專利名稱：亞甲基丙二酸酯毫微細(xì)粒的制備方法及任選含有一種或多種生物活性分子的毫微細(xì)粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備由聚合的亞甲基丙二酸酯化合物形成的毫微細(xì)粒的新方法，任選地含有一種或多種生物活性分子的所述毫微細(xì)粒以及含有它們的藥物組合物。
“毫微細(xì)?！笔侵钢睆叫∮诩s500納米的亞微米粒子。EP 0007895公開了由氰基丙烯酸烷基酯的乳液聚合形成的毫微細(xì)粒。制備這些氰基丙烯酸烷基酯粒子所用的方法是基于同時(shí)在水相中進(jìn)行的單體的(陰離子)聚合。依照相同原理的、由亞甲基丙二酸酯聚合物構(gòu)成的毫微細(xì)粒的制備過(guò)程尤其是被公開于Lescure等，Pharm.Res.,1994.11,1270-1276。其制備公開于EP 0283364中的這些單體的結(jié)構(gòu)接近于氰基丙烯酸酯，但后者的腈官能團(tuán)被酯或酯基酯代替。類似于氰基丙烯酸酯，它們也是在低溫下在含水介質(zhì)中聚合，并可生物降解。
然而，如此獲得的亞甲基丙二酸酯毫微細(xì)粒有某些缺點(diǎn)。
實(shí)際上，呈毫微細(xì)粒形式的亞甲基丙二酸酯的乳液聚合，在水相并在略顯酸性pH值下導(dǎo)致齊聚物，主要是三聚物或四聚物型齊聚物的形成，這些齊聚物是高度生物降解的。這些分子可部分地溶于水，因此這些毫微細(xì)粒在含水介質(zhì)中的分散將導(dǎo)致它們的溶解，并導(dǎo)致迅速喪失粒子結(jié)構(gòu)(P.Breton等，Eur.J.Pharm.Biopharm.,1996,42,95-103)。因此當(dāng)一種生物活性分子與亞甲基丙二酸酯毫微細(xì)粒結(jié)合時(shí)，該分子可能會(huì)在給藥后，視具體情況而定在達(dá)到活性組分起作用的位置之前、在導(dǎo)致形成粒子基質(zhì)的齊聚物發(fā)生迅速溶解的循環(huán)液流稀釋作用下被非常迅速地釋放。
一些實(shí)驗(yàn)已經(jīng)顯示出，在堿性pH值下的聚合可形成高分子量的聚合物，同時(shí)保持毫微細(xì)粒的尺寸不變。然而，這些合成的特征在于
-不可能得到Mw＜10000，更不必說(shuō)是Mw＜8000的、構(gòu)成單個(gè)毫微細(xì)粒的聚合物，而不形成聚集體并且無(wú)明顯存在的齊聚物，-在高pH值(pH＞7)下不可能形成Mw＞20000，更不必說(shuō)是更高M(jìn)w的聚合物，而不形成聚集體，該聚集體使這些制劑無(wú)法進(jìn)行血管內(nèi)給藥。
“Mw”是指質(zhì)量平均分子量(或平均分子量)，定義作Mw=∑ni.Mi2/∑ni.Mi,Mp是指數(shù)量上為主要物質(zhì)的分子量。
在下文中，分子量是相對(duì)于等量聚苯乙烯(Ep)表示的。
因此該制備方法不適合于制備組成如下的聚亞甲基丙二酸酯毫微細(xì)粒-平均分子量約5000～10000，特別是約8000的聚合物，-平均分子量大于20000而不形成聚集體的聚合物。
因此本發(fā)明涉及直徑小于500nm，特別是100～500nm的亞甲基丙二酸酯毫微細(xì)粒的制備，該毫微細(xì)粒是由質(zhì)量范圍很寬(Mw約2000～80000)的均一分子形成的。其原理在于在水可混溶的質(zhì)子惰性有機(jī)相中溶解單體，但是該質(zhì)子惰性的有機(jī)相在毫微細(xì)粒的制備條件下與含水聚合介質(zhì)形成一種對(duì)形成的聚合物為非溶劑的混合物。
“質(zhì)子惰性的有機(jī)相”或“質(zhì)子惰性的有機(jī)溶劑”，是指無(wú)不穩(wěn)定的可引發(fā)陰離子的質(zhì)子的有機(jī)相或溶劑。
本發(fā)明制備方法的優(yōu)點(diǎn)是多方面的-它可使單體在聚合介質(zhì)中分散得更均勻，-它利用了一種非氯化的并且由于其揮發(fā)性而易于脫除的溶劑，-它防止了聚合物聚集體的形成，-它可使聚合產(chǎn)率提高，-在形成直徑小于500nm的毫微細(xì)粒中，它可形成分子量范圍很寬(Mw為約2000～100000，特別是約2000～80000)的聚合物。
而且，該方法還可使用分散劑，如非離子表面活性劑或保護(hù)聚合物的膠體，這些分散劑可形成具有柔性表面性能的粒子。
最后，可以通過(guò)調(diào)節(jié)下述制備條件，精確地控制形成本發(fā)明的毫微細(xì)粒的齊聚物/聚合物的分子量-有機(jī)相中的單體濃度，-聚合介質(zhì)的pH值和摩爾濃度，-分散劑的性質(zhì)和濃度，-水相(聚合介質(zhì))/有機(jī)相的體積比，-在水相中引入有機(jī)混合物的方式。
