專利名稱：穩(wěn)定粒子的液體制劑的制作方法
所有的活生物體都需要水。確實，在很大程度上，大多數(shù)生物是水。生物學中很少的一致性主題是，水占生物體重量的約75％。然而，驚人的是，有一些生物在失去它們幾乎全部的水之后還能在干的狀態(tài)下生存。被稱為間生態(tài)(“無水的生命”)的該能力是在所有的生物王國(包括細菌、真菌、動物和植物)中發(fā)現(xiàn)的，并且可能是在至少二十億年前進化的。這類間生態(tài)生物體能完全干透并且表面上看來像死了，但它們沒死；它們還活著，無活動力且無生氣地無限期處于滯生狀態(tài)，直到存在水時才活過來。所有這些生物解決了在沒有冷藏或冷凍下如何保存生物分子的問題。
一個對間生態(tài)生物體來說是普通的、并且對它們的脫水耐性可能是關鍵的明確特征是它們產(chǎn)生大量單糖的能力。最有效的是海藻糖(α-D-吡喃葡糖基α-D-吡喃葡糖苷)，但間生態(tài)植物例如Craterostigmaplantagineum)積累蔗糖而不是海藻糖。顯然，細胞內(nèi)的和細胞外的糖對于細胞或干生物體的生存力來說是必要的。研究證實了，對間生態(tài)來說，單獨的海藻糖就足夠了，在該研究中將該二糖人工導入活細胞中，使它們變干后又成功地再水化了。
海藻糖從數(shù)種性能的組合獲得其穩(wěn)定化能力。與其它許多糖一樣，它能通過與分子表面氫鍵鍵合而替換結(jié)構(gòu)水。海藻糖是惰性的并且不能與其它分子在干燥狀態(tài)反應。一些其它的類似物也是穩(wěn)定和惰性的，但大多數(shù)糖在凝固點以上與氨基反應(即所謂的美拉德反應)于是破該產(chǎn)品。當應用正確的操作將分子從糖溶液中干燥時，形成一種玻璃體，其中分子被包埋了，使分子的擴散和任何相關的降解作用減至最小。
很多糖溶液在于燥時能表現(xiàn)出兩種完全不同的方式。最常見的表現(xiàn)是糖形成結(jié)晶。當出現(xiàn)該現(xiàn)象時，含該糖的溶液中的分子未受到保護，因為它們被逐出晶體。另一種表現(xiàn)是溶液逐漸變得更濃直到它變得很粘稠以致在室溫下形成一種固態(tài)玻璃體。當發(fā)生該現(xiàn)象時，生物分子制品已經(jīng)歷了從開始時的液態(tài)溶液到最后呈玻璃體的固態(tài)溶液的平穩(wěn)變化。在該狀態(tài)下，可見到被包埋于并被牢固地固定于該玻璃體基質(zhì)中的制品分子。這類似于被發(fā)現(xiàn)呈保存完好的狀態(tài)包埋于化石琥珀中的古代昆蟲。
由于糖玻璃體是水溶性的，所以該過程容易在水中逆轉(zhuǎn)，于是所述制品在液態(tài)溶液中平穩(wěn)地變回到它的天然狀態(tài)。這些平穩(wěn)的轉(zhuǎn)變保證了在干燥過程中沒有制品的損壞。就該制品來說，從液態(tài)溶液到固態(tài)溶液的轉(zhuǎn)變是覺察不到的。由于優(yōu)質(zhì)糖的玻璃體是惰性的并且具有高熔點，所以當干燥時，所述制品即使在惡劣條件下貯存也受到保護。
腸胃外施用的藥物通常是作為含緩沖鹽的水溶液通過空心金屬針注射的?？梢允瞧?nèi)、皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射。更罕見的另一種途徑(例如鞘內(nèi)或眼內(nèi)注射)可能適合。以這種傳統(tǒng)方式施用藥物已有100多年歷史了，并且盡管害怕注射、注射引起的疼痛和感染的危險性，但在此期間尚無任何較大的、普遍被接受的改善。
液體噴注注射器(它的工作原理是，在很高的壓力下直接穿過皮膚射出很細小的液流)在接種程序中取得了一些成功，但早期的模式不可靠。最近的進展(例如Mediject和Bioject裝置)已在糖尿病方面獲得了重大的小生境應用(niche applications)并且正擴展到其它領域。但是，注射器和針頭以及噴注注射者技術分擔了現(xiàn)有技術的主要缺點。很多腸胃外藥物在水溶液中不穩(wěn)定，所以作為更穩(wěn)定的凍干餅狀或作為粉未制備和貯存，它們需要恰在注射前用水或緩沖液重新溶解。該額外的步驟要求技術訓練并且增加了不準確分配溶劑從而不準確分配劑量的危險性，或者由于非無菌技術引起感染。作為溶液或懸浮液貯存的藥物(例如胰島素)需要冷藏以防降解并且具有有限的貯存期限。
干藥物的重新溶解必須正確和精確地操作以保證準確的劑量，該步驟中的任何差錯都會有危險，而且對高效藥物來說，甚至可能是致命的。通常需要在同一時間給予一種以上藥物。這就可能需要多次引起疼痛的注射，因為某些藥物由于在溶液中存在分子之間的化學不相容性而不能在同一個注射器內(nèi)混合，否則就會導致藥效的損失或者甚至產(chǎn)生毒性反應產(chǎn)物。
