GTGUGACUUACACGUCGUGUU
[0094]siRNA3 (S1-3，位于氨基末端):
[0095]F:5 ; -GGUAGAUGAUUACUUUGAATT-3 ; (SEQ ID NO:5，去掉 3 '末端兩個(gè)堿基后的序列為 SEQ ID NO:29)
[0096]R:5 ; -UUCAAAGUAAUCAUCUACCAG-3 ; (SEQ ID NO:6)退火后為:
[0097]
GGUAGAUGAUUACUUUGAATT:1 * I t I I ! ! t I I: I i r
GACCAUCUACUAAUGAAACUU
[0098]siRNA4 (Si_4，位于氨基末端):[0099]F:5 ; -UCUGGUAGAUGAUUACUUUTT-3 ; (SEQ ID NO:7，去掉 3 '末端兩個(gè)堿基后的序列為 SEQ ID NO:30)
[0100]R:5 ; -AAAGUAAUCAUCUACCAGATT-3 ; (SEQ ID NO:8)退火后為:
[0101]
UCUGGUAGAUGAUUACUUUTT

TTAGACCAUCUACUAAUGAAA
[0102]siRNA5 (S1-5，位于 Zif-1 區(qū)):
[0103]F:5 ; -AAUGUGAAACGCCCAACUGTT-3 ; (SEQ ID NO:9，去掉 3 '末端兩個(gè)堿基后的序列為 SEQ ID NO:31)
[0104]R:5 ; -CAGUUGGGCGUUUCACAUUTT-3 ; (SEQ ID NO: 10)退火后為:
[0105]
AAUGUGAAACGCCCAACUGTT
N mIMmmIMIII
TTU UACAOJU UGCGGG U UGAC
[0106]siRNA6 (S1-6，位于 Zif-4 區(qū)):
[0107]F:5 ; -AAGCCGGCUGCGUGUAUUUTT-3 ; (SEQ ID NO: 11，去掉 3 '末端兩個(gè)堿基后的序列為SEQ ID NO:32)
[0108]R:5 ; -AAAUACACGCAGCCGGCUUTT-3 ; (SEQ ID NO: 12)退火后為:
[0109]
AAGCCGGCUGCGUGUAUUUTT
IfMM i MN 丨 M

TTUUCGGCCGACGCACAUAAA
[0110]siRNA-7 (S1-7，位于 Zif-2 區(qū)):
[0111]F:5 ; -UGUGCAGCACAACGGAUUUTT-3 ; (SEQ ID NO: 13，去掉 3 '末端兩個(gè)堿基后的序列為SEQ ID NO:33)
[0112]R:5 ; -AAAUCCGUUGUGCUGCACATT-3 ; (SEQ ID NO: 14)
[0113]siRNA-8 (S1-8，位于 Zif-3 區(qū)):
[0114]F:5 ; -CGGAUUUUGUGAACGUUGCTT-3 ; (SEQ ID NO: 15，去掉 3 '末端兩個(gè)堿基后的序列為SEQ ID NO:34)
[0115]R:5 ; -GCAACGUUCACAAAAUCCGTT-3 ; (SEQ ID NO: 16)
[0116]siRNA-9 (S1-9，位于 Zif-6 區(qū)):
[0117]F:5 ; -GCUCAGAAUCAGAGAUUUCTT-3 ' (SEQ ID NO: 17，去掉 3 '末端兩個(gè)堿基后的序列為SEQ ID NO:35)
[0118]R:5 ; -GAAAUCUCUGAUUCUGAGCTT-3 ; (SEQ ID NO:18)熒光標(biāo)記的 siRNA(FAM-siRNA):
[0119]F:5 ; -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ' (SEQ ID NO: 19)
[0120]R:5 ; -ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3 ; (SEQ ID NO:20)陰性對(duì)照的 siRNA: [0121]F:5 ; -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ' (SEQ ID NO:21)
[0122]R:5 ; -ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3 ; (SEQ ID NO:22)
[0123]實(shí)施例3siRNA轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè):[0124]轉(zhuǎn)染效率的高低可以通過(guò)熒光標(biāo)記的siRNA (FAM-siRNA)監(jiān)測(cè)。FAM-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，可以用流式細(xì)胞儀等檢測(cè)，確定是否有效轉(zhuǎn)染和優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。
[0125]可以采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法，在本發(fā)明中采用了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法。當(dāng)采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染方法時(shí)，可以利用小干擾RNA序列制備AD5/F35腺病毒載體，例如質(zhì)粒為PDC316，啟動(dòng)子為U6。
[0126]轉(zhuǎn)染:
[0127]①以24孔板為例，在轉(zhuǎn)染前保證細(xì)胞密度達(dá)到30%_80%，每孔中加入約500 μ I的無(wú)抗生素培養(yǎng)基。取 I y I/ 孔的 Lipofectamine2000,用 50 μ IOpt1-MEMI Reduced SerumMedium稀釋。輕輕混合后在室溫孵育5min。
[0128]②取2 μ I FAM-siRNA,用 50 μ I Opt1-MEMI Reduced Serum Medium 稀釋?zhuān)p輕混合均勻。稀釋的Lipofectamine2000經(jīng)過(guò)5min的孵育后，與稀釋的FAM-siRNA輕輕混合，室溫靜置20min，以形成FAM-siRNA-轉(zhuǎn)染試劑混合物。
[0129]③將FAM-s iRNA-轉(zhuǎn)染試劑的混合液加入含有細(xì)胞及培養(yǎng)液的孔中，每孔約400 μ 1，輕輕搖晃孔板使其混合。在37°C 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0130]④轉(zhuǎn)染6h后可上機(jī)檢測(cè)FAM-siRNA，即檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。