因此第一方面，本發(fā)明涉及由至少一種通式(Ⅰ)的化合物的無(wú)規(guī)聚合物形成的毫微細(xì)粒的制備方法，
(Ⅰ)其中A表示
基團(tuán)或
基團(tuán)；R1和R2相同或不同地表示一線性或支化的C1～C6烷基；n=1,2,3,4或5；其特征在于，單體(一種或多種)在聚合之前溶解在與水可混溶的質(zhì)子惰性有機(jī)溶劑中，該有機(jī)溶劑與聚合介質(zhì)形成對(duì)形成的聚合物是非溶劑的混合物。
在一有利的方面，本發(fā)明涉及由通式(Ⅰ)化合物的聚合物形成的毫微細(xì)粒的制備方法，
(Ⅰ)其中A表示
基團(tuán)或
基團(tuán)；R1和R2相同或不同地表示一線性或支化的C1～C6烷基；n=1,2,3,4或5；其特征在于單體在聚合之前溶解在與水可混溶的質(zhì)子惰性有機(jī)溶劑中，該有機(jī)溶劑與聚合介質(zhì)形成對(duì)形成的聚合物是非溶劑的混合物。
按照本發(fā)明的一特別方面，本發(fā)明方法可制備直徑小于500nm，優(yōu)選100～500nm的毫微細(xì)粒，其平均分子量(Mw)為約1000～100000，特別是約1000～80000，尤其是約2000～80000，優(yōu)選約8000～80000。
特別地，本發(fā)明方法包括如下步驟-制備至少一種通式(Ⅰ)的化合物在一水可混溶的質(zhì)子惰性有機(jī)溶劑中的溶液，-在pH值為4.5～10下將有機(jī)相在攪拌下加入到含水聚合介質(zhì)中，-在均化該混合物并在真空下蒸發(fā)掉有機(jī)溶劑后回收如此獲得的毫微細(xì)粒。
也可將含水聚合介質(zhì)加入到含事先溶解的單體的有機(jī)相中，按照另一方面，本發(fā)明的方法包括如下步驟-制備至少一種通式(Ⅰ)的化合物在一水可混溶的質(zhì)子惰性有機(jī)溶劑中的溶液，-在pH值為4.5～10下，在攪拌下向該有機(jī)相中加入含水聚合介質(zhì)，-在均化該混合物并在真空下蒸發(fā)掉有機(jī)溶劑后回收如此獲得的毫微細(xì)粒。
如在后面實(shí)施例中所述的，聚合介質(zhì)的pH值根據(jù)要制備的聚合物的分子量進(jìn)行選擇。
有利地，通過(guò)連續(xù)攪拌約30分鐘來(lái)均化有機(jī)相和含水介質(zhì)的混合物，然后任選地，通過(guò)蒸餾水來(lái)完成制備。
形成的聚合物在聚合介質(zhì)中沉淀，并可通過(guò)例如過(guò)濾的方式來(lái)回收。然后可將如此獲得的毫微細(xì)粒懸浮液進(jìn)行調(diào)節(jié)并冷凍干燥。
用于分散單體的質(zhì)子惰性有機(jī)溶劑必須是所述單體的溶劑，該單體也應(yīng)該與水混溶。優(yōu)選地，該溶劑選自丙酮，乙腈，二噁烷和四氫呋喃，特別優(yōu)選的是丙酮。
本發(fā)明方法的優(yōu)選方面如下-通式(Ⅰ)的單體在有機(jī)溶劑中的濃度約為30mg/ml～150mg/ml；-聚合介質(zhì)的摩爾濃度約為1/30M～1/3M；-水相與有機(jī)相的體積比為3/1～20/1，優(yōu)選3/1～15/1。
有利地，聚合介質(zhì)含有一種或多種表面活性劑或保護(hù)膠體。
表面活性劑例如可為離子型或非離子型表面活性劑。優(yōu)選使用非離子型表面活性劑，它們選自聚氧化亞乙基和聚氧化亞丙基的共聚物，poloxamers和多乙氧基醚。作為保護(hù)膠體，優(yōu)選使用多糖衍生物，如葡聚糖，水溶性纖維素衍生物；聚乙二醇；聚乙烯醇。
優(yōu)選地，用于按照本發(fā)明方法形成毫微細(xì)粒的聚合化合物為通式(Ⅰ)的化合物，其中A表示
基團(tuán)，n=1,R1=R2=乙基。在另一優(yōu)選的方面，用于按照本發(fā)明方法形成毫微細(xì)粒的聚合化合物為通式(Ⅰ)的化合物，其中A表示
基團(tuán)，R1=R2=丙基。
有利地，通式(Ⅰ)中A表示定義如上的
基團(tuán)或
基團(tuán)的化合物的混合物，也可以進(jìn)行無(wú)規(guī)聚合。
在第二方面中，本發(fā)明涉及由該方法獲得的、由至少一種通式(Ⅰ)的亞甲基丙二酸酯化合物的無(wú)規(guī)聚合物形成的毫微細(xì)粒，該毫微細(xì)粒的直徑小于500nm，優(yōu)選100～500nm，其平均分子量(Mw)為約1000～100000，特別是約1000～80000，尤其是約2000～80000，優(yōu)選約8000～80000。