解決這些問題的最佳辦法(長期以來這也是配藥科學家的目標)是一種穩(wěn)定的液體制劑，該制劑在注射前不需用溶劑重新溶解。雖然在水溶液穩(wěn)定性方面取得一些較小的改善，但它們未提供可應用海藻糖或類似的穩(wěn)定性賦形劑以現(xiàn)代干制劑而獲得的很高的藥物穩(wěn)定性水平。然而，現(xiàn)代干制劑雖然極為穩(wěn)定(即使在相當惡劣的環(huán)境條件下也很穩(wěn)定)，但仍需要在注射前重新溶解。它們還只在很干時才穩(wěn)定。甚至少量吸濕也會使這些干制劑在貯存時不穩(wěn)定。它們通常作為兩相體系貯存于密封的玻璃小瓶中，其中藥物呈不連續(xù)的固相，而連續(xù)的液相則是干空氣(常在減壓下)或干氮氣。
現(xiàn)有的噴注注射的疫苗有兩個主要問題即貯存不穩(wěn)定性和需要重新溶解干疫苗，前一個問題是應用單糖海藻糖通過干燥法(現(xiàn)在已由Quadrant Holdings Cambridge Ltd.取得了專利)解決了。海藻糖-干燥疫苗可在至少45℃的環(huán)境溫度下貯存而沒有可檢測到的變質(zhì)。最驚人的是，甚至氫氧化鋁輔劑凝膠也在干燥和貯存期間通過海藻糖穩(wěn)定化了，并且恢復它們的全部水合體積和功能而沒有凝集或沉淀。
雖然論述了通過該干法解決不穩(wěn)定性問題，但以前描述的海藻糖-干燥疫苗是呈固體玻璃泡沫體形式，并且在通過常規(guī)針頭和注射器技術的注射前需要重新溶解(例如用已滅菌的水或緩沖液)。干疫苗可被配制成粉末形式并且可應用氣體的超聲沖擊波穿過皮膚送遞。由于氣體速度和后續(xù)的滲透力的限制，所以尚難以確定能否通過這些方法達到深肌內(nèi)注射。更有用的制劑應是現(xiàn)成的穩(wěn)定液體，它不需要運送單獨的緩沖液或者本領域中的重新溶解，然而它仍具有海藻糖-干燥物質(zhì)的異常的穩(wěn)定性。這種疫苗可在多劑量容器內(nèi)配制并且在大規(guī)模免疫運動中方便地通過標準噴注注射器送遞。我們現(xiàn)在描述了一種應用細粉末和非水載體的新制劑，在該非水載體中該粉末可被均勻地分配成穩(wěn)定的單分散懸浮體。
基于間生態(tài)現(xiàn)象，我們設計并證實了操作條件，該條件保證完全模擬間生態(tài)現(xiàn)象的穩(wěn)定玻璃體的形成。它們可被用于穩(wěn)定和保藏大多數(shù)類型的分子和生物體系(包括很多疫苗)而不需凍干或冷藏。
我們現(xiàn)在描述一種方法，該方法可被用于配制甚至最不穩(wěn)定的藥物的液體制劑，該制劑象最佳海藻糖-干燥制劑那樣穩(wěn)定，但具有現(xiàn)成液體制劑那樣的全部安全性和方便性。
藥物可在一定的條件下干燥成細粉末，該條件保證藥物在呈玻璃態(tài)的海藻糖或其它穩(wěn)定化賦形劑中的最佳穩(wěn)定化。可自發(fā)形成良好的穩(wěn)定玻璃體的其它糖有palatinit(一種通過用氫和阮內(nèi)鎳催化劑還原異蔗糖(isomaltulose)而制備的吡喃葡糖基山梨糖醇和吡喃葡糖基甘露糖醇的混合物，由德國的Sudzucker AG生產(chǎn))。純異構(gòu)體吡喃葡糖基山梨糖醇和吡喃葡糖基甘露糖醇也比較好，例如乳糖醇(乳糖的還原制品)。(參見(i) Colaco C.A.L.S.，Smith C.J.S.，Sen S.，Roser D.H.，NewmanY.，Ring S.和Roser B.J.，由海藻糖穩(wěn)定化蛋白質(zhì)的化學，“蛋白質(zhì)和肽的配制和送遞”(“Formulation and delivery of proteins andpeptides’)，Cleland和Langer編輯，美國化學學會(American ChemicalSociety)，Washington，222～240(1994)；(ii)PCT申請No.WO91/18091，“生物大分子物質(zhì)和其它有機化合物的穩(wěn)定化”，Roser B.J.和Colaco C.；(iii)美國專利No.5,621,094?！巴ㄟ^添加直鏈糖醇的非還原苷保持脫水期間瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)的方法”，Roser B.和Colaco C.；(iv)PCT申請No.WO 96/05809?！吧镂镔|(zhì)在干燥和后續(xù)的貯存過程中的改善的穩(wěn)定化方法及其組合物”，Colaco C.，Roser B.J.和Sen S.)。