[0131]⑤FAM是一種綠色的熒光基團(tuán)，由藍(lán)光激發(fā)，激發(fā)波長(zhǎng)為480nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520nm，可在流式細(xì)胞儀的FITC通道檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4。
[0132]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染是成功的，并且確定了轉(zhuǎn)染量(2 μ I)。
[0133]實(shí)施例4siRNA轉(zhuǎn)染·后檢測(cè)沉默下調(diào)鋅指蛋白A20表達(dá)的效果
[0134]提取DC細(xì)胞總RNA，加入20 μ I DEPC水溶解。取11 μ I RNA按照Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄出cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。
[0135]PCR 的反應(yīng)條件是:94°C，5min，(94°C，30s ;60°C，lmin) X45 個(gè)循環(huán)，40°C，IOs 降溫。
[0136]PCR的反應(yīng)體系是:
[0137]
【權(quán)利要求】
1.下調(diào)A20表達(dá)的小干擾RNA分子，其包括正義鏈和反義鏈，其特征在于所述正義鏈或反義鏈包含選自以下(I) - (5)中任一項(xiàng)的至少一種序列: (1)SEQ ID NO:27~SEQ ID NO:35中的任一序列或與其互補(bǔ)的序列； (2)與SEQID N0:27~SEQ ID NO:35中任一序列的同一性至少為70%的序列，優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少84%，更優(yōu)選至少89%，更優(yōu)選至少94%，并具有下調(diào)A20表達(dá)的能力； (3)經(jīng)過(guò)改造的選自(I)或(2)中的序列，其是在所述序列的5’方向和/或3’方向上添加有至多30個(gè)核苷酸的序列，優(yōu)選至多20個(gè)，更優(yōu)選至多10個(gè)，更優(yōu)選至多5個(gè)，并具有下調(diào)A20表達(dá)的能力； (4)經(jīng)過(guò)改造的選自(I)或(2)中的序列，其是在所述序列的基礎(chǔ)上經(jīng)一個(gè)或者幾個(gè)(例如I 一 5個(gè)、I 一 10個(gè))核苷酸的截短和/或替換，并具有下調(diào)A20表達(dá)的能力； (5)與上述(I)~(4)中任一序列對(duì)應(yīng)的DNA序列。
2.重組載體，其可操作地連接有權(quán)利要求1的小干擾RNA分子。
3.組合物，其含有權(quán)利要求1所述的小干擾RNA分子或者權(quán)利要求2的重組載體，以及藥學(xué)上可接受的載體。
4.重組細(xì)胞，其包含有權(quán)利要求1所述的小干擾RNA分子或者權(quán)利要求2的重組載體。
5.權(quán)利要求1的小干擾RNA分子或者權(quán)利要求2的重組載體用于下調(diào)細(xì)胞中鋅指蛋白A20表達(dá)的用途。
6.權(quán)利要求5的用途，其中所述的細(xì)胞為樹(shù)突狀細(xì)胞前體細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞以及其它具有抗原遞呈能力的細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1的小干擾RNA分子或者權(quán)利要求2的重組載體用于促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的用途；例如，所述樹(shù)突狀細(xì)胞為正常人的樹(shù)突狀細(xì)胞，AML緩解期正常造血狀態(tài)下的樹(shù)突狀細(xì)胞或者AML腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的樹(shù)突狀細(xì)胞(AML-DC)。
8.權(quán)利要求1的小干擾RNA分子或者權(quán)利要求2的重組載體用于制備治療炎癥、惡性腫瘤或白血病的藥物中的用途；例如，其中所述白血病為急性髓性白血病。
9.將鋅指蛋白A20的表達(dá)下調(diào)或沉默后得到的樹(shù)突狀細(xì)胞；例如，所述樹(shù)突狀細(xì)胞為正常人的樹(shù)突狀細(xì)胞，AML緩解期正常造血狀態(tài)下的樹(shù)突狀細(xì)胞或者AML腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的樹(shù)突狀細(xì)胞(AML-DC )。
10.權(quán)利要求9的樹(shù)突狀細(xì)胞，其中所述將鋅指蛋白A20的表達(dá)下調(diào)或沉默的方法為，通過(guò)RNA干擾或微小RNA調(diào)控的方式下調(diào)或沉默樹(shù)突狀細(xì)胞中鋅指蛋白A20的表達(dá)；優(yōu)選地，所述RNA干擾的方式為將權(quán)利要求1的小干擾RNA分子或權(quán)利要求2的重組載體導(dǎo)入樹(shù)突狀細(xì)胞中。
11.權(quán)利要求9或10的樹(shù)突狀細(xì)胞用于激活CTL和/或T細(xì)胞的用途；例如，所述CTL和/或T細(xì)胞來(lái)自AML患者。
12.權(quán)利要求9或10的樹(shù)突狀細(xì)胞用于制備治療炎癥、惡性腫瘤或白血病的藥物中的用途；例如，其中所述白血病為急性髓性白血病。
13.下調(diào)A20表達(dá)的SiRNA分子所針對(duì)的靶序列，所述靶序列選自以下序列中的至少一種: (1)SEQ ID NO:27~SEQ ID NO:35中的任一序列或與其互補(bǔ)的序列； (2)與SEQID NO:27~SEQ ID NO:35中的任一序列的同一性至少為70%的序列，優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少84%，更優(yōu)選至少89%，更優(yōu)選至少94% ； (3)與(1)或(2)中任一序列對(duì)應(yīng)的DNA序列。
【文檔編號(hào)】A61P29/00GK103540591SQ201210241285
【公開(kāi)日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2012年7月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月12日
【發(fā)明者】陳虎, 張曉穎, 張斌 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院