特別地，由所述方法獲得的該毫微細(xì)粒，是由通式(Ⅰ)的一種化合物的聚合物形成的，該毫微細(xì)粒的直徑小于500nm，優(yōu)選100～500nm，其Mw為約1000～80000，特別是約2000～80000，優(yōu)選約8000～80000。
在一優(yōu)選方面，本發(fā)明涉及由至少一種通式(Ⅰ)的化合物的無(wú)規(guī)聚合物形成的毫微細(xì)粒，該毫微細(xì)粒的直徑小于500nm，優(yōu)選100～500nm，其平均分子量(Mw)為約8000～100000，優(yōu)選約8000～80000。
特別地，本發(fā)明涉及由通式(Ⅰ)的一種化合物的聚合物形成的毫微細(xì)粒，該毫微細(xì)粒的直徑小于500nm，優(yōu)選100～500nm，其平均分子量(Mw)為約8000～80000。
有利地，該毫微細(xì)粒是由通式(Ⅰ)的一種化合物形成的，其中A表示
基團(tuán)；基團(tuán)，n=1,R1=R2=乙基。在另一優(yōu)選的方面，該毫微細(xì)粒是由通式(Ⅰ)的一種化合物形成的，其中A表示
基團(tuán)，R1=R2=丙基。有利地，該毫微細(xì)?？捎赏ㄊ?Ⅰ)化合物的混合物的無(wú)規(guī)聚合物構(gòu)成，其中A表示定義如上的
基團(tuán)或
基團(tuán)。
按照本發(fā)明的另一方面，所述毫微細(xì)粒在其聚合物網(wǎng)絡(luò)中含有一種或多種如上所述的生物活性分子。
實(shí)際上，在本發(fā)明方法的一有利方面，有機(jī)相(當(dāng)其為不溶于水的生物活性分子時(shí))或聚合介質(zhì)可含有一種或多種生物活性分子。
“生物活性分子”的非限定性含義是指，任何在體外或體內(nèi)具有預(yù)防或治療生物活性的分子或大分子，尤其是抗感染劑，特別是防腐藥，抗生素，抗病毒劑，抗寄生蟲劑或抗核分裂劑，尤其是抗癌劑。
可使用的抗生素或防腐藥，例如可以是利福平和粘菌素。
作為抗病毒劑，以非限定性方式引用的是雙脫氧肌苷，利巴韋林，齊多夫定，無(wú)環(huán)鳥苷，更昔洛韋，膦甲酸，阿糖腺苷，扎西他賓。
順鉑、5-氟尿嘧啶、紫杉醇可例如用作抗癌劑。另一有利的抗腫瘤劑為磷酸肌酸，其活性公開于EP 0614366中。
本發(fā)明還涉及含有所述毫微細(xì)粒的藥物組合物，該藥物組合物含有與可藥用賦形劑結(jié)合的一種或多種生物活性分子。
本發(fā)明的組合物可以下述方式給藥，例如口服，舌下，皮下，肌內(nèi)，靜脈內(nèi)，經(jīng)皮膚，局部，直腸，通過(guò)肺或鼻內(nèi)給藥。
特別地，適宜給藥劑型包括口服劑型，如片劑、明膠膠囊、粉劑、粒劑和口服溶液或懸浮液；舌下和口腔給藥劑型，以及皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)和直腸給藥劑型。
本發(fā)明通過(guò)下述實(shí)施例說(shuō)明，其中粒子的制備在室溫下(約21℃)進(jìn)行。用激光散射計(jì)數(shù)器(Coulter Electronic Inc.,USA)測(cè)定毫微細(xì)粒的大小或直徑。用凝膠滲透色譜法測(cè)定聚合物的分子量。實(shí)施例1將500mg已經(jīng)在25毫巴下解吸SO23小時(shí)的1-乙氧基羰基-1-乙氧基羰基亞甲基氧代羰基乙烯(Laboratoires UPSA/CARPIBEN,France)溶解在5.55ml丙酮中。然后將該溶液逐漸地并在磁力攪拌下與50ml在pH值8下緩沖的(Na2HPO4/KH2PO4.1/15M)、并含有500mg葡聚糖70(FLUKA CHEMIE,Switzerland)的含水介質(zhì)混合。幾乎立即進(jìn)行的聚合反應(yīng)形成渾濁的混合物，該混合物呈現(xiàn)膠體溶液的丁達(dá)爾特征效應(yīng)。在有機(jī)相全部引入后維持?jǐn)嚢?0分鐘。然后將50ml含有2.59葡萄糖或海藻糖(保護(hù)膠體或低溫保護(hù)劑)的去離子水加入到毫微細(xì)粒懸浮液中，并使該混合物在真空下蒸發(fā)，以除去丙酮并將含水懸浮液的體積減小至50ml。在濾紙(孔徑為5～15μm)上進(jìn)行過(guò)濾后，將制劑進(jìn)行冷凍干燥。由激光散射測(cè)定，含在濾液中的粒子的直徑為288nm。由凝膠滲透色譜法測(cè)得，構(gòu)成粒子的聚合物基質(zhì)的亞甲基丙二酸酯的平均分子量(Mw)為67000。實(shí)施例2pH值改變的研究按照實(shí)施例1所述的工藝進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，只是僅通過(guò)磷酸鹽緩沖劑改變pH值。結(jié)果列于下述表1中，其中Mp為主要成分的分子量，Mw為聚合物的平均分子量。