我們還發(fā)現(xiàn)了，如果正確地配制，則現(xiàn)有技術中闡述為不能用作玻璃體形成賦形劑的完整一類的單糖醇確實可形成優(yōu)良的穩(wěn)定制劑。這些單糖醇包括甘露糖醇和肌醇。
含穩(wěn)定活性物的干玻璃體粉末的形成可應用得自這些種類的任何合適的糖或糖衍生物完成。這可直接通過如下方法實現(xiàn)通過噴零干燥或者通過某種其它干燥方法(包括標準的方法，例如真空干燥或冷凍干燥)，接著是研磨步驟(例如噴射研磨)以減小干制劑尺寸而成為細粉末。在玻璃體中含有藥物的穩(wěn)定固體溶液的該糖玻璃體細粉末(不連續(xù)相)然后就被配制成兩相體系中的懸浮體，該兩相體系含有作為連續(xù)相的生物相容性非水液體(它不溶解所述糖)。將水從該體系排除保持了海藻糖或應用的其它穩(wěn)定賦形劑的穩(wěn)定化效果。我們以前報道了海藻糖-干燥活性物在非水液體(它不溶解海藻糖)中保持穩(wěn)定達數(shù)天。GribbonE.M.，Sen S.，Roser B.J.和Kampinga J.，應用海藻糖(Q-T4)技術的疫苗穩(wěn)定化。F.Brow(編輯的)“疫苗效能穩(wěn)定化的新方法”(NewApproaches to Stabilisation of Vaccine Potency)，Dev Biol StandKarger Basel，87，193～199(1996)。假定所述非水載體是穩(wěn)定的，并且假定所述制劑不吸收大量的水，則似乎可能這類制劑應該會與海藻糖干物質(zhì)本身那樣無限地穩(wěn)定。雖然應用了非水實驗溶劑(例如丙酮或二氯甲烷)的實驗建立了活性分子在懸浮的糖玻璃體微球中的穩(wěn)定性原理，但這樣的制劑當然是不能注射的，因為所述載體有毒性。然而，還有獲得了管理機構(gòu)認可的各種非水載體可用于腸胃外注射，并且已證實了它們的安全性和方便性。所述液相可以是任何可注射的疏含水溶劑，例如可注射的芝麻油、花生油或大豆油、油酸乙酯或者水混溶性非水溶劑(例如聚乙二醇)。由于大多數(shù)合適的非水液體本身在室溫或高溫下很穩(wěn)定并且不需冷藏，所以形成的兩相制劑是固有穩(wěn)定的。
然而，糖玻璃體的細粒子在很多非水液體中由于相分離而具有固有的形成塊的傾向。因為糖玻璃體是強親含水的，所以該粒子具有強烈的從連續(xù)疏水相被排斥的傾向并被迫聚集成塊。這些聚集體從懸浮液中沉出而且不能容易地通過振蕩或超聲處理被重新溶解成單分散懸浮體。這導致藥物劑量在懸浮液中的非均勻性，并且在最壞的情況下，該制劑因出現(xiàn)能阻塞針頭的大塊狀物而不能注射。雖然理想的懸浮液是無水的或接近無水的，但我們意外地發(fā)現(xiàn)了，來自油包水(WIO)型乳液的穩(wěn)定化領域的簡單操作可生產(chǎn)穩(wěn)定的、微球在非水液體中的單分散單粒子懸浮體。
雖然這些體系的水含量很低(＜1％)，但常用于穩(wěn)定油包水(WIO)型乳液的表面活性劑在約0.01％～10％、優(yōu)選約1％時具有驚人的效果。它們將玻璃體粒子的聚集體轉(zhuǎn)化為基本上未顯示再聚集傾向的穩(wěn)定的單分散懸浮體。這些表面活性劑〔它們具有低的或很低的親水親油平衡(HLB)值〕本身不溶于水但是是脂溶性的。低HLB表面活性劑例如脫水山梨糖醇倍半油酸酯(Arlacel C，HLB＝3.7)、二縮甘露醇單油酸酯(Arlacel A，HLB＝4.3)、脫水山梨糖醇三硬脂酸酯(Span 65，HLB＝2.1)和甘油單硬脂酸酯(Arlacel 129，HLB＝3.2)具有很低的毒性(大鼠經(jīng)口的LD50＞15g/kg)，已經(jīng)被臨床應用于WIO型乳液(例如供注射的弗氏佐劑)，并且在該用途方面得到了管理機構(gòu)的認可。
優(yōu)選地，所述表面活性劑在粉末粒子的添加之前被添加到連續(xù)非水液相中。
Arlacel A是所謂的“弗氏佐劑”的基本成分，該佐劑被廣泛地用于免疫接種動物而產(chǎn)生最大的血清抗體滴度。(參見“實驗免疫學手冊”(Handbook of Experimental Immunology)，第4版，DM Weir編輯，合編者L.Herzenberg和L Herzenberg，Vol 1，p8.10(1986))。弗氏佐劑基本上是一種細滴的油包水型乳液，其中抗原被溶于不連續(xù)水相，而輕質(zhì)石蠟油的連續(xù)相則起貯源的作用，抗體從貯源被緩慢地釋放。弗氏完全佐劑還含有熱滅活的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)(它引起劇烈的炎癥)，增強免疫系統(tǒng)的響應。這妨礙它在人體中的應用。