表1<
>結(jié)果顯示，隨著聚合介質(zhì)pH值的提高，構(gòu)成毫微細(xì)粒的聚合物的平均分子量有規(guī)律地增加。


圖1的凝膠滲透色譜圖表示pH值5.5(濃度90mg/ml)時(shí)制備的聚合物的分子量分布。在1處觀察到的寬峰對(duì)應(yīng)于平均分子量(Mw)高的物質(zhì)，在2處觀察到的窄峰對(duì)應(yīng)于少量的齊聚物(主要是三聚物和四聚物)。
虛線界定了色譜圖的可分析部分。峰F是用作內(nèi)標(biāo)的甲苯的峰，負(fù)方向的峰對(duì)應(yīng)于痕量水。實(shí)施例3單體濃度改變的研究按實(shí)施例1所述的工藝進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，只是僅改變了單體在丙酮中的濃度。結(jié)果列于下述表2中表2
結(jié)果顯示，隨著單體在有機(jī)相中濃度的提高，主要成分的分子量(Mp)和構(gòu)成毫微細(xì)粒的聚合物的平均分子量(Mw)有規(guī)律地增加。實(shí)施例4按實(shí)施例1～3所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，只是用非離子型表面活性劑Pluronic F68(BASF Corporation,USA)代替葡聚糖70保護(hù)膠體。
結(jié)果列于下述表3中。
表3
*單體在丙酮中的濃度為90mg/ml。
結(jié)果顯示，對(duì)于同樣的pH值條件-相對(duì)于保護(hù)膠體，在表面活性劑存在下，主要成分的分子量(Mp)和構(gòu)成毫微細(xì)粒的聚合物的平均分子量(Mw)增加，
-相對(duì)于保護(hù)膠體，在表面活性劑存在下，這些相同毫微細(xì)粒的大小減小。實(shí)施例5聚合介質(zhì)的摩爾濃度的研究按照實(shí)施例1的方法，將溶解在16.6ml丙酮中的500mg單體引入摩爾濃度增加的并進(jìn)一步含有0.5％Pluronic F68的磷酸鹽緩沖液(Na2HPO4/KH2PO4)中。
結(jié)果列于下述表4中表4
結(jié)果顯示，隨著介質(zhì)摩爾濃度的增加，構(gòu)成毫微細(xì)粒的聚合物的平均分子量(Mw)成比例地降低。實(shí)施例6按照實(shí)施例1～3的方法制備毫微細(xì)粒，并與按照Lescure等，Pharm.Res.1994.11,1270-1276所公開的方法制備的毫微細(xì)粒進(jìn)行比較。為此，向10ml pH值為5～8的磷酸鹽緩沖介質(zhì)中(Na2HPO4/KH2PO4,1/15M)，于攪拌下引入100mg單體。
結(jié)果列于下述表5中，其中任何分子量小于或等于約920的分子均定義為齊聚物。
表5
*存在聚集體**單體在丙酮中的濃度為90mg/ml結(jié)果顯示，對(duì)于任何相同pH值的實(shí)驗(yàn)條件-按照Lescure等制備的構(gòu)成毫微細(xì)粒的聚合物的平均分子量(Mw)，小于按照本發(fā)明方法所得的聚合物的平均分子量；-就本發(fā)明制備的毫微細(xì)粒而言，其中構(gòu)成聚合物的齊聚物(三聚物-四聚物)的含量明顯減少；-與按照Lescure等的方法相比，本發(fā)明方法的毫微細(xì)粒形式的聚合產(chǎn)率較高(就Lescure等的方法而言，在堿性條件下，聚集體的形成導(dǎo)致產(chǎn)率降低)。
凝膠滲透色譜圖2一方面(圖線A)表示按照本發(fā)明方法在pH值為7.5下制備的聚合物的分子量分布，另一方面表示按照Lescure等的方法制備的情形(圖線B)。除對(duì)應(yīng)于甲苯的峰3以外，在圖線A中，僅觀察到對(duì)應(yīng)于主要成分的單一峰1(Mp=40278)，而在圖線B中，還明顯地觀察到了對(duì)應(yīng)于齊聚物(三聚物和四聚物)的峰2的存在。實(shí)施例7將500mg已經(jīng)在25毫巴下解吸SO23小時(shí)的1-乙氧基羰基-1-乙氧基羰基亞甲基氧代羰基乙烯(Laboratoires UPSA/CARPIBEN,France)溶解在5.55ml丙酮中，然后向該5.55ml溶液中逐漸地并在磁力攪拌下加入50ml在pH值為5、6.5或8下緩沖的(Na2HPO4/KH2PO4,1/15M)、并含有0.5％Pluronic F68(BASF Corporation,USA)的含水介質(zhì)。在有機(jī)相全部引入后，對(duì)于pH值為5和6.5的實(shí)驗(yàn)，維持?jǐn)嚢?6小時(shí)，對(duì)于pH值為8的實(shí)驗(yàn)，維持?jǐn)嚢?0分鐘。然后將50ml含有2.5g葡萄糖或海藻糖(保護(hù)膠體或低溫保護(hù)劑)的去離子水加入到毫微細(xì)粒懸浮液中，并使該混合物在真空下蒸發(fā)，以除去丙酮并將含水懸浮液的體積減小至50ml。在濾紙(孔徑5～15μm)上進(jìn)行過(guò)濾后，將制劑進(jìn)行冷凍干燥。由激光散射測(cè)定含在濾液中的粒子的直徑。由凝膠滲透色譜法測(cè)得構(gòu)成粒子的聚合物基質(zhì)的亞甲基丙二酸酯的平均分子量(Mw)。
結(jié)果列于下述表6中，其中Mp為主要成分的分子量，Mw為聚合物的平均分子量。
通過(guò)引入反應(yīng)介質(zhì)中的單體的量與構(gòu)成毫微細(xì)粒的聚合物量的比值確定產(chǎn)率。
表6
實(shí)施例8不同溶劑的使用按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不同的是使用丙酮、乙腈或四氫呋喃(THF)作為單體的溶劑。
結(jié)果列于下述表7中。
表7
實(shí)施例9水/溶劑體積比的研究按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，只是改變水/丙酮的體積比。
結(jié)果列于下述表8中
表8
實(shí)施例10在pH值為10下進(jìn)行所述的方法實(shí)驗(yàn)或者在表面活性劑或者在保護(hù)膠體存在下，并且或者按照實(shí)施例1的方法或者按照實(shí)施例7的方法在pH=10的含水介質(zhì)中進(jìn)行。
1)實(shí)驗(yàn)1將100mg 1-乙氧基羰基-1-乙氧基羰基亞甲基氧代羰基乙烯單體溶解在1ml丙酮中。
然后逐漸地并在磁力攪拌下將該溶液加入到10ml pH=10并含有100mg葡聚糖70的含水介質(zhì)中。
立即發(fā)生聚合反應(yīng)。在全部有機(jī)相引入后維持?jǐn)嚢?0分鐘。然后向毫微細(xì)粒懸浮液中加入10ml去離子水，并將該混合物在真空下蒸發(fā)以除去丙酮。然后將介質(zhì)進(jìn)行離心分離(v=10000rpm,4℃下10分鐘)。
2)實(shí)驗(yàn)2實(shí)驗(yàn)過(guò)程與實(shí)驗(yàn)1的相同，只是用Pluronic F68代替葡聚糖70。
3)實(shí)驗(yàn)3向含有100mg單體和1ml丙酮的有機(jī)相中逐漸地并在磁力攪拌下加入10ml pH=10并含有100mg葡聚糖70的含水介質(zhì)。立即發(fā)生聚合反應(yīng)。在全部水相引入后維持?jǐn)嚢?0分鐘。然后向毫微細(xì)粒懸浮液中加入10ml去離子水，并將該混合物在真空下蒸發(fā)以除去丙酮。然后將介質(zhì)進(jìn)行離心分離(v=10000rpm,4℃下10分鐘)。
4)實(shí)驗(yàn)4實(shí)驗(yàn)過(guò)程與實(shí)驗(yàn)3相同，只是用Pluronic F68代替葡聚糖70。離心分離后，用空間排阻色譜法對(duì)含在沉淀中的毫微細(xì)粒進(jìn)行分析，以測(cè)定它們的重均分子量(Mw)。結(jié)果列于下述表9中。
表9
實(shí)施例11按照實(shí)施例1所述的聚合工藝進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但僅使用1,1-丙氧基羰基乙烯(Laboratoires UPSA/CARPIBEN,France)(以下稱為MM3.3),或使用它與1-乙氧基羰基-1-乙氧基羰基亞甲基氧代羰基乙烯單體(Laboratoires UPSA/CARPIBEM,France)(以下稱為MM2.1.2)的混合物。結(jié)果列于下述表10中，其中Mp為主要成分的分子量，Mw為聚合物的平均分子量。
表10
實(shí)施例12制備含利福平的毫微細(xì)粒在1ml丙酮中溶解5mg利福平基質(zhì)(Sigma)，并向其中加入90mg事先在25毫巴下解吸SO23小時(shí)的1-乙氧基羰基-1-乙氧基羰基亞甲基氧代羰基乙烯單體(Laboratoires UPSA/CARPIBEM,France)。然后用移液管將該溶液逐漸地并在恒定的攪拌下(750rpm)加入到9ml用磷酸鹽緩沖劑(Na2HPO4/KH2PO4,0.066M)在pH值為6.0下緩沖的、并含有90mg葡聚糖70(1％w/v)的含水介質(zhì)中。20℃下聚合18小時(shí)后，攪拌下將9ml含5％右旋-葡萄糖的去離子水加入到毫微細(xì)粒懸浮液中，然后將該混合物用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(20℃,25毫巴)在真空下蒸發(fā)，以除去丙酮并使含水懸浮液的體積減小至9ml。然后將該制劑冷凍干燥；冷凍在-30℃下進(jìn)行，20℃、0.05毫巴下進(jìn)行升華36小時(shí)。