細滴油包水型乳液(例如弗氏佐劑)和本文描述的單分散玻璃體于油中的懸浮體之間的主要差別是產(chǎn)生后者需要較低的分散能。在WIO乳液中將水相分散成細滴時需要長時間的劇烈混合(一個高速均化器被用于生產(chǎn)弗氏佐劑，并且在達到穩(wěn)定的乳液之前它通常在＞18,000RPM的最高速度下運轉(zhuǎn)15～30分鐘)，而本文描述的穩(wěn)定懸浮體則只需要添加細粉狀藥物到油/表面活性劑基體中并劇烈振蕩而混合這兩相?？刹扇《虝旱模?min暴露于超聲浴中以保證粉碎在添加到所述疏水相中之前或者在添加過程中就可能形成了的任何小塊狀物。
假定糖玻璃體的細小微球完全不溶于所述疏含水溶劑，那么它們在玻璃體相中應是穩(wěn)定的而沒有重結(jié)晶的傾向，并且玻璃體微球內(nèi)固體溶液中的穩(wěn)定化分子也是穩(wěn)定的。
通過常規(guī)噴霧干燥技術生產(chǎn)的粉末一個很大的缺點是通常產(chǎn)生的粒徑方面的巨大變化。此外，常規(guī)噴霧干燥器在生產(chǎn)平均直徑顯著小于5～10μ的粒子時很困難。該尺寸的粒子在低粘度液體中迅速地沉降。這就可能導致在小瓶內(nèi)劑量分配中大的變化，于是需要經(jīng)常地劇烈振蕩以便再懸浮該粒子。直徑約為0.1～1μ的糖玻璃體粒子會更好，因為通過一般的熱力學力(例如布朗運動)就能使它們保持于均勻的懸浮液中。雖然標準的制藥操作技術(例如噴射研磨)能將粉末的大小減小到平均直徑約為1～2μ，但要研磨到遠低于該值則通常行不通。另外的步驟(例如噴射研磨)當然會增加操作成本。
通過應用超聲噴霧器代替常規(guī)噴嘴，可以改良噴霧干燥設備而產(chǎn)生小的并且很均勻的微球。似乎沒有理由可解釋為什么該操作不能適合大量無菌處理穩(wěn)定的疫苗。一個在空氣中或者其它某種氣體的連續(xù)相中減小粒徑到亞微米尺寸的缺點是通常遭受物料的損失，因為難于將細粒子從氣流中分離。備選地，標準的制藥用高壓微型均化設備例如被廣泛地用于生產(chǎn)無菌的、穩(wěn)定微乳液的Microfluidizer(Constant SystemsInc.)在通過減小懸浮于連續(xù)液相中的平均粒徑來生產(chǎn)穩(wěn)定的微懸浮液方面也是有效的。該操作實際上全部回收物料并且可能是尤其適合稀有的或昂貴的活性物的選定的方法。一個例如這樣的單一步驟可花費不多地結(jié)合入該生產(chǎn)過程，因為生產(chǎn)成本約為每千克粉末$1,000。這將包含約20,000個劑量的標準兒童疫苗(例如DTP)，給每個劑量的成本增加5美分。由于在該領域中即使在適當位置具有昂貴的冷鏈(致冷)，目前的不穩(wěn)定疫苗的損耗也可達50％～90％，所以穩(wěn)定的液體疫苗(它可以免去冷鏈)的額外成本會迅速地得到補償。
本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)穩(wěn)定粒子的液體(PIL)制劑的方法以及該方法的產(chǎn)品。所述粒子呈細粉末形式，優(yōu)選是直徑為10微米或更小的微粒，最優(yōu)選為1微米或更小。優(yōu)選地，該粒子不表現(xiàn)出粒徑方面的巨大變化。該粒子大致是干的，具有小于約1％的很低水含量。該粒子可能含有一種或多種生物分子制品并且可能含有其它添加劑、賦形劑等。所述生物分子制品優(yōu)選是藥物或其它生物活性成分，例如蛋白質(zhì)、抗體、酶(例如限制性內(nèi)切核酸酶)等，但不排除其它的生物物質(zhì)(例如食料、染料、飲料等)。所述粒子被懸浮于不溶解它們的非水液體中。
本發(fā)明提供了一種包括生物分子制品的細干粉粒子的制劑，該粒子在不溶解該粒子的生物相容性非水液體連續(xù)相中構(gòu)成單分散懸浮體，其中所述連續(xù)相可能包括低HLB脂溶性表面活性劑。
該懸浮體制劑可能例如含約1％～多于50％(例如10％)粒化制品，不過可能根據(jù)選定的應用和選定的混合物成分而優(yōu)選更多或更少的負載。
所述粒子包括處于糖玻璃體中的制品分子或者由其構(gòu)成。該糖玻璃體中的制品或者呈穩(wěn)定的固體溶液，或者它自身懸浮于該糖玻璃體中。優(yōu)選地，該糖玻璃體是從海藻糖形成的。