在冷凍干燥之前和之后測(cè)定毫微細(xì)粒的大小及利福平的濃度。用激光散射測(cè)定大小。用高效液相色譜和分光光度計(jì)聯(lián)用測(cè)定利福平含量。移動(dòng)相含甲醇/0.05M乙酸銨(65∶35)的混合物，調(diào)節(jié)pH值為7.3，流速設(shè)定在1ml/min，并在254nm處讀取吸收值。在毫微細(xì)粒懸浮液(80000g,4℃下1小時(shí))的超離心作用后得到的上層清液中，測(cè)定不與毫微細(xì)粒連接的利福平的含量。與毫微細(xì)粒相連接的利福平的量對(duì)應(yīng)于沉淀中的部分，該部分在進(jìn)行直接的利福平含量測(cè)定之前溶解于THF中。
得到下述結(jié)果-含利福平的毫微細(xì)粒的大小冷凍干燥之前為266±63nm，在冷凍干燥之后為282±54nm；-利福平的結(jié)合百分?jǐn)?shù)在冷凍干燥之前和之后為8.5±0.5％。實(shí)施例13制備含粘菌素的毫微細(xì)粒以與實(shí)施例12相同的方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所不同的是活性成分是水溶性的，它是在加入有機(jī)相之前、以0.5mg/ml的濃度并入到聚合介質(zhì)中的。
蒸發(fā)后由激光散射測(cè)定的含粘菌素的毫微細(xì)粒的大小為282±65nm，在4℃下保存4天后其大小為283±26nm。按照半乳聚糖擴(kuò)散技術(shù)(S.P.Gotoff等，Antimicrob.Agents Chemother,1962,107-113)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)粘菌素在毫微細(xì)粒懸浮液進(jìn)行超離心作用(80000g,4℃下1小時(shí))之后得到的上層清液中的濃度為15μg/ml然后測(cè)定不與毫微細(xì)粒連接的部分，該值為加入的粘菌素總量的3％。實(shí)施例14含疊氮胸苷(AZT)(Sigma Aldrich Chimie,France)的毫微細(xì)粒的制備將240mg已在25毫巴下解吸SO23小時(shí)的1-乙氧基羰基-1-乙氧基羰基亞甲基氧代羰基乙烯單體(Laboratoires UPSA/CARPIBEN,France)溶解于2.5ml丙酮中。然后用移液管將該溶液逐漸地并在恒定的攪拌下加入到22.5ml用磷酸鹽緩沖劑(Na2HPO4/KH2PO4.0.066M)在pH值為8.0下緩沖的、并含有225mg葡聚糖70(1％w/v)及濃度為0.53mg/ml的水溶性活性成分的含水介質(zhì)中。20℃下聚合18小時(shí)后，攪拌下將22.5ml含5％右旋-葡萄糖的去離子水加入到毫微細(xì)粒懸浮液中，然后將該混合物用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(20℃,25毫巴)在真空下蒸發(fā)，以除去丙酮并使含水懸浮液的體積減小至39.0ml。然后將該制劑冷凍干燥；冷凍在-30℃下進(jìn)行，20℃、0.05毫巴下進(jìn)行升華36小時(shí)。
冷凍干燥前由激光散射測(cè)定的含AZT的毫微細(xì)粒的大小為255±63nm。用紫外分光光度計(jì)在266nm處測(cè)定在毫微細(xì)粒懸浮液進(jìn)行離心作用(12000rpm,4℃下1小時(shí))之后得到的上層清液中AZT的濃度。測(cè)定的濃度為98μg/ml因此不與毫微細(xì)粒連接的部分為加入的AZT總量的31.9％。因此與毫微細(xì)粒連接的AZT部分為68.1％。實(shí)施例15制備含磷酸肌酸(Boehringer Mannheim)的毫微細(xì)粒按照實(shí)施例14的工藝進(jìn)行磷酸肌酸的膠囊化。在冷凍干燥之前用激光散射測(cè)得含磷酸肌酸的毫微細(xì)粒的大小為275±260nm。用高效液相色譜聯(lián)用分光光度計(jì)進(jìn)行磷酸肌酸的測(cè)定。移動(dòng)相含有磷酸鹽緩沖劑(KH2PO4,0.05M)，調(diào)節(jié)pH值為3.3。流速設(shè)定為2ml/min，在200nm處讀取吸收值。
在毫微細(xì)粒懸浮液進(jìn)行離心作用(12000rpm,4℃下1小時(shí))之后得到的上層清液中測(cè)定不與毫微細(xì)粒關(guān)聯(lián)的磷酸肌酸的含量。發(fā)現(xiàn)磷酸肌酸在上層清液中的濃度為463μg/ml因此不與毫微細(xì)粒連接的部分為加入的磷酸肌酸總量的81％。因此與毫微細(xì)粒連接的磷酸肌酸部分為19％。實(shí)施例16制備含5-氟尿嘧啶(5-FU)的毫微細(xì)粒按照實(shí)施例14的工藝進(jìn)行5-FU(Sigma Aldrich Chimie,France)的膠囊化。在冷凍干燥之前用激光散射測(cè)得含5-FU的毫微細(xì)粒的大小為516±88nm。由紫外分光光度計(jì)在266nm處測(cè)定，發(fā)現(xiàn)5-FU在毫微細(xì)粒懸浮液進(jìn)行離心作用(12000rpm,4℃下1小時(shí))之后得到的上層清液中的濃度為70μg/ml因此不與毫微細(xì)粒連接的部分為加入的5-FU總量的23.3％。因此與毫微細(xì)粒連接的5-Fu部分為76.7％。
權(quán)利要求
1．一種制備由至少一種通式(Ⅰ)的化合物的無(wú)規(guī)聚合物形成的毫微細(xì)粒的方法，
(Ⅰ)其中A表示
基團(tuán)或
基團(tuán)；R1和R2相同或不同地表示一線性或支化的C1～C6烷基；n=1,2,3,4或5；其特征在于一種或多種單體在聚合之前溶解在水可混溶的質(zhì)子惰性有機(jī)溶劑中，該有機(jī)溶劑與聚合介質(zhì)形成對(duì)形成的聚合物是非溶劑的混合物。
2．權(quán)利要求1的制備由通式(Ⅰ)的一種化合物的聚合物形成的毫微細(xì)粒的方法，
其中A表示
基團(tuán)或
基團(tuán)；R1和R2相同或不同地表示一線性或支化的C1～C6烷基；n=1,2,3,4或5；其特征在于這種單體在聚合之前溶解在水可混溶的質(zhì)子惰性有機(jī)溶劑中，該有機(jī)溶劑與聚合介質(zhì)形成對(duì)形成的聚合物是非溶劑的混合物。
3．權(quán)利要求1或2的制備毫微細(xì)粒的方法，其中該毫微細(xì)粒的直徑小于500nm，優(yōu)選100～500nm，其平均分子量Mw為約1000～100000,特別是約1000～80000，尤其是約2000～80000，優(yōu)選約8000～80000。
4．權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法，其特征在于包括如下步驟-制備至少一種通式(Ⅰ)的化合物在一水可混溶的質(zhì)子惰性有機(jī)溶劑中的溶液，-在pH值為4.5～10下在攪拌下在該有機(jī)相中加入含水聚合介質(zhì)，-在均化該混合物并在真空下蒸發(fā)掉有機(jī)溶劑后回收如此獲得的毫微細(xì)粒。
5．權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法，其特征在于包括如下步驟-制備至少一種通式(Ⅰ)的化合物在一水可混溶的質(zhì)子惰性有機(jī)溶劑中的溶液，-在pH值為4.5～10下，在攪拌下向該有機(jī)相中加入含水聚合介質(zhì)，-在均化該混合物并在真空下蒸發(fā)掉有機(jī)溶劑后回收如此獲得的毫微細(xì)粒。
6．權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法，其特征在于質(zhì)子惰性有機(jī)溶劑選自丙酮，乙腈，二噁烷和四氫呋喃。
7．權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其特征在于通式(Ⅰ)的化合物在有機(jī)溶劑中的濃度約為30mg/ml～150mg/ml。
8．權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的方法，其特征在于聚合介質(zhì)的摩爾濃度為1/30M～1/3M。
9．權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的方法，其特征在于聚合介質(zhì)含有一種或多種表面活性劑或保護(hù)膠體。
10．權(quán)利要求9的方法，其特征在于表面活性劑為選自聚氧化亞乙基和聚氧化亞丙基的共聚物，poloxamers和多乙氧基醚的非離子型表面活性劑。
11．權(quán)利要求9或10中任一項(xiàng)的方法，其特征在于保護(hù)膠體選自葡聚糖，水可溶的纖維素衍生物，聚乙二醇和聚乙烯醇。