在本申請中，術語“糖”應理解為不但包括二糖(例如海藻糖)，而且包括單糖及其非還原衍生物，例如糖醇，包括甘露糖醇、肌醇、木糖醇、核糖醇等，它們形成一大類的穩(wěn)定化玻璃體形成糖和糖衍生物。術語“糖玻璃體”應被理解為不但包括容易且迅速地溶于含水環(huán)境中的玻璃體(例如海藻糖玻璃體)，而且包括這樣的糖玻璃體其中的糖分子已通過連接一個或多個疏含水側(cè)鏈而被改性，從而使該玻璃體比天然糖更緩慢地溶于體液以便得到生物分子制品的控制釋放。
如果該制劑旨在醫(yī)療應用，例如作為注射制劑，則所述非水連續(xù)相液體必須是生物相容性的。該液相可以是可注射的疏含水溶劑或水混溶性非水溶劑。由于應用了生物分子制品的糖玻璃體穩(wěn)定化，所以顯然所述非水液體必須是糖的非溶劑。例如腸胃外應用認可的任何非水無毒的油可應用于本發(fā)明。低粘度的油(例如油酸乙酯)是合適的并且具有容易注射的優(yōu)點。水混溶性非水溶劑包括甘油、乙二醇、丙二醇、氧化丙烯、聚丙二醇。
所述脂溶性表面活性劑具有低的或很低的HLB。本領域技術人員應容易懂得這些普通術語的意義，尤其是在關于低HLB表面活性劑的優(yōu)選實施例的輔助描述中給出的HLB值的意義。本發(fā)明的一個特別意外的方面在于，由工業(yè)生產(chǎn)商為穩(wěn)定油包水型乳液而專門開發(fā)的表面活性劑在配制大致無水的制劑方面無論如何都會有一點活性或效用。該表面活性劑包括脫水山梨糖醇倍半油酸酯、二縮甘露醇單油酸酯、脫水山梨糖醇三硬脂酸酯和甘油單硬脂酸脂，加上卵磷脂(磷脂酰膽堿)還有二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿和二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿，作為具有表面活性劑活性的正常身體成分的實例，它們有利地被應用于該技術中。還有合成的并已得到認可的表面活性劑，例如脫水山梨糖醇月桂酸酯、棕櫚酸酯、硬脂酸酯和油酸酯。
按本發(fā)明可生產(chǎn)穩(wěn)定粒子的液體制劑，其中細粒干粉末被均勻分配成穩(wěn)定的單分散懸浮體。本領域技術人員應容易懂得，這類單分散懸浮體可以通過注射器和針頭或者通過液體噴注注射器直接注射。該制劑不需在注射前用溶劑重新溶解即可注射。在難于準備無菌的條件和無菌的重新溶解用溶劑和/或緩沖劑的情況下，這顯然是有利的。所述粒子的液體制劑是穩(wěn)定的，所以不需冷藏即可分配。
在糖玻璃體中以細?；镄问椒€(wěn)定化的無水藥物的固體溶液容易水合。本發(fā)明又一個特殊的優(yōu)點在于，可將生物相容性制劑直接注射入受體；結(jié)果正常的生理含水環(huán)境將就地水合該藥物?？奢p易看出，一種穩(wěn)定的、溫度不敏感的、可直接注射的藥物制劑在接種程序和普遍的預防性或治療性施藥方面具有巨大的潛力。
如果所述非水液體是水溶性的或水混溶性的，則本發(fā)明的制劑還可用于診斷學和試劑。然后就可用一個分液器貯存不穩(wěn)定的診斷試劑而不用冷藏，將它們分配入水基檢測系統(tǒng)，例如免疫測定、基于DNA探針的診斷學、PCR反應等。在診斷系統(tǒng)中與水接觸時，非水載體中的細粉狀診斷試劑將會立即溶解，于是該試劑將變成完全活性的。例如，該方法可被用于限制酶，該酶用來消化特定序列位點上的DNA。
粒子的特定連續(xù)相制劑可以是一種以上，當它們在水中被釋放后，它們就迅速地一起相互作用。我們給出的實例是一種粒子中的堿性磷酸酶和另一種粒子中的對硝基苯磷酸(它的底物)。這些可以只輕易地作為兩種前體藥物成份，它們需要相互作用而從兩種前體藥物生產(chǎn)活性藥物。還可具有數(shù)種不同的粒子，例如多價疫苗的各個成分。當它們在體內(nèi)再水合時這些成分在油中不經(jīng)歷破壞性的相互作用并且它們沒有時間相互作用，因為它們從注射部位被吸收并被運送到它們的作用位點。
在限制酶實例中，我們可將處于獨立的粒子中的多種試劑用于復雜分子的生物學技術，例如聚合酶鏈反應(PCR)或測序反應的成分。在前者中，一種粒子應含DNA聚合酶，一種應含一種引物，第三種應含另一種引物，第四種則應含核苷酸。在測序反應中，DNA聚合酶可處于一種粒子中，核苷酸和雙脫氧鏈終端核苷酸則處于另一種粒子中。顯然，在所述油中非相互作用的粒子內(nèi)混合不同試劑的能力為設計強有效的和方便的試劑盒開辟了很多可能的途徑。


圖1示出凍干的堿性磷酸酶在37℃、4℃和-20℃下與時間相關的活性；圖2和3示出海藻糖穩(wěn)定化的堿性磷酸酶的干粉制劑或油懸浮液制劑在37℃和55℃下的活性；圖4和5示出重組EPO的凍干的制劑以及海藻糖穩(wěn)定化的干粉制劑或油懸浮液制劑在37℃和55℃下的活性；以及圖6、7和8示出EcoR1的凍干的制劑以及海藻糖穩(wěn)定化的干粉制劑或油懸浮液制劑在4℃、37℃和55℃下的活性。
實施例實施例1 堿性磷酸酶。
來自牛腸粘膜的堿性磷酸酶(EC號為3.1.3.1，Sigma-Aldrich Co.Ltd.p8647)一般是以凍干粉末獲得的。這需要在＜0℃下的冷凍機中貯存干燥以便保持該酶的活性。即使在該溫度下，凍干的酶也逐漸失去活性。當在更高溫度下貯存時，則更迅速地與溫度相關地失去活性(圖1)。
配制和干燥將該酶溶于由下列成分構(gòu)成的緩沖液物質(zhì) 濃度海藻糖 0.6M硫酸鈉 0.35M牛血清白蛋白 0.75mM堿性磷酸酶 40單位/ml氯化鋅 1mM氯化鎂 1mM然后在Labplant SD1噴霧干燥器中干燥。干燥條件是入口溫度135℃，出口溫度80℃，最大的空氣流量。通過熱解重量分析法(TGA)在Seiko SSC/5200儀器(Seiko Instruments Inc.)上測得該操作結(jié)束時玻璃態(tài)粉末的殘余水含量是2％。
貯存將100mg該粉末的等分試樣稱入5ml疫苗小瓶并在真空下密封。將其它等分試樣稱入小瓶并在200mg/ml油的濃度下重懸浮于藥物級油酸乙酯(Croda Chemical Company Ltd.)中。將這些小瓶也在真空下密封。然后將該干粉末試樣和油懸浮液試樣在37℃或55℃下貯存不同的時間。
分析在貯存期末，添加5ml體積的用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)到pH10.0的、具有下列組成的緩沖液，物質(zhì)濃度甘氨酸 100mM氯化鋅 1mM氯化鎂 1mM再在IEC Centra 413離心機中在3,500RPM下將這些小瓶離心10分鐘。離心的效果是將含有所述酶的玻璃體粒子轉(zhuǎn)移通過油水界面并將它們?nèi)苡诰彌_液中從而回收殘余的酶。不管在添加了所述含水緩沖液之后是否劇烈地振蕩了這些小瓶，回收的酶量是一樣的。酶活性是應用測定“甘氨酸單位”的動力學方法(Sigma-Aldrich Co.Ltd.)測定的，即在Shimadzu UV-160A分光光度計上應用對硝基苯磷酸底物在37℃下測定405nm波長處的顯色程度。
結(jié)果在37℃下貯存時，貯存84天后所述干粉末或油懸浮液中都無酶活性損失。(圖2)。在55℃下貯存時，在前7天內(nèi)有少量的損失，但在長達84天后90％以上的活性又穩(wěn)定了(圖3)。如果所述油樣品和粉末樣品之間有差異的話，前者更好，但差異不明顯。不管應用礦物油還是油酸乙酯作為連續(xù)相都得到基本一致的結(jié)果。
在其它實驗中進行了噴霧干燥，應用了不同緩沖組合物，該組合物含代替硫酸鈉的乳酸鈣或代替海藻糖的甘露糖醇。這些實驗給出基本類似的結(jié)果。應用基于甘露糖醇的玻璃體形成緩沖劑的良好結(jié)果特別出乎意外，因為以前公開的文獻敘述了不可能應用單糖糖醇作為穩(wěn)定劑(PCT申請No.WO 91/18091，“生物大分子物質(zhì)和其它有機化合物的穩(wěn)定化”，Roser B.J.和Colaco C.；美國專利No.5,621,094，“通過添加直鏈糖醇的非還原苷保持脫水期間瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)的方法”，Roser B.和ColacoC.；PCT申請No.WO 96/05809，“生物物質(zhì)在干燥和后續(xù)的貯存過程中的改善的穩(wěn)定化方法及其組合物”，Colaco C.，Roser B.J.和Sen S.)。倘若配制和干燥技術是為了形成良好的玻璃體的話，情況就不是這樣。
受在懸浮液內(nèi)玻璃體粉末中干燥的活性物惰性和穩(wěn)定性的啟示，制備了含堿性磷酸酶的粉末和含對硝基苯磷酸的粉末在礦物油中的混合物，并在55℃下貯存7天。在該時間結(jié)束時這些懸浮液似乎未變化。在添加1ml水并振蕩后，分離的水相中迅速出現(xiàn)濃黃色，表明水已經(jīng)再活化了所述酶和底物。該結(jié)果表示這些制劑在相同的載體中可容納會在常規(guī)含水混合物中一起反應的組分。該性能將在例如多價疫苗中有重大價值。我們注意到它還是開發(fā)所謂的“二元”藥物的一個良好的模型系統(tǒng)，該“二元”藥物中，最終的活性成分是通過只有當前體分子被體液潤溫時才開始進行的化學反應合成或釋放的。