12．權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)任一項(xiàng)的方法，其特征在于有機(jī)相或聚合介質(zhì)含有一種或多種生物活性分子。
13．權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)任一項(xiàng)的方法，其特征在于聚合的化合物為通式(Ⅰ)的化合物，其中A表示
基團(tuán)，n=1,R1=R2=乙基。
14．權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的方法，其特征在于聚合的化合物為通式(Ⅰ)的化合物，其中A表示
基團(tuán)，R1=R2=丙基。
15．權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的方法，其特征在于其中A表示如權(quán)利要求1所定義的
基團(tuán)或
基團(tuán)的化合物(Ⅰ)的混合物進(jìn)行無(wú)規(guī)聚合。
16．由權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)的方法獲得的毫微細(xì)粒，該毫微細(xì)粒由至少一種通式(Ⅰ)的亞甲基丙二酸酯化合物的無(wú)規(guī)聚合物形成，
其中A表示
基團(tuán)或
基團(tuán)；R1和R2相同或不同地表示一線性或支化的C1～C6烷基；n=1,2,3,4或5，該毫微細(xì)粒的直徑小于500nm，優(yōu)選100～500nm，其平均分子量Mw為約1000～100000，特別是約1000～80000，尤其是約2000～80000，優(yōu)選約8000～80000。
17．由權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)的方法獲得的毫微細(xì)粒，該毫微細(xì)粒由一種通式(Ⅰ)的亞甲基丙二酸酯化合物的聚合物形成，
其中A表示
基團(tuán)或
基團(tuán)；R1和R2相同或不同地表示一線性或支化的C1～C6烷基；n=1,2,3,4或5，該毫微細(xì)粒的直徑小于500nm，優(yōu)選100～500nm，其平均分子量Mw為約1000～80000，尤其是約2000～80000，優(yōu)選約8000～80000。
18．由至少一種通式(Ⅰ)的化合物的無(wú)規(guī)聚合物形成的毫微細(xì)粒，
其中A表示
基團(tuán)或
基團(tuán)；R1和R2相同或不X同地表示一線性或支化的C1-C6烷基；n=1,2,3,4或5，該毫微細(xì)粒的直徑小于500nm，優(yōu)選100～500nm，其平均分子量Mw為約8000～100000，優(yōu)選約8000～80000。
19．由通式(Ⅰ)的一種化合物的聚合物形成的毫微細(xì)粒，
其中A表示
基團(tuán)或
基團(tuán)；R1和R2相同或不同地表示一線性或支化的C1～C6烷基；n=1,2,3,4或5，該毫微細(xì)粒的直徑小于500nm，優(yōu)選100～500nm，其平均分子量Mw為約8000～80000。
20．權(quán)利要求18或19中任一項(xiàng)的毫微細(xì)粒，由通式(Ⅰ)的一種化合物的聚合物形成，其中A表示
基團(tuán)，n=1,R1=R2=乙基。
21．權(quán)利要求18或19中任一項(xiàng)的毫微細(xì)粒，由通式(Ⅰ)的一種化合物的聚合物形成，其中A表示
基團(tuán)，R1=R2=丙基。
22．權(quán)利要求16至21中任一項(xiàng)的毫微細(xì)粒，其特征在于它們含有一種或多種生物活性分子。
23．含有與可藥用賦形劑結(jié)合的作為活性成分的權(quán)利要求22的毫微細(xì)粒藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備由至少一種通式(Ⅰ)的化合物的無(wú)規(guī)聚合物形成的毫微細(xì)粒的方法，其中A表示基團(tuán)(a)或基團(tuán)(b)；R
文檔編號(hào)A61K31/513GK1237903SQ97199824
公開日1999年12月8日 申請(qǐng)日期1997年10月24日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月25日
發(fā)明者N·布魯－馬格尼茨, X·古爾隆, P·布里頓, P·庫(kù)威里爾, F·里斯庫(kù)雷, C·魯克斯－卡美斯, G·里伊斯 申請(qǐng)人:維赫索拉公司