實施例2 重組人促紅細胞生成素(EPO)選擇EPO作為現(xiàn)代藥物的一個實例，它是通過大腸桿菌(E.coli)中重組蛋白質(zhì)的遺傳工程生產(chǎn)的。
將凍干的EPO再水合，用如下組成的緩沖液稀釋100倍物質(zhì)濃度海藻糖 0.6M硫酸鈉 0.7M牛血清白蛋白0.75mM接著如前述那樣在噴霧干燥器中干燥。將該粉末稱成125mg的等分試樣，在真空下40℃～80℃的溫度范圍內(nèi)以每小時15度的速度進行第二次干燥，然后或者密封于血清小瓶中或者重懸浮于0.5ml礦物油BP中并密封。接著在37℃或55℃下將它們貯存達15天。在貯存期結(jié)束時，將殘余的EPO提取入前述含0.01％BSA的磷酸鹽緩沖鹽水中，應用Quantikine IVD EPO特異性免疫測定儀(R & D Systems Inc)測定提取物中殘余的EPO量。
在37℃下一天內(nèi)，新鮮的EPO失去其活性的88％，而干物質(zhì)，不管是否懸浮于油中都具有完全的活性(圖4)。到15天的時候失去了少量的活性，但保持90％以上的活性。在55℃下貯存時，新鮮的EPO在一天內(nèi)失去＞95％的活性(圖5)。而干物質(zhì)在第一天中未失去活性并且在15天后仍可回收＞80％的活性。
實施例3 限制性內(nèi)切核酸酶EcoR1限制酶通常被貯存在-20℃的冷凍機內(nèi)含50％甘油(以防結(jié)冰)的緩沖液中。甚至在這些條件下它們中的一些也只具有有限的貯存壽命并且需要每隔一段時間替換。應用本發(fā)明的技術干燥了數(shù)種酶而得到類似的結(jié)果。本文闡述了一種酶即EcoR1的數(shù)據(jù)。用SC緩沖液(ColacoC.A.L.S.，Sen S.，Thangavelu M.，Pinder S.和Roser B.，“在海藻糖中干燥的酶的異常的穩(wěn)定性簡化的分子生物學?！鄙锛夹g(Biotechnol.)，10，1007～1011(1992))將該酶溶液稀釋100倍。在前述噴霧干燥器中形成干燥的酶，密封于含油或不含油的小瓶內(nèi)，并在4℃、37℃和55℃的三個貯存溫度下將它的穩(wěn)定性與用切割緩沖液(cutting buffer)稀釋的新鮮液體酶比較。為了測定貯存后的殘余活性，如前述那樣將酶回收入水相，用SC緩沖液以2倍稀釋系列稀釋，用于切割0.5μg噬菌體λDNA(Life Technologies Inc)。通過如下方法估測不同稀釋度下切割的完全度通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，其中通過溴化乙錠染色，在UV光下可視化各條帶。酶的滴度以顯示未出現(xiàn)部分條帶的完全切割時的最大稀釋度表示。
在4℃下貯存時，在28天中，所有制劑都未顯未逐漸失去活性。甚至新鮮的液體制劑也在該溫度下穩(wěn)定(圖6)。在37℃下，新鮮酶到28天時基本上失去全部活性，而添加了油或未添加油的干酶是高度活性的(圖7)。在55℃下貯存后，干制劑顯示相同的活性回收率，但在該溫度下，新鮮酶在7天內(nèi)完全無活性(圖8)。
這些限制酶的制劑提供了切割DNA的簡便的新方法。把含懸浮的酶粉末的油覆蓋在DNA溶液上面，在Eppendorf離心機中旋轉(zhuǎn)并離心。所述酶懸浮液溶于含該DNA的水相并在37℃下開始切割。所述油相形成合適的蒸汽屏障，它覆蓋消化液而防止蒸發(fā)。已經(jīng)為分子生物學家所熟悉的該方法是聚合酶鏈反應技術的一個普通部分。處于非吸濕性礦物油載體中的可室溫貯存的限制酶構(gòu)成分子生物學的有價值的、合適的新產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1.一種穩(wěn)定粒子的液體制劑，該制劑包括懸浮于連續(xù)相中的微粒的不連續(xù)相，該連續(xù)相是不溶解所述微粒的非水液體，其中該微粒包括含有至少一種生物分子制品的細粉狀糖玻璃體，該糖玻璃體中的生物分子制品或者呈穩(wěn)定的固體溶液或者它自身懸浮于該糖玻璃體中。
2.權(quán)利要求1的制劑，其中所述連續(xù)相包括低HLB或很低HLB的脂溶性表面活性劑。
3.權(quán)利要求1或2的制劑，其中所述糖玻璃體由一種或多種選自下組的糖構(gòu)成海藻糖、palatinit、吡喃葡糖基山梨糖醇、吡喃葡糖基甘露糖醇、乳糖醇，以及單糖醇例如甘露糖醇和肌醇。
4.權(quán)利要求1的制劑，其中所述非水連續(xù)液相是生物相容的。
5.權(quán)利要求1的制劑，其中所述非水連續(xù)相是一種疏含水溶劑。
6.權(quán)利要求1的制劑，其中所述非水液體連續(xù)相是水混溶性的。
7.權(quán)利要求1～7任一項的制劑，其中所述糖玻璃體微粒直徑是約0.1～約10μ，優(yōu)選小于10μ，例如1或2或5μ的直徑，最優(yōu)選小于1μ的直徑。
8.權(quán)利要求7的制劑，其中所述微粒不表現(xiàn)粒徑方面的巨大變化。
9.權(quán)利要求1～8任一項的制劑，其中所述微粒大致是干的，具有小于約1％的很低水含量。
10.權(quán)利要求1～9任一項的制劑，其中所述生物分子制品是藥物或者其它生物活性成分，例如蛋白質(zhì)、抗體、酶(例如限制性內(nèi)切核酸酶)等，它包括生物物質(zhì)，例如食料、染料、飲料等。
11.權(quán)利要求1～10任一項的制劑，其中所述微粒在連續(xù)相中構(gòu)成一種單分散懸浮體。
12.權(quán)利要求1～11任一項的制劑，它在不連續(xù)相中含有約1wt％到多于50wt％、例如約10wt％的微粒。
13.權(quán)利要求2的制劑，其中連續(xù)相中表面活性劑的量是約0.01vol％～約10vol％，例如1vol％。
14.權(quán)利要求2或13的制劑，它含有一種或多種選自下組的表面活性劑脫水山梨糖醇倍半油酸酯、二縮甘露醇單油酸酯、脫水山梨糖醇三硬脂酸酯和甘油單硬脂酸酯，卵磷脂(磷脂酰膽堿)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿，以及脫水山梨糖醇月桂酸酯、棕櫚酸酯、硬脂酸酯和油酸脂。
15.權(quán)利要求1或2的制劑，其中所述連續(xù)的非水液相包括一種或多種選自下組的疏含水無毒溶劑或者由其構(gòu)成芝麻油、花生油、大豆油、油酸乙酯和礦物油。
16.權(quán)利要求1或2的制劑，其中所述非水連續(xù)液相包括選自下組的一種水混溶性非水溶劑或者由其構(gòu)成聚乙二醇、甘油、乙二醇、丙二醇、氧化丙烯、聚丙二醇。
17.一種生產(chǎn)穩(wěn)定粒子的液體制劑的方法，該方法包括如下步驟制備包括一種或多種含于糖玻璃體中的生物分子制品的微粒，再將該微粒加到不溶解該粒子的非水連續(xù)液相中而形成懸浮體，該糖玻璃體中的生物分子制品或者呈穩(wěn)定的固體溶液或者它自身懸浮于該糖玻璃體中。
18.權(quán)利要求17的方法，其中通過在所述非水連續(xù)液相中包括至少一種具有低HLB或很低HLB的表面活性劑而在該連續(xù)相中制備一種微粒的單分散單粒子懸浮體。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述表面活性劑是在添加粒子之前被加入所述連續(xù)的非水液相的。
20.權(quán)利要求1或2的制劑，它是二元藥物制劑，其中所述生物分子制品是藥物前體，并且其中所述最終活性藥物成分是通過化學反應合成或釋放的，該化學反應只是在給患者施用該制劑后所述前體被體液潤濕時才開始的。
21.權(quán)利要求1或2的制劑，它包含含有一種以上生物分子制品的微粒。
22.權(quán)利要求1或2或21的制劑，它含有微粒的混合物，該微粒在與含水環(huán)境接觸時釋放一種以上生物分子制品。
23.權(quán)利要求21或22的制劑，其中當在含水環(huán)境中釋放后，兩種或多種生物分子制品相互作用。
24.切割DNA的方法，它應用權(quán)利要求1或2的制劑，其中所述生物分子制品是限制性內(nèi)切核酸酶，并且其中將該制劑與DNA的水溶液接觸，于是保持在所述糖玻璃體中的懸浮酶在含DNA的水相中溶解并能切割該DNA。
全文摘要
一種穩(wěn)定粒子的液體制劑,該制劑包括懸浮于連續(xù)相中的微粒的不連續(xù)相,該連續(xù)相是不溶解所述微粒的非水液體,優(yōu)選是生物相溶性的。所述微粒包括選自下組物質(zhì)的細分散的糖玻璃體:海藻糖、palatinit、吡喃葡糖基山梨糖醇、吡喃葡糖基甘露糖醇、乳糖醇、以及單糖醇例如甘露糖醇和肌醇,所述糖玻璃體含有至少一種生物分子制品,該玻璃體中的生物分子制品或者呈穩(wěn)定的固體溶液或者它自身懸浮于該糖玻璃體中。所述非水連續(xù)液相中微粒的單分散單粒子懸浮體可通過在該連續(xù)相中包括至少一種具有低HLB或很低HLB的表面活性劑而制備。
文檔編號A61K9/10GK1256626SQ98803450
公開日2000年6月14日 申請日期1998年3月18日 優(yōu)先權(quán)日1997年3月18日
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